Name: genome-wide analysis of histone modifications distribution using the chromatin immunoprecipitation sequencing method in magnaporthe oryzae
Uploaded: 2021-06-02T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° 31871638), le projet spécial de recherche scientifique de l’Université d’agriculture de Beijing (YQ201603), le projet scientifique du Comité éducatif de Beijing (KM201610020005), le projet de culture de recherche scientifique de haut niveau de BUA (GJB2021005).

1. Préparation de protoplastes de M. oryzae
<ol><li>Préparez la gélose à l’avoine-tomate (OTA).<ol>
<li>Peser 30-50 g de flocons d’avoine et les faire bouillir dans 800 mL d’eau (ddH2O) pendant 20 min. Filtrer à travers deux couches de gaze et prendre le filtrat.</li>
		<li>Cueillez des tomates mûres et pelez-les. Presser le jus et filtrer à travers deux couches de gaze pour recueillir 150 mL du jus filtré.</li>
		<li>Mélanger soigneusement tout le jus de tomate et le filtrat d’avoi...

<ol>
	<li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+structure:+are+repeating+unit+of+histones+and+DNA.">Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184 (4139), 868-871 (1974).</li><li>Luger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosomecore+particle+at+2.8+a+resolution.">Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Strathl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li><li>Lachner, M., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+histone+lysine+methylation.">The many faces of histone lysine methylation.</a> Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).</li><li>Bhaumik, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+modifications+of+histones+during+development+and+disease+pathogenesis.">Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).</li><li>Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+implementation+and+physiological+roles+for+histone+H3+lysine+4+(H3K4)+methylation.">Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).</li><li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription.">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).</li><li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+epigenome.">The mammalian epigenome.</a> Cell. 128 (4), 669-681 (2007).</li><li>Weake, V. M., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+ubiquitination:+triggering+gene+activity.">Histone ubiquitination: triggering gene activity.</a> Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).</li><li>Workman, J. L., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+nucleosome+structure+as+a+mechanism+of+transcriptional+regulation.">Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li><li>Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+from+limited+starting+material+of+K562+cells+and+Drosophila+neuroblasts+using+tagmentation+assisted+fragmentation+approach.">ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach.</a> Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).</li><li>Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+comparison+of+tools+of+differential+ChIP-seq+analysis.">A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).</li><li>Kieu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MoSET1+(histone+H3K4+methyltransferase+in+Magnaporthe+oryzae)+regulates+global+gene+expression+during+infection-related+morphogenesis.">MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis.</a> Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).</li><li>Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-induced+transcriptional+activation+of+the+MoCel7C+cellulase+gene+is+associated+with+methylation+of+histone+H3+at+lysine+4+in+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).</li><li>Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+trail+of+a+cereal+killer:+recent+advances+in+Fusarium+graminearum+pathogenomics+and+host+resistance.">On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).</li><li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMT1+arginine+methyltransferase+gene+is+important+for+plant+infection+and+normal+hyphal+growth+in+Fusarium+graminearum.">The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum.</a> PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3K4+methylation+regulates+hyphal+growth,+secondary+metabolism+and+multiple+stress+responses+in+Fusarium+graminearum.">Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum.</a> Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+infection+test:+spray+and+wound-mediated+inoculation+with+the+plant+pathogen+Magnaporthe+grisea.">The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).</li><li>Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fusarium+graminearum+histone+H3K27+methyltransferase+KMT6+regulates+development+and+expression+of+secondary+metabolite+gene+clusters.">The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters.</a> PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).</li><li>Palmer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CclA,+required+for+histone+3+lysine+4+methylation,+decreases+growth+but+increases+secondary+metabolite+production+in+Aspergillus+fumigatus.">Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus.</a> PeerJ. 1, 4 (2013).</li><li>Ding, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tig1+histone+deacetylase+complex+regulates+infectious+growth+in+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).</li><li>Dean, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+grisea.">The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.</a> Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).</li><li>Allis, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+nomenclature+for+chromatin-modifying+enzymes.">New nomenclature for chromatin-modifying enzymes.</a> Cell. 131 (4), 633-636 (2007).</li><li>Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COMPASS+family+of+histone+H3K4+methylases:+mechanisms+of+regulation+in+development+and+disease+pathogenesis.">The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis.</a> Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).</li><li>Zhou, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COMPASS-like+complex+modulates+fungal+development+and+pathogenesis+by+regulating+H3K4me3-mediated+targeted+gene+expression+in+Magnaporthe+oryzae.">The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae.</a> Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).</li></ol>

Récemment, ChIP-seq est devenu une méthode d’analyse génomique largement utilisée pour déterminer les sites de liaison des TF ou des sites d’enrichissement modifiés par des histones spécifiques. Par rapport à la technologie ChIP-seq précédente, la nouvelle technologie ChIP-seq est très sensible et flexible. Les résultats sont fournis en haute résolution sans effets négatifs, tels que le signal de bruit causé par l’hybridation non spécifique des acides nucléiques. Bien qu’il s’agit d’une analy...

L’épigénétique est une branche de la recherche génétique qui fait référence au changement héréditaire de l’expression des gènes sans modifier la séquence nucléotidique des gènes. Un nombre croissant d’études ont montré que la régulation épigénétique joue un rôle important dans la croissance et le développement des cellules eucaryotes, y compris la chromatine qui régule et affecte l’expression des gènes par le processus dynamique de repliement et d’assemblage dans des structures d’ordre supérieur1,2. Le remodelage de la chromatine et la modification covalente des histones affectent et régulent la fonction et la structure de la chromatine par la variation des polymères de chromatine, atteignant ainsi la fonction de régulation del’expressiondes gènes3,4,5,6. Les modifications post-traductionnelles de l’histone comprennent l’acétylation, la phosphorylation, la méthylation, la monoubiquitination, la sumoylation et la ribosylation ADP7,8,9. La méthylation de l’histone H3K4, en particulier la triméthylation, a été mappée aux sites de départ de la transcription où elle est associée à la réplication de la transcription, à la recombinaison, à la réparation et au traitement de l’ARN chez les eucaryotes10,11.
La technologie ChIP-seq a été introduite en 2007 et est devenue la norme expérimentale pour l’analyse à l’échelle du génome de la régulation transcriptionnelle et des mécanismes épigénétiques12,13. Cette méthode convient à l’échelle du génome et permet d’obtenir des informations sur l’interaction des histones ou des facteurs de transcription, y compris des segments d’ADN de protéines de liaison à l’ADN. Toute séquence d’ADN réticulée à des protéines d’intérêt coprécipitera dans le cadre du complexe chromatine. Des techniques de séquençage de nouvelle génération sont également utilisées pour séquencer 36 à 100 bp d’ADN, qui sont ensuite appariés au génome cible correspondant.
Chez les champignons phytopathogènes, la recherche a récemment commencé à étudier comment les modifications de la méthylation des histones régulent leurs gènes cibles dans le processus de pathogénicité. Certaines études antérieures ont prouvé que la régulation des gènes liés à l’histone méthylase se reflète principalement dans le silençage génique et la catalyse de la production de métabolites secondaires (SM). MoSet1 est la méthylase H3K4 dans M. oryzae. L’élimination de ce gène entraîne la délétion complète de la modification H3K4me314. Par rapport à la souche de type sauvage, l’expression du gène MoCEL7C dans le mutant est inhibée à l’état induit par le CMC et à l’état non induit (glucose ou cellobiose), l’expression du MoCEL7C augmentéede 15. Dans Fusarium graminearum,KMT6 peut catalyser la modification de la méthylation de H3K27me3, réguler le développement normal des champignons et aider à réguler le « génome cryptique » contenant le groupe de gènes SM16,17,18,19. En 2013, Connolly a rapporté que la méthylation H3K9 et H3K27 régule le processus pathogène des champignons par le biais de métabolites secondaires et de facteurs effecteurs qui régulent l’inhibition des gènes cibles20. Chez Aspergillus,la modification des histones H3K4me2 et H3K4me3 est liée à l’activation des gènes et joue un rôle important dans le contrôle de la régulation du niveau de chromatine des groupes de gènes SM21. Chez M. oryzae,Tig1 (homologue à Tig1 chez les levures et les mammifères) est un HADC (histone désacétylase)22. L’élimination du gène Tig1 entraîne la perte complète de la pathogénicité et de la capacité de production de spores chez le mutant nul. Il est plus sensible à un environnement peroxygénique, qui ne peut pas produire d’hyphes infectieux22.
L’explosion de riz causée par M. oryzae. est l’une des maladies du riz les plus graves dans la plupart des régions rizicoles du monde19. En raison de son processus d’infection représentatif, M. oryzae est similaire au processus d’infection de nombreux champignons pathogènes importants. Comme il peut facilement effectuer des opérations de génétique moléculaire, le champignon est devenu un organisme modèle pour l’étude des interactions fongiques-végétales23. Le blocage de chaque étape du processus d’infection de M. oryzae peut entraîner une infection infructueuse. Les changements morphologiques au cours du processus d’infection sont strictement régulés par l’ensemble de la fonction du génome et la transcription des gènes. Parmi eux, les modifications épigénétiques telles que la méthylation des histones jouent un rôle essentiel dans la régulation transcriptionnelle des gènes fonctionnels24,25. Cependant, jusqu’à présent, peu d’études ont été réalisées sur le mécanisme moléculaire des modifications épigénétiques telles que la méthylation des histones et l’acétylation des histones dans la transcription des gènes de pathogenèse chez M. oryzae. Par conséquent, le développement du mécanisme de régulation épigénétique du champignon de l’explosion du riz tout en recherchant le réseau de régulation en amont et en aval de ces gènes pathogènes aidera à développer des stratégies de prévention et de contrôle de l’explosion du riz.
Avec le développement de la génomique fonctionnelle telle que ChIP-seq, en particulier en épigénétique, cette méthode d’acquisition de données à haut débit a accéléré la recherche sur les chromosomes. En utilisant la technologie expérimentale ChIP-seq, la distribution à l’échelle du génome de la méthylation des histones (telles que H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) chez M. oryzae et d’autres champignons filamenteux peut être identifiée. Par conséquent, cette méthode peut aider à élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents à la façon dont les modifications épigénétiques régulent leurs gènes cibles candidats au cours de la pathogenèse fongique en pathologie végétale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acidic casein hydrolysate</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>65072-00-6</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar powder</td>
			<td>scientan</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholic acid</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>83-44-3</td>
			<td>protein and dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA End-Repair kit</td>
			<td>NovoBiotec</td>
			<td>ER81050</td>
			<td>Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>no.100.02D</td>
			<td>Binding target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB buffer</td>
			<td>JIMEI</td>
			<td>JC2174</td>
			<td>Membrane and liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9912</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzymatic casein hydrolysate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91079-40-2</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycogen</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>Precipitant action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K4me3 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8580</td>
			<td>Immune response to H3K4me3 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illumina Genome Analyzer</td>
			<td>illumina</td>
			<td>illumina Hiseq 2000</td>
			<td>Large configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina PCR primers</td>
			<td>illumina</td>
			<td>CleanPlex</td>
			<td>Random universal primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoamyl alcohol</td>
			<td>chemical book</td>
			<td>30899-19-5</td>
			<td>Purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9480</td>
			<td>specific removal RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysing enzymes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1412-10G</td>
			<td>cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>36111ES10</td>
			<td>Animal normal immunoglobulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Seebio</td>
			<td>SH30173.08*</td>
			<td>preparation of protein complex eluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85124</td>
			<td>cell lysate to promote cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>The purification procedure removes primers from DNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A32965</td>
			<td>A protein inhibitor that decreases protein activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>DNA Extraction Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>9806S</td>
			<td>cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2271</td>
			<td>Purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9820</td>
			<td>cover up the charge differences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R1181</td>
			<td>Acetic acid buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium deoxycholate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89904</td>
			<td>inhibition of protease degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B69</td>
			<td>DNA ligase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td>buffer action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>HFH10</td>
			<td>keep the membrane protein stable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide analysis of histone modifications distribution using the chromatin immunoprecipitation sequencing method in magnaporthe oryzae

Le séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-seq) est une technique moléculaire puissante et largement utilisée pour cartographier les emplacements du génome entier des facteurs de transcription (TF), des régulateurs de chromatine et des modifications des histones, ainsi que pour détecter des génomes entiers pour découvrir des modèles de liaison TF et des modifications post-traductionnelles des histones. Les activités modifiant la chromatine, telles que la méthylation des histones, sont souvent recrutées dans des séquences de régulation géniques spécifiques, provoquant des changements localisés dans les structures de la chromatine et entraînant des effets transcriptionnels spécifiques. L’explosion de riz est une maladie fongique dévastatrice sur le riz dans le monde entier et est un système modèle pour l’étude de l’interaction champignon-plante. Cependant, les mécanismes moléculaires dans la façon dont les modifications des histones régulent leurs gènes de virulence dans Magnaporthe oryzae restent insaisissables. Plus de chercheurs doivent utiliser ChIP-seq pour étudier comment la modification épigénétique des histones régule leurs gènes cibles. ChIP-seq est également largement utilisé pour étudier l’interaction entre les protéines et l’ADN chez les animaux et les plantes, mais il est moins utilisé dans le domaine de la pathologie végétale et n’a pas été bien développé. Dans cet article, nous décrivons le processus expérimental et la méthode de fonctionnement de ChIP-seq pour identifier la distribution à l’échelle du génome de la méthylation des histones (comme H3K4me3) qui se lie aux gènes cibles fonctionnels de M. oryzae. Ici, nous présentons un protocole pour analyser la distribution à l’échelle du génome des modifications des histones, qui peut identifier de nouveaux gènes cibles dans la pathogenèse de M. oryzae et d’autres champignons filamenteux.

L’organigramme complet de la méthode ChIP-seq est illustré à la figure 1. Des expériences ChIP-seq ont été réalisées en utilisant des anticorps contre H3K4me3 dans la souche de type sauvage P131 et trois souches mutantes nulles dépourvues du gène mobre2, mospp1et moswd2 pour vérifier le profil pangénomique de la distribution de l’histone H3K4me3 chez M. oryzae. Les protoplastes de la souche de type sauvage, Δmobre2, Δmospp1</...

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Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Ici, nous présentons un protocole pour analyser la distribution à l’échelle du génome des modifications des histones, qui peut identifier de nouveaux gènes cibles dans la pathogenèse de M. oryzae et d’autres champignons filamenteux.

Analyse à l’échelle du génome de la distribution des modifications des histones à l’aide de la méthode de séquençage par immunoprécipitation de la chromatine dans Magnaporthe oryzae

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Cette méthode peut aider à élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents à la régulation des gènes cibles candidats via des modifications épigénétiques au cours de la pathogenèse fongique en pathologie végétale. La technologie de séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine peut détecter efficacement les segments d’ADN qui interagissent avec les histones et les facteurs de transcription dans l’ensemble du génome. Comparé à d’autres méthodes, il peut améliorer l’efficacité et la résolution.Commencez par ajouter 100 microlitres de milieu liquide complet aux assiettes Agger de tomates d’avoine à l’aide d’une pipette de 100 microlitres. À l’aide d’une boucle d’inoculation, grattez le mycélium de la souche de type sauvage et la souche knockout. Recueillir les débris de mycélium et les transférer dans 250 millilitres de milieu liquide complet.Laver les hyphes fongiques avec 500 millilitres de solution de chlorure de sodium à 0,7 molaire. Ensuite, collectez le mycélium fongique et pesez-le. Ajouter environ un millilitre de solution de perméation enzymatique de lyse par gramme de mycélium fongique.Placez les hyphes pour le léçage à 28 degrés Celsius pendant trois à quatre heures en secouant à 150 tr / min. Laver les hyphes poux avec 50 millilitres de solution de chlorure de sodium à 0,7 molaire. Centrifuger l’échantillon et jeter le surnageant avec soin.Re-suspendre le protoplaste dans 20 millilitres de solution de chlorure de sodium 0,7 molaire. Ajouter 55 microlitres de formaldéhyde à 37% goutte à goutte à deux millilitres de tampon de chlorure de sodium contenant des protoplastes pour la réticulation jusqu’à ce que la concentration finale soit de 1% Pour éteindre le formaldéhyde non réagi, ajouter 20 microlitres de 10 fois la glycine à chaque tube. Jeter soigneusement le surnageant après centrifugation.Re-suspendre la pastille dans un millilitre de solution de chlorure de sodium 0,7 molaire. Jetez soigneusement le surnageant après centrifugation et ressusquez la pastille dans 750 microlitres de tampon RIPA. Ajouter 37,5 microlitres de 20 fois l’inhibiteur de la protéase.Cisaillez la chromatine par sonication pendant huit minutes à l’aide d’un homogénéisateur à ultrasons. Une fois que l’échantillon a été brisé par ultrasons, retirez une partie de l’échantillon comme entrée contenant tout l’ADN et les protéines libérés après la sonique de l’échantillon. Pour analyser la longueur des fragments d’ADN, exécutez une électrophorèse sur gel d’agarose à 1% après la sonication.Après centrifugation, transférer le surnageant centrifugé dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre et le stocker à 80 degrés Celsius négatifs pour une utilisation ultérieure. Avant d’effectuer l’expérience IP, diluez chaque échantillon de chromatine dans un rapport de un à 10 avec un tampon RIPA d’une fois. Pipette 50 microlitres de billes de protéines super paramagnétiques dans un tube de centrifugeuse de deux millilitres.Placez les tubes sur un support magnétique et laissez les perles magnétiques précipiter. Retirez ensuite le surnageant. Ajouter un millilitre de tampon RIPA pré-refroidi une fois au tube et laver trois fois les billes de protéines super paramagnétiques.Placez les tubes sur un support magnétique et retirez le surnageant. Ajoutez 100 microlitres d’un tampon RIPA une fois à chaque tube. Ajouter 30 microlitres de l’échantillon de chromatine, 100 microlitres de perles de protéines super paramagnétiques et quatre microlitres d’anticorps H3K4me3 au tube, en les mélangeant bien.Placez les échantillons sur un agitateur rotatif pour les incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius à 30 fois G.Lavez l’anticorps de billes de protéine super paramagnétique et le complexe chromatine en resusmettant les perles dans un millilitre d’une fois le tampon RIPA. Lavez l’échantillon avec un millilitre de tampon de lavage complexe immunitaire à faible teneur en sel, puis avec un millilitre de tampon de lavage complexe immunitaire à haute teneur en sel. Rincez les billes avec un millilitre de tampon de chlorure de lithium et retirez le surnageant.Ajoutez ensuite un millilitre de tampon TE au tube. Replacez le tube avec un millilitre de tampon TE et retirez le surnageant avec une pipette. Ajouter 100 microlitres de tampon d’élution à chaque tube de centrifugeuse.Effectuez l’élution à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes. Centrifuger pendant une minute à 10 000 fois G à quatre degrés Celsius et recueillir le surnageant dans de nouveaux tubes de centrifugeuse. Ajouter huit microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires à tous les tubes et incuber à 65 degrés Celsius pendant quatre à cinq heures ou pendant la nuit pour inverser les liaisons croisées des protéines de l’ADN.Ajouter un microlitre de Rnase A et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ajouter quatre microlitres de protéinase K à chaque tube et incuber à 45 degrés Celsius pendant une à deux heures. Ajouter 550 microlitres du mélange de chloroforme fénal et d’alcool isoamylique dans le tube de centrifugeuse.Centrifuger pendant 15 minutes à 10 000 fois G et aspirer le surnageant. Ajouter 1/10 volume de solution d’acétate de sodium à trois molaires, 2,5 volumes d’éthanol absolu et trois microlitres de glycogène dans le tube. Placez l’échantillon dans un réfrigérateur à 20 degrés Celsius négatifs pendant la nuit pour les précipitations.Le lendemain, centrifugez les tubes et jetez le surnageant. Laver la pastille trois fois avec un millilitre d’éthanol 75% fraîchement préparé à 10 000 fois G.Ajouter 50 microlitres d’eau désionisée stérile pour dissoudre suffisamment le précipité. Réparez les extrémités de l’ADN pour générer de l’ADN émoussé à l’aide d’un kit de réparation de l’extrémité de l’ADN et des instructions mentionnées dans le manuscrit textuel.Pour ajouter une base d’adénine aux trois extrémités principales, ajoutez 30 microlitres d’ADN, deux microlitres d’eau, cinq microlitres de 10 fois le tampon Taq, 10 microlitres d’un dATP millimolaire et trois microlitres d’ADN polymérase Taq à un tube de centrifugeuse PCR de 0,2 microlitre. Mélangez-les et réagissez dans un appareil pcr à 72 degrés Celsius pendant 10 minutes. Effectuer la ligature de liaison en mélangeant 10 microlitres d’ADN, 9,9 microlitres d’eau, 2,5 microlitres de tampon d’ADN ligase T4, 0,1 microlitre de mélange oligo d’adaptateur et 2,5 microlitres d’ADN ligase T4 dans un tube de centrifugeuse PCR de 0,2 microlitre.Incuber le tube à 16 degrés Celsius pendant quatre heures. Pour amplifier l’ADN à l’aide d’amorces PCR, ajoutez 10,5 microlitres d’ADN, 12,5 microlitres de mélange maître deux fois haute fidélité. un microlitre d’apprêt PCR PE 1.0 et un microlitre d’apprêt PCR PE 2.0 à un tube centrifuge PCR PCR de 0,2 microlitre et bien mélanger.Les signaux H3K4me3 des mutants de délétion mobre2, mospp1 et moswd2 ont été significativement diminués dans ses régions cibles fonctionnelles. Par rapport à la souche de type sauvage P131, les signaux des lectures enrichies de séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine H3K4me3 chez les mutants de délétion mobre2, mospp1 et moswd2 ont été largement diminués. En suivant cette procédure, puce sur puce et puce qPCR peuvent être effectués.Ils sont généralement utilisés pour dépister le gène cible en aval d’une protéine et étudier les interactions de l’ADN protéique sur des sites de liaison au génome connus.

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Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Unit 1

Structure and Organization of DNA

SCIENTISTS IN ACTION

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Détermination de l&#39;échelle du génome de Timing de réplication mammalienne par l&#39;ADN Mesure Contenu

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