Name: genome-wide analysis of histone modifications distribution using the chromatin immunoprecipitation sequencing method in magnaporthe oryzae
Uploaded: 2021-06-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant no. 31871638), det särskilda vetenskapliga forskningsprojektet vid Beijing Agriculture University (YQ201603), det vetenskapliga projektet i Pekings utbildningskommitté (KM201610020005), BUA:s vetenskapliga forskningsodlingsprojekt på hög nivå (GJB2021005).

1. Beredning av protoplaster från M. oryzae
<ol><li>Förbered havregryns-tomatagar (OTA).<ol>
<li>Väg 30-50 g havregryn och koka den i 800 ml vatten (ddH2O) i 20 min. Filtrera genom två lager gasväv och ta filtratet.</li>
		<li>Plocka mogna tomater och skala dem. Pressa saften och filtrera genom två lager gasväv för att samla 150 ml av den filtrerade saften.</li>
		<li>Blanda all tomatjuice och den beredda havrefilratet noggrant och tillsätt ddH2O upp till 1000 ml.</li>
		<li>Till...

<ol>
	<li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+structure:+are+repeating+unit+of+histones+and+DNA.">Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184 (4139), 868-871 (1974).</li><li>Luger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosomecore+particle+at+2.8+a+resolution.">Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Strathl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li><li>Lachner, M., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+histone+lysine+methylation.">The many faces of histone lysine methylation.</a> Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).</li><li>Bhaumik, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+modifications+of+histones+during+development+and+disease+pathogenesis.">Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).</li><li>Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+implementation+and+physiological+roles+for+histone+H3+lysine+4+(H3K4)+methylation.">Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).</li><li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription.">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).</li><li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+epigenome.">The mammalian epigenome.</a> Cell. 128 (4), 669-681 (2007).</li><li>Weake, V. M., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+ubiquitination:+triggering+gene+activity.">Histone ubiquitination: triggering gene activity.</a> Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).</li><li>Workman, J. L., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+nucleosome+structure+as+a+mechanism+of+transcriptional+regulation.">Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li><li>Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+from+limited+starting+material+of+K562+cells+and+Drosophila+neuroblasts+using+tagmentation+assisted+fragmentation+approach.">ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach.</a> Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).</li><li>Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+comparison+of+tools+of+differential+ChIP-seq+analysis.">A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).</li><li>Kieu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MoSET1+(histone+H3K4+methyltransferase+in+Magnaporthe+oryzae)+regulates+global+gene+expression+during+infection-related+morphogenesis.">MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis.</a> Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).</li><li>Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-induced+transcriptional+activation+of+the+MoCel7C+cellulase+gene+is+associated+with+methylation+of+histone+H3+at+lysine+4+in+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).</li><li>Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+trail+of+a+cereal+killer:+recent+advances+in+Fusarium+graminearum+pathogenomics+and+host+resistance.">On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).</li><li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMT1+arginine+methyltransferase+gene+is+important+for+plant+infection+and+normal+hyphal+growth+in+Fusarium+graminearum.">The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum.</a> PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3K4+methylation+regulates+hyphal+growth,+secondary+metabolism+and+multiple+stress+responses+in+Fusarium+graminearum.">Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum.</a> Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+infection+test:+spray+and+wound-mediated+inoculation+with+the+plant+pathogen+Magnaporthe+grisea.">The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).</li><li>Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fusarium+graminearum+histone+H3K27+methyltransferase+KMT6+regulates+development+and+expression+of+secondary+metabolite+gene+clusters.">The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters.</a> PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).</li><li>Palmer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CclA,+required+for+histone+3+lysine+4+methylation,+decreases+growth+but+increases+secondary+metabolite+production+in+Aspergillus+fumigatus.">Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus.</a> PeerJ. 1, 4 (2013).</li><li>Ding, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tig1+histone+deacetylase+complex+regulates+infectious+growth+in+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).</li><li>Dean, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+grisea.">The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.</a> Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).</li><li>Allis, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+nomenclature+for+chromatin-modifying+enzymes.">New nomenclature for chromatin-modifying enzymes.</a> Cell. 131 (4), 633-636 (2007).</li><li>Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COMPASS+family+of+histone+H3K4+methylases:+mechanisms+of+regulation+in+development+and+disease+pathogenesis.">The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis.</a> Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).</li><li>Zhou, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COMPASS-like+complex+modulates+fungal+development+and+pathogenesis+by+regulating+H3K4me3-mediated+targeted+gene+expression+in+Magnaporthe+oryzae.">The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae.</a> Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).</li></ol>

Nyligen har ChIP-seq blivit en allmänt använd genomisk analysmetod för att bestämma bindningsplatserna för TFs eller anrikningsplatser som modifierats av specifika histoner. Jämfört med tidigare ChIP-seq-teknik är ny ChIP-seq-teknik mycket känslig och flexibel. Resultaten tillhandahålls i hög upplösning utan negativa effekter, såsom ljudsignalen som orsakas av den icke-specifika hybridiseringen av nukleinsyror. Även om detta är en gemensam genuttrycksanalys, har många beräkningsmetoder validerats, och ko...

Epigenetik är en gren av genetisk forskning som hänvisar till den ärftliga förändringen av genuttryck utan att ändra nukleotidsekvensen av gener. Ett ökande antal studier har visat att epigenetisk reglering spelar en viktig roll för tillväxten och utvecklingen av eukaryota celler, inklusive kromatin som reglerar och påverkar genuttryck genom den dynamiska vikningsprocessen och monteringen i högre ordning strukturer1,2. Kromatinombyggnad och kovament histonmodifiering påverkar och reglerar kromatins funktion och struktur genom variationen av kromatinpolymerer, vilket uppnår funktionen att reglera genuttryck3,4,5,6. Posttranslational modifieringar av histon inkluderar acetylering, fosforylering, metylering, monoubiquitination, sumoylering och ADP ribosylation7,8,9. Histone H3K4 metylering, särskilt trimetylering, har mappats till transkription start platser där det är associerat med transkription replikering, rekombination, reparation och RNA bearbetning i eukaryotes10,11.
ChIP-seq-tekniken introducerades 2007 och har blivit den experimentella standarden för genomomfattande analys av transkriptionell reglering och epigenetiskamekanismer 12,13. Denna metod är lämplig i genomomfattande skala och för att erhålla information om interaktion med histon- eller transkriptionsfaktorer, inklusive DNA-segment av DNA-bindande proteiner. Alla DNA-sekvenser som är korslänkade till proteiner av intresse kommer att koprecipitera som en del av kromatinkomplexet. Nya generationens sekvenseringstekniker används också för att sekvensera 36-100 bp DNA, som sedan matchas med motsvarande målgenom.
Inom fytopatiska svampar har forskningen nyligen börjat studera hur stenmethyleringsmodifieringar reglerar deras målgener i patogenicitetsprocessen. Vissa tidigare studier visade att regleringen av histonmetylasrelaterade gener främst återspeglas i gensilencing och katalysering av produktionen av sekundära metaboliter (SM). MoSet1 är H3K4 metylas i M. oryzae. Knockout av denna gen resulterar i fullständig radering av H3K4me3 modifiering14. Jämfört med den vilda stammen hämmas uttrycket av genen MoCEL7C i mutanten i CMC-inducerat tillstånd och i icke-inducerat tillstånd (glukos eller cellobiose), uttrycket av MoCEL7C ökade15. I Fusarium graminearumkan KMT6 katalysera metyleringsmodifieringen av H3K27me3, reglera den normala utvecklingen av svampar och hjälpa till att reglera det "kryptiska genomet" som innehåller SM-genklustret16,17,18,19. År 2013 rapporterade Connolly att H3K9 och H3K27 metylering reglerar den patogena svampprocessen genom sekundära metaboliter och effektfaktorer som reglerar hämningen avmålgener 20. I Aspergillusär modifieringen av histonerna H3K4me2 och H3K4me3 relaterad till genaktivering och spelar en viktig roll för att kontrollera kromatinnivåregleringen av SM-genkluster21. I M. oryzaeär Tig1 (homologt till Tig1 i jäst och däggdjur) en HADC (histondeacetylas)22. Knockout av Tig1 genen leder till fullständig förlust av patogenicitet och spor produktion förmåga i null mutant. Det är känsligare för en peroxygen miljö, som inte kan producera smittsam hyphae22.
Risexplosionen orsakad av M. oryzae. är en av de allvarligaste rissjukdomarna i de flesta risodlingsområden i världen19. På grund av sin representativa infektionsprocess liknar M. oryzae infektionsprocessen hos många viktiga patogena svampar. Eftersom det lätt kan utföra molekylärgenetiska operationer har svampen blivit en modellorganism för att studera svampväxtinteraktioner23. Blockering av varje steg i infektionsprocessen av M. oryzae kan leda till misslyckad infektion. De morfologiska förändringarna under infektionsprocessen regleras strikt av hela genomfunktionen och genutskriften. Bland dem spelar epigenetiska modifieringar som histonmetylering en viktig roll i transkriptionsregleringen av funktionellagener 24,25. Hittills har dock få studier gjorts på den molekylära mekanismen för epigenetiska modifieringar såsom histon metylering och histon acetylering i transkription av patogenes gener i M. oryzae. Att vidareutveckla den epigenetiska regleringsmekanismen för rissvampen medan forskning i det överordnade och nedströms regleringsnätverket för dessa patogena relaterade gener kommer därför att bidra till att utveckla strategier för förebyggande och kontroll av risblästring.
Med utvecklingen av funktionell genomik som ChIP-seq, särskilt inom epigenetik, har denna datainsamlingsmetod med hög genomströmning påskyndat forskningen om kromosomer. Med hjälp av chIP-seq-experimentell teknik kan den genomomfattande fördelningen av histonmetylering (såsom H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) i M. oryzae och andra filamentösa svampar identifieras. Därför kan denna metod hjälpa till att belysa de molekylära mekanismerna bakom hur epigenetiska modifieringar reglerar deras kandidatmålgener under svamppatogenes i växtpatologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acidic casein hydrolysate</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>65072-00-6</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar powder</td>
			<td>scientan</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholic acid</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>83-44-3</td>
			<td>protein and dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA End-Repair kit</td>
			<td>NovoBiotec</td>
			<td>ER81050</td>
			<td>Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>no.100.02D</td>
			<td>Binding target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB buffer</td>
			<td>JIMEI</td>
			<td>JC2174</td>
			<td>Membrane and liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9912</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzymatic casein hydrolysate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91079-40-2</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycogen</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>Precipitant action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K4me3 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8580</td>
			<td>Immune response to H3K4me3 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illumina Genome Analyzer</td>
			<td>illumina</td>
			<td>illumina Hiseq 2000</td>
			<td>Large configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina PCR primers</td>
			<td>illumina</td>
			<td>CleanPlex</td>
			<td>Random universal primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoamyl alcohol</td>
			<td>chemical book</td>
			<td>30899-19-5</td>
			<td>Purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9480</td>
			<td>specific removal RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysing enzymes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1412-10G</td>
			<td>cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>36111ES10</td>
			<td>Animal normal immunoglobulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Seebio</td>
			<td>SH30173.08*</td>
			<td>preparation of protein complex eluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85124</td>
			<td>cell lysate to promote cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>The purification procedure removes primers from DNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A32965</td>
			<td>A protein inhibitor that decreases protein activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>DNA Extraction Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>9806S</td>
			<td>cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2271</td>
			<td>Purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9820</td>
			<td>cover up the charge differences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R1181</td>
			<td>Acetic acid buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium deoxycholate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89904</td>
			<td>inhibition of protease degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B69</td>
			<td>DNA ligase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td>buffer action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>HFH10</td>
			<td>keep the membrane protein stable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide analysis of histone modifications distribution using the chromatin immunoprecipitation sequencing method in magnaporthe oryzae

Chromatin immunoprecipitation sekvensering (ChIP-seq) är en kraftfull och allmänt använd molekylär teknik för kartläggning av hela genom platser av transkription faktorer (TFs), kromatin regulatorer och histon modifieringar, samt upptäcka hela genom för att avslöja TF bindande mönster och histon posttranslational modifieringar. Kromatinmodifierande aktiviteter, såsom histonmetylering, rekryteras ofta till specifika genreglerande sekvenser, vilket orsakar lokaliserade förändringar i kromatinstrukturer och resulterar i specifika transkriptionella effekter. Risexplosionen är en förödande svampsjukdom på ris över hela världen och är ett modellsystem för att studera svamp-växtinteraktion. De molekylära mekanismerna i hur histonmodifieringarna reglerar deras virulensgener i Magnaporthe oryzae förblir dock svårfångade. Fler forskare behöver använda ChIP-seq för att studera hur histonepigenetisk modifiering reglerar deras målgener. ChIP-seq används också i stor utsträckning för att studera interaktionen mellan protein och DNA hos djur och växter, men det används mindre inom växtpatologi och har inte utvecklats väl. I detta dokument beskriver vi den experimentella processen och driftmetoden för ChIP-seq för att identifiera genomomfattande fördelning av histonmetylering (såsom H3K4me3) som binder till de funktionella målgenerna i M. oryzae. Här presenterar vi ett protokoll för att analysera genomomfattande fördelning av histonmodifieringar, som kan identifiera nya målgener i patogenesen vid M. oryzae och andra filamentösa svampar.

Hela flödesschemat för ChIP-seq-metoden visas i figur 1. ChIP-seq experiment utfördes med antikroppar mot H3K4me3 i vilda stammen P131 och tre null mutant stammar som saknade mobre2, mospp1, och moswd2 genen för att verifiera hela genom-wide profilen av histon H3K4me3 distribution i M. oryzae. Protoplasterna av den vilda stammen, Δmobre2, Δmospp1och Δmoswd2, förbereddes och sonikerades vid 25% W, utgång 3 s, stopp 5 s, v...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae at JoVE.com

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Här presenterar vi ett protokoll för att analysera genomomfattande fördelning av histonmodifieringar, som kan identifiera nya målgener i patogenesen vid M. oryzae och andra filamentösa svampar.

Genomomfattande analys av fördelning av histonmodifieringar med hjälp av chromatinimmunprecipitationssekvenseringsmetoden i Magnaporthe oryzae

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Denna metod kan hjälpa till att belysa de molekylära mekanismerna bakom regleringen av kandidatmålgener via epigenetiska modifieringar under svamppatogenes i växtpatologi. Chromatin immunoprecipitation sekvensering teknik kan effektivt upptäcka DNA segment som interagerar med histoner och transkription faktorer i hela genomet. Jämfört med andra metoder kan det förbättra effektivitet och upplösning.Börja med att tillsätta 100 mikroliter flytande komplett medium till havregrynstomaten Agger-tallrikar med en 100 mikroliterpipett. Skrapa mycelia av den vilda typstammen och knockoutstammen med hjälp av en inokuleringsslinga. Samla mycelia skräp och överföra dem till 250 milliliter flytande komplett medium.Tvätta svamphyfaen med 500 milliliter 0,7 molar natriumkloridlösning. Samla sedan svampmyceliUM och väg den. Tillsätt ungefär en milliliter lys enzympermeationslösning per ett gram av svampmyceliet.Placera hyphae för att licing på 28 grader Celsius i tre till fyra timmar med skakningar vid 150 RPM. Tvätta den licerade hyfaen med 50 milliliter 0,7 molar natriumkloridlösning. Centrifuga provet och kassera supernaten försiktigt.Suspendera protoplasten igen i 20 milliliter 0,7 molar natriumkloridlösning. Tillsätt 55 mikroliter 37% formaldehydd droppe för droppe till två milliliter natriumkloridbuffert som innehåller protoplaster för korslänkning tills den slutliga koncentrationen är 1%För att släcka den oredovisade formaldehyden, tillsätt 20 mikroliter 10 gånger glycin till varje rör. Kassera supernatanten försiktigt efter centrifugation.Suspendera pelleten igen i en milliliter 0,7 molar natriumkloridlösning. Kassera supernatanten försiktigt efter centrifugering och sätt tillbaka pelleten i 750 mikroliter RIPA-buffert. Tillsätt 37,5 mikroliter med 20 gånger proteashämmare.Shear kromatin genom ultraljudsbehandling i åtta minuter med hjälp av en ultraljud homogenisator. När provet har brutits ultraljud, ta ut en del av provet som insats som innehåller allt DNA och protein som frigörs efter att provet har sonats. För att analysera längden på DNA-fragmenten, kör en 1%agarose gel elektrofores efter ultraljudsbehandling.Efter centrifugering, överför centrifugerad supernatant till ett 1,5 milliliter centrifugeringsrör och förvara det vid negativa 80 grader Celsius för senare användning. Innan du utför IP-experimentet, späd varje kromatinprov till ett förhållande av ett till tio med en gånger RIPA-buffert. Pipett 50 mikroliter superparmagnetiska proteinpärlor i ett två milliliter centrifugeringsrör.Placera rören på ett magnetiskt stativ och låt magnetpärlorna fällas ut. Ta sedan bort supernaten. Tillsätt en milliliter förkylda en gång RIPA-buffert till röret och tvätta superparmagnetiska proteinpärlor tre gånger.Placera rören på ett magnetiskt stativ och ta bort supernaten. Tillsätt 100 mikroliter av en gånger RIPA-buffert till varje rör. Tillsätt 30 mikroliter av kromatinprovet, 100 mikroliter superparmagnetiska proteinpärlor och fyra mikroliter H3K4me3-antikroppar i röret och blanda dem väl.Placera proverna på en roterande skakapparat för att inkubera dem över natten vid fyra grader Celsius vid 30 gånger G.Tvätta den superparmagnetiska proteinpärlans antikropp och kromatinkomplex genom att återanvända pärlorna i en milliliter av en gånger RIPA-buffert. Tvätta provet med en milliliter låg salt immun komplex tvättbuffert, sedan med en milliliter hög salt immun komplex tvättbuffert. Skölj pärlorna med en milliliter litiumkloridbuffert och ta bort supernatanten.Lägg sedan till en milliliter TE-buffert i röret. Placera röret igen med en milliliter TE-buffert och ta bort supernaten med en pipett. Tillsätt 100 mikroliter elueringsbuffert till varje centrifugrör.Utför eluering vid 65 grader Celsius i 15 minuter. Centrifug i en minut vid 10 000 gånger G vid fyra grader Celsius och samla supernaten i nya centrifuger. Tillsätt åtta mikroliter av fem molar natriumklorid till alla rör och inkubera vid 65 grader Celsius i fyra till fem timmar eller över natten för att vända DNA-proteinet korslänkar.Tillsätt en mikroliter Rnase A och inkubera i 30 minuter vid 37 grader Celsius. Tillsätt fyra mikroliter proteinas K till varje rör och inkubera vid 45 grader Celsius i en till två timmar. Tillsätt 550 mikroliter fenalklorid- och isoamylalkoholblandningen i centrifugröret.Centrifug i 15 minuter vid 10 000 gånger G och aspirera supernaten. Tillsätt 1/10 volym av tre molar natriumacetatlösning, 2,5 volymer absolut etanol och tre mikroliter glykogen till röret. Placera provet i kylskåp vid minus 20 grader Celsius över natten för nederbörd.Nästa dag centrifugeras rören och supernaten kasseras. Tvätta pelleten tre gånger med en milliliter nyberedd 75% etanol vid 10 000 gånger G.Add 50 mikroliter sterilt avjoniserat vatten för att tillräckligt lösa upp fällningen. Reparera DNA-ändarna för att generera trubbigt slut DNA med hjälp av ett DNA-slutreparationskit och instruktioner som nämns i textmanuskriptet.För att lägga till adeninbasis till de tre främsta ändarna, tillsätt 30 mikroliter DNA, två mikroliter vatten, fem mikroliter med 10 gånger Taq-buffert, 10 mikroliter av en millimolar dATP och tre mikroliter Taq DNA-polymeras till ett 0,2 mikroliter PCR-centrifugerör. Blanda dem och reagera i en PCR-maskin vid 72 grader Celsius i 10 minuter. Utför linker ligatur genom att blanda 10 mikroliter DNA, 9,9 mikroliter vatten, 2,5 mikroliter T4 DNA-ligasbuffert, 0,1 mikroliter adapter oligoblandning och 2,5 mikroliter T4 DNA-ligas i ett 0,2 mikroliter PCR-centrifugerrör.Inkubera röret vid 16 grader Celsius i fyra timmar. För att förstärka DNA med PCR-primers, tillsätt 10,5 mikroliter DNA, 12,5 mikroliter två gånger hög återgivningsmästarblandning. en mikroliter PCR primer PE 1.0 och en mikroliter PCR primer PE 2.0 till ett 0,2 mikroliter PCR centrifuge rör och blanda väl.H3K4me3 signaler av mobre2, mospp1 och moswd2 borttagning mutanter minskade betydligt i dess funktionella mål regioner. Jämfört med den vilda typ stam P131, signalerna av berikade H3K4me3 chromatin immunoprecipitation sekvensering läser i mobre2, mospp1 och moswd2 borttagning mutanter minskades i stor utsträckning. Efter denna procedur kan chip på chip och chip qPCR utföras.De används i allmänhet för att screena målgenen nedströms av ett protein och studera protein-DNA-interaktioner på kända genombindningsställen.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Genetics

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Unit 1

Structure and Organization of DNA

SCIENTISTS IN ACTION

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genomvid Fastställande av däggdjur Replication Timing av DNA-innehåll Mätning

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analys av c-KIT-ligand-promotorn med användning av kromatinimmunfällning

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Kromatinimmunutfällning (ChIP) i mus-T-celllinjer

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generation av infödda kromatin Immunoprecipitation sekvensering bibliotek för Nucleosome densitet analys

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokoll för låg-överflöd embryonala prover

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Mappning av Genome-wide tillgängliga kromatin i primära humana T-lymfocyter av ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation av Genome-wide kromatin konformation fånga bibliotek från tätt stegvis tidiga Drosophila embryon

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) Histon ändringar från Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Arrangören Capture-C: Högupplösta, Genome-wide profilering av promotorn interaktioner

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genome-wide övervakning av transkription fel i eukaryota organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...