Name: genome-wide analysis of histone modifications distribution using the chromatin immunoprecipitation sequencing method in magnaporthe oryzae
Uploaded: 2021-06-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant no. 31871638), dallo Special Scientific Research Project della Beijing Agriculture University (YQ201603), dal Scientific Project of Beijing Educational Committee (KM201610020005), dal progetto di coltivazione di ricerca scientifica di alto livello di BUA (GJB2021005).

1. Preparazione di protoplasti da M. oryzae
<ol><li>Preparare l'agar farina d'avena-pomodoro (OTA).<ol>
<li>Pesare 30-50 g di farina d'avena e farlo bollire in 800 ml di acqua (ddH2O) per 20 minuti. Filtrare attraverso due strati di garza e prendere il filtrato.</li>
		<li>Raccogli i pomodori maturi e sbucciali. Spremere il succo e filtrare attraverso due strati di garza per raccogliere 150 ml di succo filtrato.</li>
		<li>Mescolare accuratamente tutto il succo di pomodoro e il filtrato d'avena prep...

<ol>
	<li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+structure:+are+repeating+unit+of+histones+and+DNA.">Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184 (4139), 868-871 (1974).</li><li>Luger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosomecore+particle+at+2.8+a+resolution.">Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Strathl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li><li>Lachner, M., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+histone+lysine+methylation.">The many faces of histone lysine methylation.</a> Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).</li><li>Bhaumik, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+modifications+of+histones+during+development+and+disease+pathogenesis.">Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).</li><li>Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+implementation+and+physiological+roles+for+histone+H3+lysine+4+(H3K4)+methylation.">Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).</li><li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription.">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).</li><li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+epigenome.">The mammalian epigenome.</a> Cell. 128 (4), 669-681 (2007).</li><li>Weake, V. M., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+ubiquitination:+triggering+gene+activity.">Histone ubiquitination: triggering gene activity.</a> Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).</li><li>Workman, J. L., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+nucleosome+structure+as+a+mechanism+of+transcriptional+regulation.">Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li><li>Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+from+limited+starting+material+of+K562+cells+and+Drosophila+neuroblasts+using+tagmentation+assisted+fragmentation+approach.">ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach.</a> Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).</li><li>Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+comparison+of+tools+of+differential+ChIP-seq+analysis.">A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).</li><li>Kieu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MoSET1+(histone+H3K4+methyltransferase+in+Magnaporthe+oryzae)+regulates+global+gene+expression+during+infection-related+morphogenesis.">MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis.</a> Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).</li><li>Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-induced+transcriptional+activation+of+the+MoCel7C+cellulase+gene+is+associated+with+methylation+of+histone+H3+at+lysine+4+in+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).</li><li>Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+trail+of+a+cereal+killer:+recent+advances+in+Fusarium+graminearum+pathogenomics+and+host+resistance.">On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).</li><li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMT1+arginine+methyltransferase+gene+is+important+for+plant+infection+and+normal+hyphal+growth+in+Fusarium+graminearum.">The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum.</a> PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3K4+methylation+regulates+hyphal+growth,+secondary+metabolism+and+multiple+stress+responses+in+Fusarium+graminearum.">Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum.</a> Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+infection+test:+spray+and+wound-mediated+inoculation+with+the+plant+pathogen+Magnaporthe+grisea.">The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).</li><li>Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fusarium+graminearum+histone+H3K27+methyltransferase+KMT6+regulates+development+and+expression+of+secondary+metabolite+gene+clusters.">The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters.</a> PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).</li><li>Palmer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CclA,+required+for+histone+3+lysine+4+methylation,+decreases+growth+but+increases+secondary+metabolite+production+in+Aspergillus+fumigatus.">Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus.</a> PeerJ. 1, 4 (2013).</li><li>Ding, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tig1+histone+deacetylase+complex+regulates+infectious+growth+in+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).</li><li>Dean, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+grisea.">The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.</a> Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).</li><li>Allis, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+nomenclature+for+chromatin-modifying+enzymes.">New nomenclature for chromatin-modifying enzymes.</a> Cell. 131 (4), 633-636 (2007).</li><li>Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COMPASS+family+of+histone+H3K4+methylases:+mechanisms+of+regulation+in+development+and+disease+pathogenesis.">The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis.</a> Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).</li><li>Zhou, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COMPASS-like+complex+modulates+fungal+development+and+pathogenesis+by+regulating+H3K4me3-mediated+targeted+gene+expression+in+Magnaporthe+oryzae.">The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae.</a> Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).</li></ol>

Recentemente, ChIP-seq è diventato un metodo di analisi genomica ampiamente utilizzato per determinare i siti di legame di TF o siti di arricchimento modificati da istoni specifici. Rispetto alla precedente tecnologia ChIP-seq, la nuova tecnologia ChIP-seq è altamente sensibile e flessibile. I risultati sono forniti in alta risoluzione senza effetti negativi, come il segnale di rumore causato dall'ibridazione non specifica degli acidi nucleici. Sebbene si tratta di un'analisi comune dell'espressione genica, molti metod...

L'epigenetica è una branca della ricerca genetica che si riferisce al cambiamento ereditario dell'espressione genica senza modificare la sequenza nucleotidica dei geni. Un numero crescente di studi ha dimostrato che la regolazione epigenetica svolge un ruolo importante nella crescita e nello sviluppo delle cellule eucariotiche, compresa la cromatina che regola e influenza l'espressione genica attraverso il processo dinamico di ripiegamento e assemblaggio in strutture di ordine superiore1,2. Il rimodellamento della cromatina e la modificazione degli istoni covalenti influenzano e regolano la funzione e la struttura della cromatina attraverso la variazione dei polimeri di cromatina, ottenendo così la funzione di regolazione dell'espressionegenica 3,4,5,6. Le modificazioni post-traduzionali degli istoni includono acetilazione, fosforilazione, metilazione, monoubiquitinazione, sumoilazione e ribosilazione ADP7,8,9. La metilazione dell'istone H3K4, in particolare la trimetilazione, è stata mappata nei siti di inizio della trascrizione in cui è associata alla replicazione della trascrizione, alla ricombinazione, alla riparazione e all'elaborazione dell'RNA negli eucarioti10,11.
La tecnologia ChIP-seq è stata introdotta nel 2007 ed è diventata lo standard sperimentale per l'analisi genome-wide della regolazione trascrizionale e dei meccanismi epigenetici12,13. Questo metodo è adatto a livello di genoma e per ottenere informazioni sull'interazione tra istoni o fattori di trascrizione, compresi i segmenti di DNA delle proteine leganti il DNA. Qualsiasi sequenza di DNA reticolata a proteine di interesse coprecipita come parte del complesso della cromatina. Le tecniche di sequenziamento di nuova generazione vengono utilizzate anche per sequenziare 36-100 bp di DNA, che vengono poi abbinati al genoma bersaglio corrispondente.
Nei funghi fitopatogeni, la ricerca ha recentemente iniziato a studiare come le modificazioni della metilazione degli istoni regolano i loro geni bersaglio nel processo di patogenicità. Alcuni studi precedenti hanno dimostrato che la regolazione dei geni correlati all'istone metilasi si riflette principalmente nel silenziamento genico e nella catalizzazione della produzione di metaboliti secondari (SM). MoSet1 è la metilasi H3K4 in M. oryzae. Il knockout di questo gene provoca la delezione completa della modifica H3K4me314. Rispetto al ceppo wild-type, l'espressione del gene MoCEL7C nel mutante è inibita nello stato indotto da CMC e nello stato non indotto (glucosio o cellobiosio), l'espressione di MoCEL7C è aumentatadi 15. In Fusarium graminearum,KMT6 può catalizzare la modificazione della metilazione di H3K27me3, regolare il normale sviluppo dei funghi e aiutare a regolare il "genoma criptico" contenente il cluster di geni SM16,17,18,19. Nel 2013, Connolly ha riferito che la metilazione H3K9 e H3K27 regola il processo patogeno dei funghi attraverso metaboliti secondari e fattori effettori che regolano l'inibizione dei geni bersaglio20. In Aspergillus, la modifica degli istoni H3K4me2 e H3K4me3 è correlata all'attivazione genica e svolge un ruolo importante nel controllo della regolazione del livello di cromatina dei cluster genici SM21. In M. oryzae, Tig1 (omologo a Tig1 in lieviti e mammiferi) è un HADC (istone deacetilasi)22. Il knockout del gene Tig1 porta alla completa perdita di patogenicità e capacità di produzione di spore nel mutante nullo. È più sensibile a un ambiente perossigeno, che non può produrre ifeinfettive 22.
L'esplosione di riso causata da M. oryzae. è una delle più gravi malattie del riso nella maggior parte delle aree di coltivazione del riso nel mondo19. A causa del suo processo di infezione rappresentativo, M. oryzae è simile al processo di infezione di molti importanti funghi patogeni. Poiché può facilmente eseguire operazioni di genetica molecolare, il fungo è diventato un organismo modello per lo studio delle interazioni fungo-pianta23. Il blocco di ogni fase del processo di infezione di M. oryzae può causare un'infezione non riuscita. I cambiamenti morfologici durante il processo di infezione sono strettamente regolati dall'intera funzione del genoma e dalla trascrizione genica. Tra questi, le modificazioni epigenetiche come la metilazione degli istoni svolgono un ruolo essenziale nella regolazione trascrizionale dei geni funzionali24,25. Tuttavia, finora, sono stati condotti pochi studi sul meccanismo molecolare delle modificazioni epigenetiche come la metilazione degli istoni e l'acetilazione degli istoni nella trascrizione dei geni della patogenesi in M. oryzae. Pertanto, l'ulteriore sviluppo del meccanismo di regolazione epigenetica del fungo blasto del riso durante la ricerca sulla rete di regolazione a monte ea valle di questi geni patogeni aiuterà a sviluppare strategie di prevenzione e controllo dell'esplosione del riso.
Con lo sviluppo della genomica funzionale come ChIP-seq, specialmente in epigenetica, questo metodo di acquisizione dati ad alto rendimento ha accelerato la ricerca sui cromosomi. Utilizzando la tecnologia sperimentale ChIP-seq, è possibile identificare la distribuzione a livello di genoma della metilazione degli istoni (come H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) in M. oryzae e altri funghi filamentosi. Pertanto, questo metodo può aiutare a chiarire i meccanismi molecolari alla base del modo in cui le modificazioni epigenetiche regolano i loro geni bersaglio candidati durante la patogenesi fungina nella patologia vegetale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acidic casein hydrolysate</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>65072-00-6</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar powder</td>
			<td>scientan</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholic acid</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>83-44-3</td>
			<td>protein and dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA End-Repair kit</td>
			<td>NovoBiotec</td>
			<td>ER81050</td>
			<td>Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>no.100.02D</td>
			<td>Binding target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB buffer</td>
			<td>JIMEI</td>
			<td>JC2174</td>
			<td>Membrane and liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9912</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzymatic casein hydrolysate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91079-40-2</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycogen</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>Precipitant action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K4me3 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8580</td>
			<td>Immune response to H3K4me3 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illumina Genome Analyzer</td>
			<td>illumina</td>
			<td>illumina Hiseq 2000</td>
			<td>Large configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina PCR primers</td>
			<td>illumina</td>
			<td>CleanPlex</td>
			<td>Random universal primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoamyl alcohol</td>
			<td>chemical book</td>
			<td>30899-19-5</td>
			<td>Purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9480</td>
			<td>specific removal RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysing enzymes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1412-10G</td>
			<td>cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>36111ES10</td>
			<td>Animal normal immunoglobulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Seebio</td>
			<td>SH30173.08*</td>
			<td>preparation of protein complex eluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85124</td>
			<td>cell lysate to promote cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>The purification procedure removes primers from DNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A32965</td>
			<td>A protein inhibitor that decreases protein activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>DNA Extraction Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>9806S</td>
			<td>cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2271</td>
			<td>Purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9820</td>
			<td>cover up the charge differences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R1181</td>
			<td>Acetic acid buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium deoxycholate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89904</td>
			<td>inhibition of protease degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B69</td>
			<td>DNA ligase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td>buffer action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>HFH10</td>
			<td>keep the membrane protein stable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide analysis of histone modifications distribution using the chromatin immunoprecipitation sequencing method in magnaporthe oryzae

Il sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq) è una tecnica molecolare potente e ampiamente utilizzata per mappare le posizioni dell'intero genoma dei fattori di trascrizione (TF), dei regolatori della cromatina e delle modifiche istoniche, nonché per rilevare interi genomi per scoprire i modelli di legame TF e le modifiche post-traduzionali degli istoni. Le attività di modifica della cromatina, come la metilazione degli istoni, sono spesso reclutate in specifiche sequenze regolatorie geniche, causando cambiamenti localizzati nelle strutture della cromatina e con conseguenti effetti trascrizionali specifici. L'esplosione di riso è una malattia fungina devastante sul riso in tutto il mondo ed è un sistema modello per studiare l'interazione fungo-pianta. Tuttavia, i meccanismi molecolari nel modo in cui le modificazioni istoniche regolano i loro geni di virulenza in Magnaporthe oryzae rimangono sfuggenti. Più ricercatori devono utilizzare ChIP-seq per studiare come la modificazione epigenetica degli istoni regola i loro geni bersaglio. ChIP-seq è anche ampiamente usato per studiare l'interazione tra proteine e DNA negli animali e nelle piante, ma è meno utilizzato nel campo della patologia vegetale e non è stato ben sviluppato. In questo articolo, descriviamo il processo sperimentale e il metodo operativo di ChIP-seq per identificare la distribuzione a livello di genoma della metilazione degli istoni (come H3K4me3) che si lega ai geni bersaglio funzionali in M. oryzae. Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la distribuzione a livello di genoma delle modifiche istoniche, che può identificare nuovi geni bersaglio nella patogenesi di M. oryzae e altri funghi filamentosi.

L'intero diagramma di flusso del metodo ChIP-seq è mostrato nella Figura 1. Gli esperimenti ChIP-seq sono stati eseguiti utilizzando anticorpi contro H3K4me3 nel ceppo wild-type P131 e tre ceppi mutanti nulli privi di gene mobre2, mospp1e moswd2 per verificare l'intero profilo genome-wide della distribuzione dell'istone H3K4me3 in M. oryzae. I protoplasti del ceppo wild-type, Δmobre2, Δmospp1e Δmoswd2, sono stati preparati e ...

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Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la distribuzione a livello di genoma delle modifiche istoniche, che può identificare nuovi geni bersaglio nella patogenesi di M. oryzae e altri funghi filamentosi.

Analisi a livello di genoma della distribuzione delle modificazioni isoniche utilizzando il metodo di sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina in Magnaporthe oryzae

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Questo metodo può aiutare a chiarire i meccanismi molecolari alla base della regolazione dei geni bersaglio candidati attraverso modificazioni epigenetiche durante la patogenesi fungina nella patologia vegetale. La tecnologia di sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina può rilevare in modo efficiente i segmenti di DNA che interagiscono con gli istoni e i fattori di trascrizione nell'intero genoma. Rispetto ad altri metodi, può migliorare l'efficienza e la risoluzione.Inizia aggiungendo 100 microlitri di mezzo liquido completo ai piatti Agger di pomodoro di farina d'avena usando una pipetta da 100 microlitri. Usando un ciclo di inoculazione, raschiare i miceli del ceppo wild type e del ceppo knockout. Raccogliere i detriti miceli e trasferirli in 250 millilitri di mezzo liquido completo.Lavare le ife fungine con 500 millilitri di soluzione di cloruro di sodio molare 0,7. Quindi raccogliere il micelio fungino e pesarlo. Aggiungere circa un millilitro di soluzione di permeazione enzimatica di lisi per un grammo di micelio fungino.Posizionare le ife per la lezione a 28 gradi Celsius per tre o quattro ore con agitazione a 150 RPM. Lavare le ife a pidocchi con 50 millilitri di soluzione di cloruro di sodio molare 0,7. Centrifugare il campione ed eliminare accuratamente il surnatante.Sospendere di riconsegnare il protoplasto in 20 millilitri di soluzione di cloruro di sodio molare. Aggiungere 55 microlitri di formaldeide al 37% goccia a goccia a due millilitri di tampone di cloruro di sodio contenente protoplasti per reticolare fino a quando la concentrazione finale è dell'1%Per estinguere la formaldeide non reatta, aggiungere 20 microlitri di 10 volte glicina a ciascun tubo. Scartare accuratamente il surnatante dopo la centrifugazione.Sospendere di due anni il pellet in un millilitro di soluzione di cloruro di sodio molare. Scartare accuratamente il surnatante dopo la centrifugazione e sospendere di riconsegenza il pellet in 750 microlitri di tampone RIPA. Aggiungere 37,5 microlitri di 20 volte inibitore della proteasi.Tagliare la cromatina mediante sonicazione per otto minuti utilizzando un omogeneizzatore ad ultrasuoni. Dopo che il campione è stato rotto ad ultrasuoni, estrai una parte del campione come input contenente tutto il DNA e le proteine rilasciate dopo che il campione è stato sonicato. Per analizzare la lunghezza dei frammenti di DNA, eseguire un'elettroforesi su gel di agarose all'1% dopo la sonicazione.Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante centrifugato in un tubo centrifugato da 1,5 millilitro e conservarlo a 80 gradi Celsius negativi per un uso successivo. Prima di eseguire l'esperimento IP, diluire ogni campione di cromatina in un rapporto da uno a 10 con una volta tampone RIPA. Pipettare 50 microlitri di perle proteiche super paramagnetiche in un tubo centrifugo da due millilitri.Posizionare i tubi su un supporto magnetico e lasciare precipitare le perle magnetiche. Quindi rimuovere il surnatante. Aggiungere un millilitro di tampone RIPA pre-raffreddato una volta al tubo e lavare tre volte le perle proteiche super paramagnetiche.Posizionare i tubi su un supporto magnetico e rimuovere il surnatante. Aggiungere 100 microlitri di un buffer RIPA una tantum a ciascun tubo. Aggiungere al tubo 30 microlitri del campione di cromatina, 100 microlitri di perle proteiche super paramagnetiche e quattro microlitri di anticorpo H3K4me3, mescolandoli bene.Posizionare i campioni su uno shaker rotativo per incubarli durante la notte a quattro gradi Celsius a 30 volte G.Lavare l'anticorpo super paramagnetico della proteina perla e il complesso cromatinico risospegnando le perle in un millilitro di una volta tampone RIPA. Lavare il campione con un millilitro di tampone di lavaggio immuno complesso a basso contenuto di sale, quindi con un millilitro di tampone di lavaggio immuno complesso ad alto contenuto di sale. Risciacquare le perle con un millilitro di tampone al cloruro di litio e rimuovere il surnatante.Quindi aggiungere un millilitro di tampone TE al tubo. Posizionare nuovamente il tubo con un millilitro di tampone TE e rimuovere il surnatante con una pipetta. Aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione a ciascun tubo della centrifuga.Eseguire l'eluizione a 65 gradi Celsius per 15 minuti. Centrifugare per un minuto a 10.000 volte G a quattro gradi Celsius e raccogliere il surnatante in nuovi tubi centrifuga. Aggiungere otto microlitri di cinque cloruro di sodio molare a tutti i tubi e incubare a 65 gradi Celsius per quattro o cinque ore o durante la notte per invertire i legami incrociati della proteina del DNA.Aggiungere un microlitro di Rnase A e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere quattro microlitri di proteinasi K a ciascun tubo e incubare a 45 gradi Celsius per una o due ore. Aggiungere 550 microlitri della miscela di cloroformio fenal e alcol isoamilico al tubo della centrifuga.Centrifugare per 15 minuti a 10.000 volte G e aspirare il surnatante. Aggiungere al tubo 1/10 di volume di tre soluzione molare di acetato di sodio, 2,5 volumi di etanolo assoluto e tre microlitri di glicogeno. Posizionare il campione in frigorifero a 20 gradi Celsius negativi durante la notte per le precipitazioni.Il giorno successivo, centrifugare i tubi e scartare il surnatante. Lavare il pellet tre volte con un millilitro di etanolo al 75% appena preparato a 10.000 volte G.Aggiungere 50 microlitri di acqua deionizzata sterile per sciogliere sufficientemente il precipitato. Ripara le estremità del DNA per generare DNA smussato usando un kit di riparazione dell'estremità del DNA e le istruzioni menzionate nel manoscritto di testo.Per aggiungere la base di adenina alle tre estremità prime, aggiungere 30 microlitri di DNA, due microlitri di acqua, cinque microlitri di 10 volte il tampone Taq, 10 microlitri di un dATP millimolare e tre microlitri di Taq DNA polimerasi a un tubo centrifugo PCR da 0,2 microliti. Mescolarli e reagire in una macchina PCR a 72 gradi Celsius per 10 minuti. Eseguire la legatura del linker mescolando 10 microlitri di DNA, 9,9 microlitri di acqua, 2,5 microlitri di tampone T4 DNA ligasi, 0,1 microlitro di oligo mix adattatore e 2,5 microlitri di T4 DNA ligasi in un tubo centrifugo PCR da 0,2 microlitri.Incubare il tubo a 16 gradi Celsius per quattro ore. Per amplificare il DNA utilizzando primer PCR, aggiungere 10,5 microlitri di DNA, 12,5 microlitri di mix master due volte ad alta fedeltà. un microlitro di primer PCR PE 1.0 e un microlitro di primer PCR PE 2.0 a un tubo centrifugo PCR da 0,2 microlitter e mescolare bene.I segnali H3K4me3 dei mutanti di delezione mobre2, mospp1 e moswd2 sono stati significativamente ridotti nelle sue regioni target funzionali. Rispetto al ceppo wild type P131, i segnali delle letture di immunoprecipitazione della cromatina H3K4me3 arricchita nei mutanti di delezione mobre2, mospp1 e moswd2 sono stati in gran parte diminuiti. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire chip on chip e chip qPCR.Sono generalmente utilizzati per esaminare il gene bersaglio a valle di una proteina e studiare le interazioni del DNA proteico in siti di legame del genoma noti.

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Genetics

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

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Structure and Organization of DNA

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