Name: genome-wide analysis of histone modifications distribution using the chromatin immunoprecipitation sequencing method in magnaporthe oryzae
Uploaded: 2021-06-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (grant no. 31871638), Pekin Tarım Üniversitesi Özel Bilimsel Araştırma Projesi (YQ201603), Pekin Eğitim Komitesi Bilimsel Projesi (KM201610020005), BUA'nın üst düzey bilimsel araştırma yetiştirme projesi (GJB2021005) tarafından desteklendi.

1. M. oryzae'den protoplastların hazırlanması
<ol><li>Yulaf ezmesi-domates agarını (OTA) hazırlayın.<ol>
<li>30-50 gr yulaf ezmesi ağırlığında ve 800 mL suda (ddH2O) 20 dakika kaynatın. İki kat gazlı bezle filtreleyin ve filtrat alın.</li>
		<li>Olgun domatesleri toplayın ve soyun. Suyu sıkın ve süzülen meyve suyunun 150 mL'lik kısmını toplamak için iki kat gazlı bezle filtreleyin.</li>
		<li>Tüm domates suyunu ve hazırlanan yulaf filtratını iyice karıştırın ve 1000...

<ol>
	<li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+structure:+are+repeating+unit+of+histones+and+DNA.">Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184 (4139), 868-871 (1974).</li><li>Luger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosomecore+particle+at+2.8+a+resolution.">Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Strathl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li><li>Lachner, M., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+histone+lysine+methylation.">The many faces of histone lysine methylation.</a> Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).</li><li>Bhaumik, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+modifications+of+histones+during+development+and+disease+pathogenesis.">Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).</li><li>Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+implementation+and+physiological+roles+for+histone+H3+lysine+4+(H3K4)+methylation.">Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).</li><li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription.">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).</li><li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+epigenome.">The mammalian epigenome.</a> Cell. 128 (4), 669-681 (2007).</li><li>Weake, V. M., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+ubiquitination:+triggering+gene+activity.">Histone ubiquitination: triggering gene activity.</a> Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).</li><li>Workman, J. L., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+nucleosome+structure+as+a+mechanism+of+transcriptional+regulation.">Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li><li>Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+from+limited+starting+material+of+K562+cells+and+Drosophila+neuroblasts+using+tagmentation+assisted+fragmentation+approach.">ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach.</a> Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).</li><li>Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+comparison+of+tools+of+differential+ChIP-seq+analysis.">A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).</li><li>Kieu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MoSET1+(histone+H3K4+methyltransferase+in+Magnaporthe+oryzae)+regulates+global+gene+expression+during+infection-related+morphogenesis.">MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis.</a> Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).</li><li>Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-induced+transcriptional+activation+of+the+MoCel7C+cellulase+gene+is+associated+with+methylation+of+histone+H3+at+lysine+4+in+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).</li><li>Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+trail+of+a+cereal+killer:+recent+advances+in+Fusarium+graminearum+pathogenomics+and+host+resistance.">On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).</li><li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMT1+arginine+methyltransferase+gene+is+important+for+plant+infection+and+normal+hyphal+growth+in+Fusarium+graminearum.">The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum.</a> PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3K4+methylation+regulates+hyphal+growth,+secondary+metabolism+and+multiple+stress+responses+in+Fusarium+graminearum.">Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum.</a> Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).</li><li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+infection+test:+spray+and+wound-mediated+inoculation+with+the+plant+pathogen+Magnaporthe+grisea.">The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).</li><li>Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fusarium+graminearum+histone+H3K27+methyltransferase+KMT6+regulates+development+and+expression+of+secondary+metabolite+gene+clusters.">The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters.</a> PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).</li><li>Palmer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CclA,+required+for+histone+3+lysine+4+methylation,+decreases+growth+but+increases+secondary+metabolite+production+in+Aspergillus+fumigatus.">Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus.</a> PeerJ. 1, 4 (2013).</li><li>Ding, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tig1+histone+deacetylase+complex+regulates+infectious+growth+in+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).</li><li>Dean, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+grisea.">The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.</a> Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).</li><li>Allis, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+nomenclature+for+chromatin-modifying+enzymes.">New nomenclature for chromatin-modifying enzymes.</a> Cell. 131 (4), 633-636 (2007).</li><li>Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COMPASS+family+of+histone+H3K4+methylases:+mechanisms+of+regulation+in+development+and+disease+pathogenesis.">The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis.</a> Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).</li><li>Zhou, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COMPASS-like+complex+modulates+fungal+development+and+pathogenesis+by+regulating+H3K4me3-mediated+targeted+gene+expression+in+Magnaporthe+oryzae.">The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae.</a> Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).</li></ol>

Son zamanlarda, ChIP-seq, belirli histonlar tarafından değiştirilen TF'lerin veya zenginleştirme sitelerinin bağlama alanlarını belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir genomik analiz yöntemi haline gelmiştir. Önceki ChIP-seq teknolojisine kıyasla, yeni ChIP-seq teknolojisi son derece hassas ve esnektir. Sonuçlar, nükleik asitlerin spesifik olmayan melezleştirilmesinden kaynaklanan gürültü sinyali gibi olumsuz etkiler olmadan yüksek çözünürlükte sağlanır. Bu yaygın bir gen ekspresyon anal...

Epigenetik, genlerin nükleotid dizisini değiştirmeden gen ekspresyonunun kalıtsal değişimini ifade eden bir genetik araştırma dalıdır. Giderek artan sayıda çalışma, epigenetik regülasyonun, daha yüksek sıralı yapılara katlama ve montaj dinamik süreci ile gen ekspresyonını düzenleyen ve etkileyen kromatin de dahil olmak üzere ökaryotik hücrelerin büyümesinde ve gelişmesinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir1,2. Kromatin remodeling ve kovalent histone modifikasyonu kromatin polimerlerinin varyasyonu yoluyla kromatin fonksiyonunu ve yapısını etkiler ve düzenler, böylece gen ekspresyonunu düzenlemeişlevineulaşılır 3 ,4,5,6. Histone posttransilasyon modifikasyonları arasında asetilasyon, fosforilasyon, metilasyon, monoubiquitination, sumoylation ve ADP ribosilasyon7,8,9bulunur. Histone H3K4 metilasyonu, özellikle trimetilasyon, ökaryot 10,11'detranskripsiyon replikasyonu, rekombinasyon, onarım ve RNA işleme ile ilişkili olduğu transkripsiyon başlangıç sitelerine eşlenmiştir.
ChIP-seq teknolojisi 2007 yılında piyasaya sürlenmiştir ve transkripsiyonel regülasyon ve epigenetik mekanizmaların genom çapında analizi için deneysel standart haline gelmiştir12,13. Bu yöntem genom çapında ölçekte ve DNA bağlayıcı proteinlerin DNA segmentleri de dahil olmak üzere histone veya transkripsiyon faktörü etkileşim bilgilerini elde etmek için uygundur. İlgi çekici proteinlere çapraz bağlı dna dizileri kromatin kompleksinin bir parçası olarak bir arada olacaktır. Yeni nesil dizileme teknikleri, daha sonra ilgili hedef genomla eşleşen 36-100 bp DNA'yı sıralamak için de kullanılır.
Fitopatojenik mantarlarda, araştırmalar son zamanlarda histone metilasyon modifikasyonlarının patojeniklik sürecinde hedef genlerini nasıl düzenlediğini incelemeye başlamıştır. Daha önceki bazı çalışmalar, histone metil ile ilgili genlerin düzenlenmesinin esas olarak sekonder metabolitlerin (SM) üretiminin gen susturma ve katalzingine yansıdığını kanıtlamıştır. MoSet1, M. oryzae'deki H3K4 metilatlazıdır. Bu genin nakavtı, H3K4me3 modifikasyonunun tamamen silinmesine neden olur14. Vahşi tip suşla karşılaştırıldığında, mutanttaki MoCEL7C geninin ekspresyolü CMC kaynaklı durumda ve indüklenmemiş durumda (glikoz veya selobiyoz) inhibe edilir, MoCEL7C ekspresyolü15arttı . Fusarium graminearumdaKMT6, H3K27me3'ün metilasyon modifikasyonuna kataliz edebilir, mantarların normal gelişimini düzenleyebilir ve SM gen kümesi16 , 17 , 18,19'uiçeren "şifreli genomu" düzenlemeye yardımcı olabilir. 2013 yılında Connolly, H3K9 ve H3K27 metilasyonunun, hedef genlerin inhibisyonunu düzenleyen ikincil metabolitler ve efektör faktörler yoluyla mantarların patojenik sürecini düzenlediğini bildirdi20. Aspergillus'ta,H3K4me2 ve H3K4me3 histonlarının modifikasyonu gen aktivasyonu ile ilgilidir ve SM gen kümelerinin kromatin seviyesi regülasyonunun kontrolinde önemli bir rol oynar21. M. oryzae, Tig1 (maya ve memelilerde Tig1'e homolog) bir HADC (histone deacetylase)22. Tig1 geninin nakavtı, boş mutantta patojenite ve spor üretim yeteneğinin tamamen kaybına yol açar. Enfektif hyphae22üretemeyen peroksijen ortamına karşı daha hassastır.
M. oryzae.'nin neden olduğu pirinç patlaması, dünyadaki çoğu pirinç yetiştirme alanında en ciddi pirinç hastalıklarından biridir19. Temsili enfeksiyon süreci nedeniyle, M. oryzae birçok önemli patojenik mantarın enfeksiyon sürecine benzer. Moleküler genetik operasyonları kolayca gerçekleştirebildiği için, mantar mantar-bitki etkileşimlerini incelemek için örnek bir organizma haline gelmiştir23. M. oryzae enfeksiyon sürecinin her adımını bloke edilmesi başarısız enfeksiyona neden olabilir. Enfeksiyon sürecindeki morfolojik değişiklikler, tüm genom fonksiyonu ve gen transkripsiyonu tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. Bunlar arasında, histone metilasyonu gibi epigenetik modifikasyonlar fonksiyonel genlerin transkripsiyonel düzenlenmesinde önemli bir rol oynar24,25. Bununla birlikte, M. oryzae'deki patogenez genlerinin transkripsiyonunda histone metilasyonu ve histone asetilasyonu gibi epigenetik modifikasyonların moleküler mekanizması üzerinde şimdiye kadar çok az çalışma yapılmıştır. Bu nedenle, bu patojenik ilgili genlerin yukarı ve aşağı akış düzenleyici ağını araştırırken pirinç patlaması mantarının epigenetik düzenleme mekanizmasının daha da geliştirilmesi, pirinç patlaması önleme ve kontrol stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.
ChIP-seq gibi fonksiyonel genomiklerin gelişmesiyle, özellikle epigenetikte, bu yüksek verimli veri toplama yöntemi kromozomlar üzerine araştırmaları hızlandırmıştır. ChIP-seq deneysel teknolojisini kullanarak, M. oryzae ve diğer filamentli mantarlarda histone metilasyonunun (H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3 gibi) genom çapındaki dağılımı tanımlanabilir. Bu nedenle, bu yöntem, epigenetik değişikliklerin bitki patolojisinde mantar patogenezinde aday hedef genlerini nasıl düzenlediğinin altında bulunan moleküler mekanizmaların aydınlatıcı yapılmasına yardımcı olabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acidic casein hydrolysate</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>65072-00-6</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar powder</td>
			<td>scientan</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholic acid</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>83-44-3</td>
			<td>protein and dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA End-Repair kit</td>
			<td>NovoBiotec</td>
			<td>ER81050</td>
			<td>Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>no.100.02D</td>
			<td>Binding target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB buffer</td>
			<td>JIMEI</td>
			<td>JC2174</td>
			<td>Membrane and liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9912</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzymatic casein hydrolysate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91079-40-2</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycogen</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>Precipitant action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K4me3 antibodies</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8580</td>
			<td>Immune response to H3K4me3 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illumina Genome Analyzer</td>
			<td>illumina</td>
			<td>illumina Hiseq 2000</td>
			<td>Large configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina PCR primers</td>
			<td>illumina</td>
			<td>CleanPlex</td>
			<td>Random universal primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoamyl alcohol</td>
			<td>chemical book</td>
			<td>30899-19-5</td>
			<td>Purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9480</td>
			<td>specific removal RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysing enzymes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1412-10G</td>
			<td>cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>36111ES10</td>
			<td>Animal normal immunoglobulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Seebio</td>
			<td>SH30173.08*</td>
			<td>preparation of protein complex eluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85124</td>
			<td>cell lysate to promote cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>The purification procedure removes primers from DNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitors</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A32965</td>
			<td>A protein inhibitor that decreases protein activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2546</td>
			<td>DNA Extraction Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>9806S</td>
			<td>cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2271</td>
			<td>Purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9820</td>
			<td>cover up the charge differences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R1181</td>
			<td>Acetic acid buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium deoxycholate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89904</td>
			<td>inhibition of protease degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B69</td>
			<td>DNA ligase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td>buffer action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>HFH10</td>
			<td>keep the membrane protein stable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Medium configuration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide analysis of histone modifications distribution using the chromatin immunoprecipitation sequencing method in magnaporthe oryzae

Kromatin immünorektasyon dizilimi (ChIP-seq), transkripsiyon faktörlerinin (TF'ler), kromatin düzenleyicilerinin ve histone modifikasyonlarının tüm genom konumlarını haritalamak ve TF bağlama kalıplarını ve histone posttranslational modifikasyonlarını ortaya çıkarmak için tüm genomları tespit etmek için güçlü ve yaygın olarak kullanılan bir moleküler tekniktir. Histone metilasyonu gibi kromatin değiştirme faaliyetleri genellikle belirli gen düzenleyici dizilere alınarak kromatin yapılarında lokalize değişikliklere neden olmakta ve belirli transkripsiyon etkilerine neden olmaktadır. Pirinç patlaması, dünya çapında pirinç üzerinde yıkıcı bir mantar hastalığıdır ve mantar bitki etkileşimini incelemek için örnek bir sistemdir. Bununla birlikte, histone modifikasyonlarının Magnaporthe oryzae'deki virülans genlerini nasıl düzenlediğine dair moleküler mekanizmalar zor kalır. Daha fazla araştırmacı, histone epigenetik modifikasyonun hedef genlerini nasıl düzenlediğini incelemek için ChIP-seq'i kullanmaktadır. ChIP-seq, hayvanlarda ve bitkilerde protein ve DNA arasındaki etkileşimi incelemek için de yaygın olarak kullanılır, ancak bitki patolojisi alanında daha az kullanılır ve iyi gelişmemiştir. Bu yazıda, M. oryzae'deki fonksiyonel hedef genlere bağlanan histone metilasyonunun (H3K4me3 gibi) genom çapındaki dağılımını tanımlamak için ChIP-seq'in deneysel sürecini ve çalışma yöntemini açıklıyoruz. Burada, M. oryzae ve diğer filamentli mantarların patogenezinde yeni hedef genleri tanımlayabilen histone modifikasyonlarının genom çapındaki dağılımını analiz etmek için bir protokol sunuyoruz.

ChIP-seq yönteminin tüm akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. ChIP-seq deneyleri, vahşi tip Suş P131'de H3K4me3'e karşı antikorlar ve M. oryzae'dekihistone H3K4me3 dağılımının tüm genom çapındaki profilini doğrulamak için mobre2, mospp1ve moswd2 genlerinden yoksun üç boş mutant suşu kullanılarak gerçekleştirildi. Vahşi tip suşun protoplastları, Δmobre2, Δmospp1ve Δmoswd2, % 25 W, çıkış 3 s...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae at JoVE.com

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Burada, M. oryzae ve diğer filamentli mantarların patogenezinde yeni hedef genleri tanımlayabilen histone modifikasyonlarının genom çapındaki dağılımını analiz etmek için bir protokol sunuyoruz.

Magnaporthe oryzae'de Kromatin İmmün Önkapipitasyon Dizileme Yöntemi Kullanılarak Histone Modifikasyonlarının Genom Çapında Analizi

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Bu yöntem, bitki patolojisinde mantar patogenezinde epigenetik değişikliklerle aday hedef genlerin düzenlenmesinin altında bulunan moleküler mekanizmaların aydınlatıcı yapılmasına yardımcı olabilir. Kromatin immünorektasyon dizileme teknolojisi, tüm genomdaki histonlar ve transkripsiyon faktörleriyle etkileşime giren DNA segmentlerini verimli bir şekilde tespit edebilir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, verimliliği ve çözünürlüğü artırabilir.100 mikrolitre pipet kullanarak yulaf ezmesi domates Agger plakalarına 100 mikrolitre sıvı tam orta ekleyerek başlayın. Bir aşılama döngüsü kullanarak, vahşi tip suşunun ve nakavt suşunun miselini kazıyın. Misel kalıntılarını toplayın ve 250 mililitre sıvı tam ortasına aktarın.Mantar hyphae'yi 500 mililitre 0,7 molar sodyum klorür çözeltisi ile yıkayın. Sonra mantar miselUM'ını toplayın ve tartın. Mantar miselyumunun bir gramı başına yaklaşık bir mililitre lizis enzim geçirgenliği çözeltisi ekleyin.28 santigrat derecede dilimleme için hyphae'yi 150 RPM'de sallanarak üç ila dört saat boyunca yerleştirin. Bit hyphae'yi 50 mililitre 0.7 molar sodyum klorür çözeltisi ile yıkayın. Örneği santrifüj edin ve süpernatantı dikkatlice atın.Protoplast'ı 20 mililitre 0,7 molar sodyum klorür çözeltisinde yeniden askıya alın. Son konsantrasyon% 1 olana kadar çapraz bağlantı için protoplastlar içeren iki mililitre sodyum klorür tamponuna damla damla 37% formaldehitin 55 mikrolitresini ekleyin, reaktif olmayan formaldehiti söndürmek için, her tüpe 10 kat glisin 20 mikrolitre ekleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatantı dikkatlice atın.Peleti 0,7 molar sodyum klorür çözeltisinin bir mililitresinde yeniden askıya alın. Santrifüjlemeden sonra süpernatantı dikkatlice atın ve peletin 750 mikrolitre RIPA tamponunda yeniden askıya alın. 20 kat proteaz inhibitörünün 37,5 mikrolitresini ekleyin.Ultrasonik homojenizatör kullanarak kromatin sekiz dakika boyunca sonication ile yamum. Örnek ultrasonik olarak kırıldıktan sonra, numune sonicated sonra serbest tüm DNA ve protein içeren giriş olarak numunenin bir kısmını dışarı alın. DNA parçalarının uzunluğunu analiz etmek için sonikasyondan sonra %1 agarose jel elektroforezi çalıştırın.Santrifüjlemeden sonra, santrifüjlü süpernatantı 1,5 mililitre santrifüj tüpüne aktarın ve daha sonra kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede saklayın. IP denemesini gerçekleştirmeden önce, her kromatin örneğini bir kez RIPA arabelleği ile bir ila 10 arasında bir orana seyreltin. Pipet 50 mikrolitre süper paramanyetik protein boncukları iki mililitre santrifüj tüpüne.Tüpleri manyetik bir standa yerleştirin ve manyetik boncukların çökeltilmesine izin verin. Sonra üsttekini çıkarın. Tüpe bir mililitre önceden soğutulmuş ripa tamponu ekleyin ve süper paramanyetik protein boncuklarını üç kez yıkayın.Tüpleri manyetik bir standa yerleştirin ve üst standı çıkarın. Her tüpe bir kez RIPA tamponunun 100 mikrolitresini ekleyin. Kromatin örneğinin 30 mikrolitresini, 100 mikrolitre süper paramanyetik protein boncukunu ve tüpe dört mikrolitre H3K4me3 antikoru ekleyin, iyice karıştırın.Örnekleri bir döner çalkalayıcıya yerleştirin ve dört santigrat derecede 30 kez kuluçkaya yatırın.Boncukları bir mililitre ripa tamponunda yeniden yağlayarak süper paramanyetik protein boncuk antikorunu ve kromatin kompleksini yıkayın. Numuneyi bir mililitre düşük tuz immün kompleks yıkama tamponu ile, ardından bir mililitre yüksek tuz immün kompleks yıkama tamponu ile yıkayın. Boncukları bir mililitre lityum klorür tamponu ile durulayın ve süpernatant çıkarın.Ardından tüpe bir mililitre TE arabelleği ekleyin. Tüpü bir mililitre TE arabelleği ile tekrar yerleştirin ve bir pipetle üstnatant çıkarın. Her santrifüj tüpüne 100 mikrolitre elüjör tamponu ekleyin.15 dakika boyunca 65 santigrat derecede elution gerçekleştirin. Dört santigrat derecede 10.000 kez G'de bir dakika santrifüj ve süpernatantı yeni santrifüj tüplerine toplayın. Tüm tüplere beş azı dişi sodyum klorürün sekiz mikrolitresini ekleyin ve DNA proteini çapraz bağlantılarını tersine çevirmek için dört ila beş saat veya bir gecede 65 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Bir mikroliter Rnase A ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Her tüpe dört mikrolitre protein K ekleyin ve bir ila iki saat boyunca 45 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Santrifüj tüpüne fenal kloroform ve izoamil alkol karışımından 550 mikrolitre ekleyin.10.000 kez G'de 15 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı aspire edin. Tüpe 1/10 hacimli üç azı dişi sodyum asetat çözeltisi, 2,5 cilt mutlak etanol ve üç mikrolitre glikojen ekleyin. Numuneyi yağış için gece boyunca eksi 20 santigrat derecede bir buzdolabına yerleştirin.Ertesi gün, tüpleri santrifüj edin ve süpernatantı atın. Pelezi üç kez bir mililitre taze hazırlanmış% 75 etanol ile 10.000 kez yıkayın G.Çökeltmeyi yeterince çözmek için 50 mikrolitre steril deiyonize su ekleyin. DNA uçlarını onararak DNA ucu onarım kiti ve metin el yazmasında belirtilen talimatlar kullanarak kör uçlu DNA oluşturmak için.Üç asal uca adenin temeli eklemek için, 0,2 mikrolitre PCR santrifüj tüpüne 30 mikrolitre DNA, iki mikrolitre su, 10 kat Taq tamponunun beş mikrolitresi, bir milimolar dATP'nin 10 mikrolitresi ve üç mikrolitre Taq DNA polimeraz ekleyin. Bunları karıştırın ve 10 dakika boyunca 72 santigrat derecede bir PCR makinesinde reaksiyona sokabilirsiniz. 0,2 mikrolitre PCR santrifüj tüpünde 10 mikrolitre DNA, 9,9 mikrolitre su, 2,5 mikrolitre T4 DNA ligaz tamponu, 0,1 mikrolitre adaptör oligo karışımı ve 2,5 mikrolitre T4 DNA ligase karıştırarak bağlayıcı ligasyon gerçekleştirin.Tüpü 16 santigrat derecede dört saat kuluçkaya yatır. PCR astarlarını kullanarak DNA'yı yükseltmek için 10,5 mikrolitre DNA, iki kat yüksek doğrulukta ana karışımın 12,5 mikrolitresini ekleyin. bir mikroliter PCR astar PE 1.0 ve bir mikroliter PCR astar PE 2.0 ila 0.2 mikroliter PCR santrifüj tüpü ve iyice karıştırın.Mobre2, mospp1 ve moswd2 silme mutantlarının H3K4me3 sinyalleri fonksiyonel hedef bölgelerinde önemli ölçüde azaldı. P131 vahşi tip suşu ile karşılaştırıldığında, mobre2, mospp1 ve moswd2 silme mutantlarında zenginleştirilmiş H3K4me3 kromatin immünorepipitasyon diziliminin sinyalleri büyük ölçüde azaldı. Bu işlemin ardından çip ve talaş qPCR üzerinde çip işlemi yapılabilir.Genellikle bir proteinin aşağı akış hedef genini taramak ve bilinen genom bağlama bölgelerindeki protein DNA etkileşimlerini incelemek için kullanılırlar.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Genetics

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Unit 1

Structure and Organization of DNA

SCIENTISTS IN ACTION

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Birincil insan T lenfositler tarafından ataç-Seq genom genelinde erişilebilir Kromatin eşleme

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Genom çapında kromatin Conformation yakalama kitaplıklardan sıkıca aşamalı erken Drosophila embriyo nesil

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histon değişiklikler Saccharomyces cerevisiae üzerinden Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Organizatörü yakalama Merhaba-C: Yüksek çözünürlüklü, genom çapında organizatörü etkileşimlerin profil oluşturma

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...