Name: genome-wide analysis of histone modifications distribution using the chromatin immunoprecipitation sequencing method in magnaporthe oryzae
Uploaded: 2021-06-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant no. 31871638), Special Scientific Research Project of Beijing Agriculture University (YQ201603), Scientific Project of Beijing Educational Committee (KM201610020005), High-level scientific research cultivation project of BUA (GJB2021005).

1. Tilberedning av protoplaster fra M. oryzae
<ol><li>Forbered havregryn-tomatagaren (OTA).<ol>
<li>Vei 30-50 g havregryn og kok det i 800 ml vann (ddH2O) i 20 min. Filtrer gjennom to lag gasbind og ta filtratet.</li>
		<li>Velg modne tomater og skrell dem. Klem saften, og filtrer gjennom to lag gasbind for å samle 150 ml av den filtrerte saften.</li>
		<li>Bland all tomatjuice og tilberedt havrefiltrat grundig og tilsett ddH2O opptil 1000 ml.</li>
		<li>Tilsett 250 ml OTA og 2,5 g agarp...

<ol>
	<li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+structure:+are+repeating+unit+of+histones+and+DNA.">Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184 (4139), 868-871 (1974).</li><li>Luger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosomecore+particle+at+2.8+a+resolution.">Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Strathl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li><li>Lachner, M., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+histone+lysine+methylation.">The many faces of histone lysine methylation.</a> Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).</li><li>Bhaumik, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+modifications+of+histones+during+development+and+disease+pathogenesis.">Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).</li><li>Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+implementation+and+physiological+roles+for+histone+H3+lysine+4+(H3K4)+methylation.">Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).</li><li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription.">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).</li><li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+epigenome.">The mammalian epigenome.</a> Cell. 128 (4), 669-681 (2007).</li><li>Weake, V. M., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+ubiquitination:+triggering+gene+activity.">Histone ubiquitination: triggering gene activity.</a> Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).</li><li>Workman, J. L., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+nucleosome+structure+as+a+mechanism+of+transcriptional+regulation.">Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li><li>Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+from+limited+starting+material+of+K562+cells+and+Drosophila+neuroblasts+using+tagmentation+assisted+fragmentation+approach.">ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach.</a> Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).</li><li>Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+comparison+of+tools+of+differential+ChIP-seq+analysis.">A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).</li><li>Kieu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MoSET1+(histone+H3K4+methyltransferase+in+Magnaporthe+oryzae)+regulates+global+gene+expression+during+infection-related+morphogenesis.">MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis.</a> Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).</li><li>Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-induced+transcriptional+activation+of+the+MoCel7C+cellulase+gene+is+associated+with+methylation+of+histone+H3+at+lysine+4+in+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).</li><li>Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+trail+of+a+cereal+killer:+recent+advances+in+Fusarium+graminearum+pathogenomics+and+host+resistance.">On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).</li><li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMT1+arginine+methyltransferase+gene+is+important+for+plant+infection+and+normal+hyphal+growth+in+Fusarium+graminearum.">The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum.</a> PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3K4+methylation+regulates+hyphal+growth,+secondary+metabolism+and+multiple+stress+responses+in+Fusarium+graminearum.">Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum.</a> Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+infection+test:+spray+and+wound-mediated+inoculation+with+the+plant+pathogen+Magnaporthe+grisea.">The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).</li><li>Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fusarium+graminearum+histone+H3K27+methyltransferase+KMT6+regulates+development+and+expression+of+secondary+metabolite+gene+clusters.">The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters.</a> PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).</li><li>Palmer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CclA,+required+for+histone+3+lysine+4+methylation,+decreases+growth+but+increases+secondary+metabolite+production+in+Aspergillus+fumigatus.">Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus.</a> PeerJ. 1, 4 (2013).</li><li>Ding, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tig1+histone+deacetylase+complex+regulates+infectious+growth+in+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).</li><li>Dean, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+grisea.">The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.</a> Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).</li><li>Allis, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+nomenclature+for+chromatin-modifying+enzymes.">New nomenclature for chromatin-modifying enzymes.</a> Cell. 131 (4), 633-636 (2007).</li><li>Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COMPASS+family+of+histone+H3K4+methylases:+mechanisms+of+regulation+in+development+and+disease+pathogenesis.">The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis.</a> Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).</li><li>Zhou, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COMPASS-like+complex+modulates+fungal+development+and+pathogenesis+by+regulating+H3K4me3-mediated+targeted+gene+expression+in+Magnaporthe+oryzae.">The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae.</a> Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).</li></ol>

Nylig har ChIP-seq blitt en mye brukt genomisk analysemetode for å bestemme bindingsstedene til TFer eller berikelsessteder modifisert av spesifikke histoner. Sammenlignet med tidligere ChIP-seq-teknologi er ny ChIP-seq-teknologi svært følsom og fleksibel. Resultatene leveres i høy oppløsning uten negative effekter, for eksempel støysignalet forårsaket av ikke-spesifikk hybridisering av nukleinsyrer. Selv om dette er en vanlig genuttrykksanalyse, har mange beregningsmetoder blitt validert, og kompleksiteten til Ch...

Epigenetikk er en gren av genetisk forskning som refererer til arvelig endring av genuttrykk uten å endre nukleotidsekvensen av gener. Et økende antall studier har vist at epigenetisk regulering spiller en viktig rolle i veksten og utviklingen av eukaryote celler, inkludert kromatin som regulerer og påvirker genuttrykk gjennom den dynamiske prosessen med å brette og montere i høyere orden strukturer1,2. Kromatin ombygging og kovalent histone modifikasjon påvirker og regulerer funksjonen og strukturen av kromatin gjennom variasjonen av kromatinpolymerer, og oppnår dermed funksjonen til å regulere genuttrykk3,4,5,6. Posttranslasjonelle modifikasjoner av histon inkluderer acetylering, fosforylering, metylering, monoubiquitination, sumoylering og ADP ribosylering7,8,9. Histone H3K4 metylering, spesielt trimetylering, er kartlagt til transkripsjonsstartsteder der det er knyttet til transkripsjonsreplikasjon, rekombinasjon, reparasjon og RNA-behandling i eukaryoter10,11.
ChIP-seq-teknologi ble introdusert i 2007 og har blitt den eksperimentelle standarden for genomomfattende analyse av transkripsjonsregulering og epigenetiskemekanismer 12,13. Denne metoden er egnet i genomomskalaen og for å innhente informasjon om interaksjon med histone eller transkripsjonsfaktor, inkludert DNA-segmenter av DNA-bindende proteiner. Eventuelle DNA-sekvenser krysskoblet til proteiner av interesse vil coprecipitate som en del av kromatinkomplekset. Ny generasjon sekvenseringsteknikker brukes også til å sekvensere 36-100 bp DNA, som deretter tilpasses det tilsvarende målgenomet.
I fytopatogeniske sopp har forskning nylig begynt å studere hvordan histone metyleringsmodifikasjoner regulerer deres målgener i prosessen med patogenitet. Noen tidligere studier viste at reguleringen av histone metylaserelaterte gener hovedsakelig gjenspeiles i genaktivering og katalysering av produksjonen av sekundære metabolitter (SM). MoSet1 er H3K4-metylase i M. oryzae. Knockout av dette genet resulterer i fullstendig sletting av H3K4me3 modifikasjon14. Sammenlignet med den ville stammen, er uttrykket av genet MoCEL7C i mutanten hemmet i CMC-indusert tilstand og i ikke-indusert tilstand (glukose eller cellobiose), økte uttrykket av MoCEL7C 15. I Fusarium graminearumkan KMT6 katalysere metyleringsmodifiseringen av H3K27me3, regulere den normale utviklingen av sopp og bidra til å regulere det "kryptiske genomet" som inneholder SM-genklyngen16,17,18,19. I 2013 rapporterte Connolly at H3K9 og H3K27 metylering regulerer den patogene prosessen med sopp gjennom sekundære metabolitter og effektfaktorer som regulerer hemmingen av målgener20. I Aspergilluser modifikasjonen av histoner H3K4me2 og H3K4me3 relatert til genaktivering og spiller en viktig rolle i å kontrollere kromatinnivåreguleringen av SM-genklynger21. I M. oryzaeer Tig1 (homolog til Tig1 i gjær og pattedyr) en HADC (histone deacetylase)22. Knockout av Tig1-genet fører til fullstendig tap av patogenitet og sporeproduksjonsevne i nullmutanten. Det er mer følsomt for et peroksygenmiljø, som ikke kan produsere infektiv hyphae22.
Riseksplosjonen forårsaket av M. oryzae. er en av de mest alvorlige rissykdommene i de fleste risvoksende områder i verden19. På grunn av sin representative infeksjonsprosess ligner M. oryzae infeksjonsprosessen til mange viktige patogene sopp. Som det lett kan utføre molekylære genetiske operasjoner, har soppen blitt en modellorganisme for å studere soppplanteinteraksjoner23. Blokkering av hvert trinn i infeksjonsprosessen til M. oryzae kan føre til mislykket infeksjon. De morfologiske endringene under infeksjonsprosessen er strengt regulert av hele genomfunksjonen og gentranskripsjonen. Blant dem spiller epigenetiske modifikasjoner som histone metylering en viktig rolle i transkripsjonsreguleringen av funksjonelle gener24,25. Men så langt har det blitt gjort få studier på den molekylære mekanismen for epigenetiske modifikasjoner som histonmetylering og histonacetylering i transkripsjonen av patogenesegener i M. oryzae. Derfor vil videreutvikling av den epigenetiske reguleringsmekanismen til risblåse soppen mens forskning på oppstrøms og nedstrøms regulatorisk nettverk av disse patogene relaterte genene bidra til å utvikle risblåseforebygging og kontrollstrategier.
Med utviklingen av funksjonell genomikk som ChIP-seq, spesielt i epigenetikk, har denne datainnsamlingsmetoden med høy gjennomstrømning akselerert forskning på kromosomer. Ved hjelp av ChIP-seq eksperimentell teknologi kan genom-wide distribusjon av histonmetylering (som H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) i M. oryzae og andre filamentøse sopp identifiseres. Derfor kan denne metoden bidra til å belyse de molekylære mekanismene som ligger til grunn for hvordan epigenetiske modifikasjoner regulerer deres kandidatmålgener under sopppatogenese i plantepatologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acidic casein hydrolysate</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>65072-00-6</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar powder</td>
			<td>scientan</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholic acid</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>83-44-3</td>
			<td>protein and dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA End-Repair kit</td>
			<td>NovoBiotec</td>
			<td>ER81050</td>
			<td>Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>no.100.02D</td>
			<td>Binding target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB buffer</td>
			<td>JIMEI</td>
			<td>JC2174</td>
			<td>Membrane and liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9912</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzymatic casein hydrolysate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91079-40-2</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycogen</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>Precipitant action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K4me3 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8580</td>
			<td>Immune response to H3K4me3 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illumina Genome Analyzer</td>
			<td>illumina</td>
			<td>illumina Hiseq 2000</td>
			<td>Large configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina PCR primers</td>
			<td>illumina</td>
			<td>CleanPlex</td>
			<td>Random universal primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoamyl alcohol</td>
			<td>chemical book</td>
			<td>30899-19-5</td>
			<td>Purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9480</td>
			<td>specific removal RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysing enzymes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1412-10G</td>
			<td>cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>36111ES10</td>
			<td>Animal normal immunoglobulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Seebio</td>
			<td>SH30173.08*</td>
			<td>preparation of protein complex eluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85124</td>
			<td>cell lysate to promote cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>The purification procedure removes primers from DNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A32965</td>
			<td>A protein inhibitor that decreases protein activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>DNA Extraction Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>9806S</td>
			<td>cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2271</td>
			<td>Purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9820</td>
			<td>cover up the charge differences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R1181</td>
			<td>Acetic acid buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium deoxycholate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89904</td>
			<td>inhibition of protease degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B69</td>
			<td>DNA ligase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td>buffer action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>HFH10</td>
			<td>keep the membrane protein stable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide analysis of histone modifications distribution using the chromatin immunoprecipitation sequencing method in magnaporthe oryzae

Kromatinimmunoprecipitation sekvensering (ChIP-seq) er en kraftig og mye brukt molekylær teknikk for å kartlegge hele genomet steder av transkripsjonsfaktorer (TFer), kromatinregulatorer og histone modifikasjoner, samt oppdage hele genomer for å avdekke TF bindende mønstre og histone posttranslational modifikasjoner. Kromatinmodifiserende aktiviteter, som histone metylering, rekrutteres ofte til spesifikke genregulatoriske sekvenser, forårsaker lokaliserte endringer i kromatinstrukturer og resulterer i spesifikke transkripsjonseffekter. Risblåsingen er en ødeleggende soppsykdom på ris over hele verden og er et modellsystem for å studere soppplanteinteraksjon. Imidlertid forblir de molekylære mekanismene i hvordan histone modifikasjonene regulerer deres virulensgener i Magnaporthe oryzae unnvikende. Flere forskere må bruke ChIP-seq for å studere hvordan histone epigenetisk modifikasjon regulerer deres målgener. ChIP-seq er også mye brukt til å studere samspillet mellom protein og DNA hos dyr og planter, men det er mindre brukt innen plantepatologi og har ikke blitt godt utviklet. I dette dokumentet beskriver vi den eksperimentelle prosessen og operasjonsmetoden til ChIP-seq for å identifisere den genomomfattende fordelingen av histonmetylering (som H3K4me3) som binder seg til de funksjonelle målgenene i M. oryzae. Her presenterer vi en protokoll for å analysere den genomomfattende fordelingen av histone modifikasjoner, som kan identifisere nye målgener i patogenesen av M. oryzae og andre filamentøse sopp.

Hele flytskjemaet for ChIP-seq -metoden vises i figur 1. ChIP-seq eksperimenter ble utført ved hjelp av antistoffer mot H3K4me3 i wild-type stammen P131 og tre null mutant stammer som var blottet for mobre2, mospp1, og moswd2 genet for å verifisere hele genom-wide profilen av histone H3K4me3 distribusjon i M. oryzae. Protoplastene til den ville stammen, Δmobre2, Δmospp1og Δmoswd2, ble forberedt og sonikert ved 25% W, utgang ...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae at JoVE.com

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Her presenterer vi en protokoll for å analysere den genomomfattende fordelingen av histone modifikasjoner, som kan identifisere nye målgener i patogenesen av M. oryzae og andre filamentøse sopp.

Genomomfattende analyse av histone modifikasjoner Distribusjon ved hjelp av Chromatin Immunoprecipitation Sekvensering Metode i Magnaporthe oryzae

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Denne metoden kan bidra til å belyse molekylære mekanismer som ligger til grunn for regulering av kandidatmålgener via epigenetiske modifikasjoner under sopppatogenese i plantepatologi. Kromatinimmunoprecipitation sekvenseringsteknologi kan effektivt oppdage DNA-segmenter som samhandler med histoner og transkripsjonsfaktorer i hele genomet. Sammenlignet med andre metoder, kan det forbedre effektiviteten og oppløsningen.Begynn med å tilsette 100 mikroliter væske komplett medium til havregryn tomat Agger plater ved hjelp av en 100 mikroliter pipette. Bruk en inokulasjonssløyfe, skrap mycelia av villtypestammen og knockout-stammen. Samle mycelia rusk og overføre dem til 250 milliliter flytende komplett medium.Vask sopphyfasen med 500 milliliter 0,7 molar natriumkloridoppløsning. Samle deretter sopp myceliUM og vei den. Tilsett omtrent en milliliter lysis enzym permeasjonsløsning per ett gram soppmicelium.Plasser hyphae for kutting ved 28 grader Celsius i tre til fire timer med risting ved 150 RPM. Vask lusehyfasen med 50 milliliter 0,7 molar natriumkloridoppløsning. Sentrifuger prøven og kast supernatanten forsiktig.Re-suspendere protoplast i 20 milliliter av 0,7 molar natriumkloridoppløsning. Tilsett 55 mikroliter 37% formaldehyddråpe ved dråpe til to milliliter natriumkloridbuffer som inneholder protoplaster for krysskobling til den endelige konsentrasjonen er 1%For å slukke den ikke-utførte formaldehyden, tilsett 20 mikroliter 10 ganger glycin til hvert rør. Kast supernatanten forsiktig etter sentrifugering.Re-suspendere pellet i en milliliter av 0,7 molar natriumkloridoppløsning. Kast supernatanten forsiktig etter sentrifugering og re-suspendere pellet i 750 mikroliter RIPA buffer. Tilsett 37,5 mikroliter 20 ganger proteasehemmer.Skjær kromatin ved sonikering i åtte minutter ved hjelp av en ultralyd homogenisator. Etter at prøven er ultrasonisk ødelagt, ta ut en del av prøven som inngang som inneholder alt DNA og protein utgitt etter at prøven er sonikert. For å analysere lengden på DNA-fragmentene, kjør en 1% agarose gelelektroforese etter sonikering.Etter sentrifugering, overfør sentrifugert supernatant til et 1,5 milliliter sentrifugerør og lagre det på negative 80 grader Celsius for senere bruk. Før du utfører IP-eksperimentet, fortynn hver kromatinprøve til et forhold på en til 10 med en ganger RIPA-buffer. Pipette 50 mikroliter super paramagnetiske proteinperler i et to milliliter sentrifugerør.Plasser rørene på et magnetisk stativ og la de magnetiske perlene utfelle. Fjern deretter supernatanten. Tilsett en milliliter forhåndskjølt en ganger RIPA buffer til røret og vask super paramagnetiske proteinperler tre ganger.Plasser rørene på et magnetisk stativ og fjern supernatanten. Tilsett 100 mikroliter med én gang RIPA-buffer i hvert rør. Tilsett 30 mikroliter av kromatinprøven, 100 mikroliter super paramagnetiske proteinperler og fire mikroliter H3K4me3 antistoff til røret, bland dem godt.Plasser prøvene på en roterende shaker for å inkubere dem over natten ved fire grader Celsius ved 30 ganger G.Wash super paramagnetisk proteinperle antistoff og kromatinkompleks ved å resuspendere perlene i en milliliter av en gang RIPA buffer. Vask prøven med en milliliter lav salt immunkompleks vaskebuffer, deretter med en milliliter høy salt immunkompleks vaskebuffer. Skyll perlene med en milliliter litiumkloridbuffer og fjern supernatanten.Legg deretter til en milliliter TE-buffer i røret. Plasser røret igjen med en milliliter TE-buffer og fjern supernatanten med en pipette. Tilsett 100 mikroliter elutionbuffer til hvert sentrifugerør.Utfør elution ved 65 grader Celsius i 15 minutter. Sentrifuge i ett minutt ved 10.000 ganger G ved fire grader Celsius og samle supernatanten i nye sentrifugerør. Tilsett åtte mikroliter med fem molar natriumklorid til alle rørene og inkuber ved 65 grader Celsius i fire til fem timer eller over natten for å reversere DNA-proteinets krysskoblinger.Tilsett en mikroliter av Rnase A og inkuber i 30 minutter ved 37 grader Celsius. Tilsett fire mikroliter proteinase K til hvert rør og inkuber ved 45 grader Celsius i en til to timer. Tilsett 550 mikroliter av fenalklorform og isoamylalkoholblanding til sentrifugerøret.Sentrifuge i 15 minutter ved 10.000 ganger G og aspirere supernatanten. Tilsett 1/10 volum av tre molar natriumacetatoppløsning, 2,5 volumer absolutt etanol og tre mikroliter glykogen til røret. Plasser prøven i kjøleskap ved minus 20 grader Celsius over natten for nedbør.Neste dag sentrifugerer du rørene og kaster supernatanten. Vask pellet tre ganger med en milliliter nylaget 75% etanol ved 10.000 ganger G.Tilsett 50 mikroliter sterilt deionisert vann for å tilstrekkelig oppløse bunnfallet. Reparer DNA-endene for å generere sløvt, avsluttet DNA ved hjelp av et DNA-endereparasjonssett, og instruksjoner som er nevnt i tekstmanuskriptet.For å legge adeningrunnlaget til de tre hovedendene, tilsett 30 mikroliter DNA, to mikroliter vann, fem mikroliter 10 ganger Taq-buffer, 10 mikroliter av en millimolar dATP og tre mikroliter Taq DNA-polymerase til et 0,2 mikroliter PCR sentrifugerør. Bland dem og reager i en PCR-maskin ved 72 grader Celsius i 10 minutter. Utfør linker ligation ved å blande 10 mikroliter DNA, 9,9 mikroliter vann, 2,5 mikroliter T4 DNA-ligasebuffer, 0,1 mikroliter adapter oligo-blanding og 2,5 mikroliter T4 DNA-ligaer i et 0,2 mikroliter PCR sentrifugerør.Inkuber røret ved 16 grader Celsius i fire timer. For å forsterke DNA-et ved hjelp av PCR-primere, tilsett 10,5 mikroliter DNA, 12,5 mikroliter to ganger høy kvalitet master mix. en mikroliter av PCR primer PE 1.0 og en mikroliter PCR primer PE 2.0 til en 0.2 mikroliter PCR sentrifuge rør og bland godt.H3K4me3-signalene fra mobre2-, mospp1- og moswd2-slettingsmutantene ble betydelig redusert i sine funksjonelle målregioner. Sammenlignet med den ville typen stamme P131, ble signalene til beriket H3K4me3 kromatinimmunoprecipitation sekvensering lest i mobre2, mospp1 og moswd2 sletting mutanter ble i stor grad redusert. Etter denne prosedyren kan chip på chip og chip qPCR utføres.De brukes vanligvis til å screene nedstrøms målgenet til et protein og studere protein DNA-interaksjoner på kjente genombindingssteder.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Genetics

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Unit 1

Structure and Organization of DNA

SCIENTISTS IN ACTION

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genome-wide Fastsettelse av pattedyr Replication Timing av DNA innhold Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analyse av c-KIT ligand-promotoren ved bruk av kromatinimmunutfelling

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Kromatinimmunpresipitasjon (ChIP) i mus-T-cellelinjer

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generasjon av innfødte Chromatin Immunoprecipitation sekvensering biblioteker til Nucleosome tetthet analyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokollen for lav-overflod embryonale prøver

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Kartlegging genomet hele tilgjengelig Chromatin i primære menneskelige T-lymfocytter av ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generasjon av genomet hele Chromatin konformasjon fange biblioteker fra tett trinnvis tidlig Drosophila embryo

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Histone endringer fra Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotoren fange Hei-C: Med høy oppløsning, genomet-bred profilering av arrangøren interaksjoner

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Chromatin Immunoprecipitation av Murine brun fettvev

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...