Name: genome-wide analysis of histone modifications distribution using the chromatin immunoprecipitation sequencing method in magnaporthe oryzae
Uploaded: 2021-06-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (Grant no. 31871638), pelo Special Scientific Research Project of Beijing Agriculture University (YQ201603), pelo Scientific Project of Beijing Educational Committee (KM20161002005), o projeto de cultivo de pesquisa científica de alto nível da BUA (GJB2021005).

1. Preparação de protoplastos de M. oryzae
<ol><li>Prepare o ágar de aveia-tomate (OTA).<ol>
<li>Pese 30-50 g de aveia e ferva-a em 800 mL de água (ddH2O) por 20 min. Filtre duas camadas de gaze e pegue a filtrada.</li>
		<li>Pegue tomates maduros e descasque-os. Esprema o suco e filtre duas camadas de gaze para coletar 150 mL do suco filtrado.</li>
		<li>Misture todo o suco de tomate e a aveia preparada filtrar bem e adicione ddH2O até 1000 mL.</li>
		<li>Adicione 250 mL do OTA e 2,...

<ol>
	<li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+structure:+are+repeating+unit+of+histones+and+DNA.">Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184 (4139), 868-871 (1974).</li><li>Luger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosomecore+particle+at+2.8+a+resolution.">Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Strathl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li><li>Lachner, M., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+histone+lysine+methylation.">The many faces of histone lysine methylation.</a> Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).</li><li>Bhaumik, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+modifications+of+histones+during+development+and+disease+pathogenesis.">Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).</li><li>Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+implementation+and+physiological+roles+for+histone+H3+lysine+4+(H3K4)+methylation.">Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).</li><li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription.">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).</li><li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+epigenome.">The mammalian epigenome.</a> Cell. 128 (4), 669-681 (2007).</li><li>Weake, V. M., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+ubiquitination:+triggering+gene+activity.">Histone ubiquitination: triggering gene activity.</a> Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).</li><li>Workman, J. L., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+nucleosome+structure+as+a+mechanism+of+transcriptional+regulation.">Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li><li>Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+from+limited+starting+material+of+K562+cells+and+Drosophila+neuroblasts+using+tagmentation+assisted+fragmentation+approach.">ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach.</a> Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).</li><li>Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+comparison+of+tools+of+differential+ChIP-seq+analysis.">A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).</li><li>Kieu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MoSET1+(histone+H3K4+methyltransferase+in+Magnaporthe+oryzae)+regulates+global+gene+expression+during+infection-related+morphogenesis.">MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis.</a> Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).</li><li>Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-induced+transcriptional+activation+of+the+MoCel7C+cellulase+gene+is+associated+with+methylation+of+histone+H3+at+lysine+4+in+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).</li><li>Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+trail+of+a+cereal+killer:+recent+advances+in+Fusarium+graminearum+pathogenomics+and+host+resistance.">On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).</li><li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMT1+arginine+methyltransferase+gene+is+important+for+plant+infection+and+normal+hyphal+growth+in+Fusarium+graminearum.">The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum.</a> PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3K4+methylation+regulates+hyphal+growth,+secondary+metabolism+and+multiple+stress+responses+in+Fusarium+graminearum.">Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum.</a> Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+infection+test:+spray+and+wound-mediated+inoculation+with+the+plant+pathogen+Magnaporthe+grisea.">The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).</li><li>Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fusarium+graminearum+histone+H3K27+methyltransferase+KMT6+regulates+development+and+expression+of+secondary+metabolite+gene+clusters.">The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters.</a> PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).</li><li>Palmer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CclA,+required+for+histone+3+lysine+4+methylation,+decreases+growth+but+increases+secondary+metabolite+production+in+Aspergillus+fumigatus.">Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus.</a> PeerJ. 1, 4 (2013).</li><li>Ding, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tig1+histone+deacetylase+complex+regulates+infectious+growth+in+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).</li><li>Dean, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+grisea.">The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.</a> Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).</li><li>Allis, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+nomenclature+for+chromatin-modifying+enzymes.">New nomenclature for chromatin-modifying enzymes.</a> Cell. 131 (4), 633-636 (2007).</li><li>Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COMPASS+family+of+histone+H3K4+methylases:+mechanisms+of+regulation+in+development+and+disease+pathogenesis.">The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis.</a> Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).</li><li>Zhou, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COMPASS-like+complex+modulates+fungal+development+and+pathogenesis+by+regulating+H3K4me3-mediated+targeted+gene+expression+in+Magnaporthe+oryzae.">The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae.</a> Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).</li></ol>

Recentemente, o ChIP-seq tornou-se um método de análise genômica amplamente utilizado para determinar os locais de vinculação de TFs ou locais de enriquecimento modificados por histones específicos. Em comparação com a tecnologia ChIP-seq anterior, a nova tecnologia ChIP-seq é altamente sensível e flexível. Os resultados são fornecidos em alta resolução sem efeitos negativos, como o sinal de ruído causado pela hibridização não específica dos ácidos nucleicos. Embora esta seja uma análise comum de exp...

Epigenética é um ramo de pesquisa genética que se refere à mudança hereditária da expressão genética sem alterar a sequência nucleotídea dos genes. Um número crescente de estudos tem demonstrado que a regulação epigenética desempenha um papel importante no crescimento e desenvolvimento de células eucarióticas, incluindo a cromatina que regula e afeta a expressão genética através do processo dinâmico de dobra e montagem em estruturas de altaordem 1,2. A remodelação da cromatina e a modificação da histona covalente afetam e regulam a função e a estrutura da cromatina através da variação dos polímeros de cromatina, alcançando assim a função de regular a expressão genética3,4,5,6. As modificações pós-transacionais da histona incluem acetilação, fosforilação, metilação, monoubiquização, sumôilação e ribossilação ADP7,8,9. A metilação histona H3K4, particularmente a trimetilação, foi mapeada para locais de início de transcrição onde está associada à replicação de transcrição, recombinação, reparo e processamento de RNA em eucariotes10,11.
A tecnologia ChIP-seq foi introduzida em 2007 e tornou-se o padrão experimental para a análise em todo o genoma da regulação transcricional e dos mecanismos epigenéticos12,13. Este método é adequado na escala genoma-em toda-genoma e para a obtenção de informações de interação de histona ou fator de transcrição, incluindo segmentos de DNA de proteínas de ligação de DNA. Qualquer sequência de DNA cruzada a proteínas de interesse coprecipitará como parte do complexo de cromatina. Técnicas de sequenciamento de nova geração também são usadas para sequenciar 36-100 bp de DNA, que são então combinadas com o genoma alvo correspondente.
Em fungos fitopatômicos, a pesquisa começou recentemente a estudar como modificações de metilação de histona regulam seus genes-alvo no processo de patogenicidade. Alguns estudos anteriores provaram que a regulação de genes relacionados à histona methylase é refletida principalmente no silenciamento genético e na catalisação da produção de Metabólitos Secundários (SM). MoSet1 é o metilase H3K4 em M. oryzae. O nocaute deste gene resulta na exclusão completa da modificação H3K4me314. Em comparação com a cepa do tipo selvagem, a expressão do gene MoCEL7C no mutante é inibida no estado induzido pelo CMC e no estado não induzido (glicose ou celobiose), a expressão de MoCEL7C aumentou15. Em Fusarium graminearum, KMT6 pode catalisar a modificação da metilação de H3K27me3, regular o desenvolvimento normal de fungos e ajudar a regular o "genoma enigmático" contendo o aglomerado genético SM16,17,18,19. Em 2013, Connolly relatou que a metilação H3K9 e H3K27 regula o processo patogênico de fungos através de metabólitos secundários e fatores efeitos que regulam a inibição dos genes-alvo20. Em Aspergillus,a modificação das histonas H3K4me2 e H3K4me3 está relacionada à ativação genética e desempenha um papel importante no controle da regulação do nível de cromatina dos aglomerados genéticos SM21. Em M. oryzae, Tig1 (homólogo de Tig1 em leveduras e mamíferos) é um HADC (histone deacetylase)22. Nocaute do gene Tig1 leva à perda completa da patogenicidade e capacidade de produção de esporos no mutante nulo. É mais sensível a um ambiente peroxígeno, que não pode produzir hifasinfecciosas 22.
A explosão de arroz causada por M. oryzae. é uma das doenças de arroz mais graves na maioria das áreas de cultivo de arroz no mundo19. Devido ao seu processo de infecção representativa, M. oryzae é semelhante ao processo de infecção de muitos fungos patogênicos importantes. Como pode facilmente realizar operações genéticas moleculares, o fungo tornou-se um organismo modelo para estudar as interações fúngicos-vegetais23. Bloquear cada etapa do processo de infecção de M. oryzae pode resultar em infecção mal sucedida. As alterações morfológicas durante o processo de infecção são estritamente reguladas por toda a função do genoma e transcrição genética. Entre elas, modificações epigenéticas como a metilação de histona desempenham um papel essencial na regulação transcricional dos genes funcionais24,25. No entanto, até agora, poucos estudos foram feitos sobre o mecanismo molecular de modificações epigenéticas como a metilação de histona e acetilação de histona na transcrição de genes de patogênese em M. oryzae. Portanto, desenvolver ainda mais o mecanismo de regulação epigenética do fungo da explosão de arroz, enquanto pesquisa a rede reguladora a montante e a jusante desses genes relacionados à patogenicidade ajudará a desenvolver estratégias de prevenção e controle da explosão de arroz.
Com o desenvolvimento de genômicas funcionais como o ChIP-seq, especialmente na epigenética, este método de aquisição de dados de alto rendimento acelerou a pesquisa sobre cromossomos. Usando a tecnologia experimental ChIP-seq, a distribuição em todo o genoma da metilação de histona (como H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) em M. oryzae e outros fungos filamentosos pode ser identificada. Portanto, este método pode ajudar a elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à forma como modificações epigenéticas regulam seus genes alvos candidatos durante a patogênese fúngica na patologia vegetal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acidic casein hydrolysate</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>65072-00-6</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar powder</td>
			<td>scientan</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholic acid</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>83-44-3</td>
			<td>protein and dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA End-Repair kit</td>
			<td>NovoBiotec</td>
			<td>ER81050</td>
			<td>Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>no.100.02D</td>
			<td>Binding target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB buffer</td>
			<td>JIMEI</td>
			<td>JC2174</td>
			<td>Membrane and liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9912</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzymatic casein hydrolysate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91079-40-2</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycogen</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>Precipitant action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K4me3 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8580</td>
			<td>Immune response to H3K4me3 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illumina Genome Analyzer</td>
			<td>illumina</td>
			<td>illumina Hiseq 2000</td>
			<td>Large configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina PCR primers</td>
			<td>illumina</td>
			<td>CleanPlex</td>
			<td>Random universal primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoamyl alcohol</td>
			<td>chemical book</td>
			<td>30899-19-5</td>
			<td>Purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9480</td>
			<td>specific removal RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysing enzymes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1412-10G</td>
			<td>cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>36111ES10</td>
			<td>Animal normal immunoglobulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Seebio</td>
			<td>SH30173.08*</td>
			<td>preparation of protein complex eluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85124</td>
			<td>cell lysate to promote cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>The purification procedure removes primers from DNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A32965</td>
			<td>A protein inhibitor that decreases protein activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>DNA Extraction Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>9806S</td>
			<td>cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2271</td>
			<td>Purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9820</td>
			<td>cover up the charge differences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R1181</td>
			<td>Acetic acid buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium deoxycholate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89904</td>
			<td>inhibition of protease degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B69</td>
			<td>DNA ligase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td>buffer action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>HFH10</td>
			<td>keep the membrane protein stable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide analysis of histone modifications distribution using the chromatin immunoprecipitation sequencing method in magnaporthe oryzae

O sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina (ChIP-seq) é uma técnica molecular poderosa e amplamente utilizada para mapear locais inteiros do genoma de fatores de transcrição (TFs), reguladores de cromatina e modificações de histona, bem como detectar genomas inteiros para descobrir padrões de ligação TF e modificações pós-translationais de histona. Atividades modificadoras de cromatina, como a metilação de histona, são frequentemente recrutadas para sequências regulatórias genéticas específicas, causando alterações localizadas nas estruturas de cromatina e resultando em efeitos transcricionais específicos. A explosão de arroz é uma doença fúngica devastadora no arroz em todo o mundo e é um sistema modelo para estudar a interação fungo-planta. No entanto, os mecanismos moleculares em como as modificações de histona regulam seus genes de virulência em Magnaporthe oryzae permanecem evasivos. Mais pesquisadores precisam usar o ChIP-seq para estudar como a modificação epigenética histona regula seus genes-alvo. O ChIP-seq também é amplamente utilizado para estudar a interação entre proteína e DNA em animais e plantas, mas é menos utilizado no campo da patologia vegetal e não foi bem desenvolvido. Neste artigo, descrevemos o processo experimental e o método de operação do ChIP-seq para identificar a distribuição em todo o genoma da metilação de histona (como H3K4me3) que se liga aos genes-alvo funcionais em M. oryzae. Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a distribuição em todo o genoma das modificações de histona, que podem identificar novos genes-alvo na patogênese de M. oryzae e outros fungos filamentosos.

Todo o fluxograma do método ChIP-seq é mostrado na Figura 1. Os experimentos chIP-seq foram realizados usando anticorpos contra H3K4me3 na cepa de tipo selvagem P131 e três cepas mutantes nulas que eram desprovidas de mobre2, mospp1e gene moswd2 para verificar todo o perfil genoma da distribuição histone H3K4me3 em M. oryzae. Os protoplastos da cepa do tipo selvagem, Δmobre2, Δmospp1e Δmoswd2, foram preparados e sonicados...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae at JoVE.com

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a distribuição em todo o genoma das modificações de histona, que podem identificar novos genes-alvo na patogênese de M. oryzae e outros fungos filamentosos.

Análise em todo o genoma da distribuição de modificações de histona usando o Método de Sequenciamento de Imunoprecipitação de Chromatina em Magnaporthe oryzae

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Este método pode ajudar a elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à regulação dos genes alvo candidatos através de modificações epigenéticas durante a patogênese fúngica na patologia vegetal. A tecnologia de sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina pode detectar eficientemente segmentos de DNA que interagem com histones e fatores de transcrição em todo o genoma. Em comparação com outros métodos, pode melhorar a eficiência e a resolução.Comece adicionando 100 microliters de meio líquido completo às placas de agger de tomate de aveia usando uma pipeta de 100 microliteres. Usando um laço de inoculação, raspe a micélia da cepa do tipo selvagem e a tensão do nocaute. Pegue os detritos de micélia e transfira-os para 250 mililitros de meio líquido completo.Lave a hifa fúngica com 500 mililitros de 0,7 solução de cloreto de sódio molar. Então pegue o myceliUM fúngico e pese-o. Adicione aproximadamente um mililitro de solução de permeação de enzima de lise por um grama do micélio fúngico.Coloque a hifa para corte a 28 graus Celsius por três a quatro horas com agitação a 150 RPM. Lave a hifalica com 50 mililitros de 0,7 solução de cloreto de sódio molar. Centrifugar a amostra e descartar cuidadosamente o sobrenante.Suspenda o protoplasto em 20 mililitros de 0,7 solução de cloreto de sódio molar. Adicione 55 microliters de 37% de formaldeído gota a gota a dois mililitros de tampão de cloreto de sódio contendo protoplastos para ligação cruzada até que a concentração final seja de 1%Para saciar o formaldeído não redigido, adicione 20 microliters de 10 vezes a glicina a cada tubo. Descarte o supernatante cuidadosamente após a centrifugação.Suspenda a pelota em um mililitro de 0,7 solução de cloreto de sódio molar. Descarte o supernatante cuidadosamente após a centrifugação e suspenda a pelota em 750 microliters de buffer RIPA. Adicione 37,5 microliters de 20 vezes o inibidor de protease.Cisalhamento a cromatina por sônica por oito minutos usando um homogeneizador ultrassônico. Depois que a amostra for quebrada ultrasonicamente, tire uma parte da amostra como entrada contendo todo o DNA e proteína liberados após a amostra ser sônica. Para analisar o comprimento dos fragmentos de DNA, execute uma eletroforese de gel de 1%agarose após a sônica.Após a centrifugação, transfira o supernatante centrifuado para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e armazene-o a 80 graus Celsius negativos para uso posterior. Antes de realizar o experimento IP, dilua cada amostra de cromatina para uma razão de 1 a 10 com um buffer RIPA de uma vez. Pipeta 50 microliters de contas de proteína super paramagnética em um tubo de centrífuga de dois mililitros.Coloque os tubos em um suporte magnético e deixe as contas magnéticas precipitarem. Em seguida, remova o supernatante. Adicione um mililitro de tampão pré-resfriado uma vez RIPA ao tubo e lave contas de proteína super paramagnética três vezes.Coloque os tubos em um suporte magnético e remova o sobrenatante. Adicione 100 microliters de um tampão RIPA de uma vez a cada tubo. Adicione 30 microliters da amostra de cromatina, 100 microliters de contas de proteína super paramagnética e quatro microliters de anticorpoS H3K4me3 ao tubo, misturando-os bem.Coloque as amostras em um agitador rotativo para incuba-las durante a noite a quatro graus Celsius a 30 vezes G.Lave o anticorpo de contas de proteína super paramagnética e o complexo de cromatina, reutilizando as contas em um mililitro de um tampão RIPA de uma vez. Lave a amostra com um mililitro de tampão de lavagem complexo imunológico de baixo sal, em seguida, com um mililitro de tampão de lavagem complexo imunológico de sal alto. Enxágüe as contas com um mililitro de tampão de cloreto de lítio e remova o sobrenatante.Em seguida, adicione um mililitro de tampão de TE ao tubo. Coloque o tubo novamente com um mililitro de tampão de TE e remova o supernatante com uma pipeta. Adicione 100 microliters de tampão de eluição a cada tubo de centrífuga.Realize a elução a 65 graus Celsius por 15 minutos. Centrifugar por um minuto a 10.000 vezes G a quatro graus Celsius e coletar o supernatante em novos tubos de centrífuga. Adicione oito microliters de cinco cloreto de sódio molar a todos os tubos e incubar a 65 graus Celsius por quatro a cinco horas ou durante a noite para reverter as ligações cruzadas da proteína do DNA.Adicione um microliter de Rnase A e incubar por 30 minutos a 37 graus Celsius. Adicione quatro microliters de proteinase K em cada tubo e incubar a 45 graus Celsius por uma a duas horas. Adicione 550 microliters do clorofórmio fenal e mistura de álcool isoamílico ao tubo centrífuga.Centrifugar por 15 minutos a 10.000 vezes G e aspirar o supernante. Adicione 1/10 de volume de três soluçãos de acetato de sódio molar, 2,5 volumes de etanol absoluto e três microliters de glicogênio ao tubo. Coloque a amostra em uma geladeira a 20 graus Celsius negativo durante a noite para precipitação.No dia seguinte, centrifufique os tubos e descarte o supernatante. Lave a pelota três vezes com um mililitro de etanol recém-preparado 75% a 10.000 vezes G.Adicione 50 microliters de água deionizada estéril para dissolver suficientemente o precipitado. Reparar as extremidades de DNA para gerar DNA sem cortes usando um kit de reparação final de DNA, e instruções mencionadas no manuscrito do texto.Para adicionar base de adenina às três extremidades primos, adicione 30 microliters de DNA, dois microliters de água, cinco microliters de 10 vezes tampão Taq, 10 microliters de um dATP mililitro e três microliters de polimerase de DNA Taq a um tubo de centrífugo PCR de 0,2 microliter. Misture-os e reaja em uma máquina PCR a 72 graus Celsius por 10 minutos. Realize a ligadura de linker misturando 10 microliters de DNA, 9,9 microliters de água, 2,5 microliters de tampão de ligase de DNA T4, 0,1 microliter de mistura de oligo adaptador e 2,5 microliters de ligase de DNA T4 em um tubo de centrífugo PCR 0,2 microliter.Incubar o tubo a 16 graus Celsius por quatro horas. Para amplificar o DNA usando primers PCR, adicione 10,5 microlitros de DNA, 12,5 microlitros de duas vezes a mistura mestre de fidelidade. um microliter de primer PCR PE 1.0 e um microliter de primer PCR PE 2.0 a um tubo de centrífugas PCR de 0,2 microliter e misturar bem.Os sinais H3K4me3 dos mutantes de eliminação de mobre2, mospp1 e moswd2 foram significativamente diminuídos em suas regiões-alvo funcionais. Em comparação com a cepa do tipo selvagem P131, os sinais de sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina H3K4me3 enriquecido foram largamente diminuídos. Após este procedimento, chip no chip e chip qPCR pode ser realizado.Eles são geralmente usados para testar o gene alvo a jusante de uma proteína e estudar interações de DNA de proteína em locais conhecidos de ligação de genoma.

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Cell Biology

Genetics

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Unit 1

Structure and Organization of DNA

SCIENTISTS IN ACTION

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Genética

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