Name: exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv
Uploaded: 2022-03-05T13:00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

وقد دعمت هذا العمل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (المنح 31003A_166412 و314730_188877).

<ol>
	<li>Machnicka, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways--2013+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways--2013 update.</a> Nucleic Acids Research. 41, 262-267 (2013).</li><li>Zaccara, S., Ries, R. J., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading,+writing+and+erasing+mRNA+methylation.">Reading, writing and erasing mRNA methylation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 608-624 (2019).</li><li>Davalos, V., Blanco, S., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Messenger+RNA+Modifications.">SnapShot: Messenger RNA Modifications.</a> Cell. 174 (2), 498 (2018).</li><li>Saletore, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+birth+of+the+Epitranscriptome:+deciphering+the+function+of+RNA+modifications.">The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).</li><li>Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications.">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2017).</li><li>Netzband, R., Pager, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+marks:+Emerging+modulators+of+RNA+virus+gene+expression.">Epitranscriptomic marks: Emerging modulators of RNA virus gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (3), 1576 (2020).</li><li>Pereira-Montecinos, C., Valiente-Echeverria, F., Soto-Rifo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+regulation+of+viral+replication.">Epitranscriptomic regulation of viral replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (4), 460-471 (2017).</li><li>Lichinchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+human+and+viral+m(6)A+RNA+methylomes+during+HIV-1+infection+of+T+cells.">Dynamics of the human and viral m(6)A RNA methylomes during HIV-1 infection of T cells.</a> Nature Microbiology. 1, 16011 (2016).</li><li>Courtney, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+Addition+of+m(5)C+to+HIV-1+Transcripts+Regulates+Viral+Gene+Expression.">Epitranscriptomic Addition of m(5)C to HIV-1 Transcripts Regulates Viral Gene Expression.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).</li><li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+m(6)A+Editing+of+HIV-1+mRNAs+Enhances+Viral+Gene+Expression.">Posttranscriptional m(6)A Editing of HIV-1 mRNAs Enhances Viral Gene Expression.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 675-685 (2016).</li><li>Tirumuru, N., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+envelope+proteins+up-regulate+N+(6)-methyladenosine+levels+of+cellular+RNA+independently+of+viral+replication.">HIV-1 envelope proteins up-regulate N (6)-methyladenosine levels of cellular RNA independently of viral replication.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3249-3260 (2019).</li><li>Tirumuru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+of+HIV-1+RNA+regulates+viral+infection+and+HIV-1+Gag+protein+expression.">N(6)-methyladenosine of HIV-1 RNA regulates viral infection and HIV-1 Gag protein expression.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell.">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> Frontiers in Virology. 1 (11), (2021).</li><li>Khoddami, V., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+target+profiling+of+RNA+cytosine+methyltransferases+using+the+mechanism-based+enrichment+procedure+Aza-IP.">Transcriptome-wide target profiling of RNA cytosine methyltransferases using the mechanism-based enrichment procedure Aza-IP.</a> Nature Protocols. 9 (2), 337-361 (2014).</li><li>Hussain, S., Aleksic, J., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (11), 215 (2013).</li><li>Dominissini, D., Moshitch-Moshkovitz, S., Salmon-Divon, M., Amariglio, N., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+mapping+of+N6-methyladenosine+by+m6A-seq+based+on+immunocapturing+and+massively+parallel+sequencing.">Transcriptome-wide mapping of N6-methyladenosine by m6A-seq based on immunocapturing and massively parallel sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (1), 176-189 (2013).</li><li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq.">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li><li>Shobbir Hussain, J. A., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (215), (2013).</li><li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+5-methylcytosine+profiles+in+poly(A)+RNA+from+mouse+embryonic+stem+cells+and+brain.">Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain.</a> Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).</li><li>Endrullat, C., Gl&#246;kler, J., Franke, P., Frohme, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+and+quality+management+in+next-generation+sequencing.">Standardization and quality management in next-generation sequencing.</a> Applied &amp; Translational Genomics. 10, 2-9 (2016).</li><li>Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+cytosine+methylation+analysis+by+bisulfite+sequencing.">RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 12 (2009).</li><li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell.">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> biorxiv. 1 (11), (2021).</li><li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+noncoding+RNA.">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and noncoding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li><li>Aschenbrenner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+DNA+Polymerase+for+Direct+m(6)+A+Sequencing.">Engineering of a DNA Polymerase for Direct m(6) A Sequencing.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 57 (2), 417-421 (2018).</li><li>Didion, J. P., Martin, M., Collins, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atropos:+specific,+sensitive,+and+speedy+trimming+of+sequencing+reads.">Atropos: specific, sensitive, and speedy trimming of sequencing reads.</a> PeerJ. 5, 3720 (2017).</li><li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISAT:+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements.">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Okonechnikov, K., Conesa, A., Garc&#237;a-Alcalde, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualimap+2:+advanced+multi-sample+quality+control+for+high-throughput+sequencing+data.">Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., K&#228;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet Journal. 17 (1), (2011).</li><li>Shen, W., Le, S., Li, Y., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeqKit:+A+Cross-Platform+and+Ultrafast+Toolkit+for+FASTA/Q+File+Manipulation.">SeqKit: A Cross-Platform and Ultrafast Toolkit for FASTA/Q File Manipulation.</a> PLOS ONE. 11 (10), 0163962 (2016).</li><li>Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=meRanTK:+methylated+RNA+analysis+ToolKit.">meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit.</a> Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

دور تعديلات الحمض النووي الريبي في العدوى الفيروسية لا يزال غير معروف إلى حد كبير. ويمكن أن يسهم فهم أفضل لدور التعديلات العلاجية في سياق العدوى الفيروسية في السعي إلى تحقيق أهداف جديدة للعلاج المضاد للفيروسات.
في هذا العمل، ونحن نقدم سير العمل الكامل الذي يسمح التحقيق في epitranscriptomes M6A و M5C من الخلايا المصابة. اعتمادا على المسألة البيولوجية، ونحن ننصح باستخدام الحمض النووي الريبي متعدد-A-اختيار كمادة البداية. وعلى الرغم من أن خط الأنابيب اختياري، حيث يمكن استخدامه مع إجمالي الحمض النووي الريبي، فمن المهم أن نضع في اعتبارنا أن الحمض النووي الريبي وكذلك الحمض النووي الريبي الصغير معدلان بدرجة عالية ويحتويان على عدد مهم من المخلفات الميثيلية. وقد يؤدي ذلك إلى انخفاض نوعية وكمية بيانات التسلسل المجدية.
ومع ذلك ، إذا كان تركيز الدراسة هو الحمض النووي الريبي غير متعدد adenylated ، ينبغي تكييف خطوة استخراج الحمض النووي الريبي من أجل تجنب التخلص من الحمض النووي الريبي الصغيرة (في حالة استخراج الحمض النووي الريبي القائم على العمود) وامتياز تقنيات استنفاد الريبوسوم بدلا من اختيار البولي ألف لدخول خط الأنابيب.
من أجل ضمان جودة عالية RNA، تجزئة الصحيح ومناسبة M6A المخصب وBS تحويل جودة الحمض النووي الريبي لإعداد المكتبة ننصح بشدة لاستخدام محلل جزء أو محلل حيوي. ومع ذلك، هذه المعدات غير متوفرة دائما. كبديل، يمكن أيضا تقييم جودة الحمض النووي الريبي، ميرنا وحجم الحمض النووي الريبي المجزأة من خلال التصور على هلام الآغاروز. بدلا من ذلك، يمكن إجراء إعداد المكتبة دون تقييم سابق لكمية الحمض النووي الريبي.
استخدمنا تقنية MeRIP-Seq16 المستندة إلى الأجسام المضادة لاستكشاف المناظر الطبيعية epitranscriptomic m6A. وتستند هذه التقنية على الريبي النووي الريبي المناعية وناجحة; ومع ذلك، تحتاج بعض الخطوات التحسين دقيق ويمكن أن تكون حاسمة. على الرغم من أن ميثيل M6A قد وصف بأنه يحدث بشكل رئيسي ضمن تسلسل التوافق RRA * CH ، إلا أن هذا الشعار متكرر للغاية على طول جزيئات مرنا ولا يسمح بتحديد دقيق للموقع الميثيلي. ومن ثم، من الأهمية بمكان تحقيق تجزؤ الحمض النووي الريبي القابل للاستنساخ ومتسق، وتوليد شظايا صغيرة من الحمض النووي الريبي، لتحسين القرار القائم على RIP. في هذا البروتوكول، نوصي بإجراء محسن، يوفر نتائج قابلة للاستنساخ ومتسقة في إطارنا التجريبي؛ ومع ذلك، قد تحتاج هذه الخطوة التجزئة تحسين إضافية وفقا لميزات عينة معينة.
في الآونة الأخيرة تم وصف تقنية جديدة تسمح تسلسل مباشر M6A. وهو يستند إلى استخدام متغيرات محددة للنسخ العكسي التي تعرض توقيعات RT الفريدة كرد على مواجهة تعديل الحمض النووي الريبي M6A24. هذه التكنولوجيا ، عند التحسين الدقيق ، يمكن أن تتحايل على القيود الرئيسية التي تواجهها MeRIP-Seq (تقليل كمية المواد الأولية والسماح بدقة أعلى). لاستكشاف تعديل M5C قررنا استخدام تقنية تحويل بيسلفايت من أجل الكشف في قرار النيوكليوتيدات بقايا C المعدلة. من أجل الحد من معدل إيجابي كاذبة بسبب وجود هياكل ثانوية الجيش الملكي النيبالي، قمنا بإجراء 3 دورات من تحويل التشبع / bisulfite ومزيد من التحكم bisulfite أداء معدل التحويل بفضل استخدام ERCC ارتفاع في الضوابط. أحد القيود المرتبطة بهذه التقنية هو أن تحويل البيسلفيت قاسي للغاية وثلاث دورات من تحويل التشبع / البيسلفيت يمكن أن تتحلل بعض الحمض النووي الريبي وبالتالي تقليل الدقة. ومع ذلك، اخترنا في إطارنا أن نرضى بدقة أقل قليلا من أجل زيادة جودة مجموعة البيانات.
وبفضل هذه التحسينات والضوابط، تمكنا من توفير سير عمل موثوق وسليم يمكن استغلاله للتحقيق في المشهد epitranscriptomic وتغييره في سياق العدوى الفيروسية، والتفاعلات المضيفة الممرضة، أو أي التعرض لعلاجات محددة.

ومن المعروف منذ فترة طويلة أنه يمكن تعديل جزيئات الحمض النووي الريبي، وقد تم وصف أكثر من 150 تعديلا بعد النسخ حتى الآن1. وهي تتكون في إضافة مجموعات كيميائية، وأساسا مجموعات الميثيل، إلى أي موقف تقريبا من حلقات البيريميدين والبوريين من جزيئات الحمض النووي الريبي2. وقد ثبت بالفعل أن مثل هذه التعديلات بعد النسخ غنية للغاية في نقل الحمض النووي الريبي (tRNA) والحمض النووي الريبي الريبوسومي (rRNA) وقد وصفت مؤخرا على جزيئات مرنا كذلك.
وقد أتاح ظهور تكنولوجيات جديدة، مثل تسلسل الجيل التالي، وإنتاج أجسام مضادة محددة تعترف بتعديلات كيميائية محددة، لأول مرة، التحقيق في الموقع وتواتر التعديلات الكيميائية المحددة على مستوى النص. وقد أدت هذه التطورات إلى فهم أفضل لتعديلات الحمض النووي الريبي ورسم خرائط لعدة تعديلات على جزيئات الحمض النووي الريبي3،4.
في حين أن علم الوراثة اللاجينية يحقق في دور تعديلات الحمض النووي والهستون في تنظيم النسخ ، يركز epitranscriptomics بطريقة مماثلة على تعديلات الحمض النووي الريبي ودورها. ويتيح التحقيق في التعديلات epitranscriptomic فرصا جديدة لتسليط الضوء على آليات جديدة للتنظيم قد تصل قيمتها إلى مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية (أي الربط بين الحمض النووي الريبي والتصدير والاستقرار والترجمة)5. وبالتالي لم يكن من المستغرب أن الدراسات الحديثة كشفت عن العديد من التعديلات epitranscriptomic على العدوى الفيروسية في كل من RNAs6 الخلوية والفيروسية. وتشمل الفيروسات التي تم التحقيق فيها حتى الآن كلا من فيروسات الحمض النووي والحمض النووي الريبي؛ وفيروسات الحمض النووي ومن بين هذه الجهات، يمكن اعتبار فيروس نقص المناعة البشرية مثالا رائدا. وإجمالا، فإن اكتشاف ميثيل الحمض النووي الريبي في سياق العدوى الفيروسية قد يسمح بالتحقيق في آليات غير موصوفة بعد للتعبير الفيروسي أو التكرار الفيروسي، مما يوفر أدوات وأهدافا جديدة للسيطرة عليها7.
وفي مجال علم الفيروس، تم على نطاق واسع إجراء تحقيقات في تعديلات النصوص الفيروسية وأظهرت أن وجود هذا التعديل كان مفيدا للنسخ الفيروسي المتماثل8,9,10,11,12,13. حتى الآن يمكن استخدام تقنيات مختلفة للكشف عن علامات epitranscriptomic على مستوى النسخ على نطاق واسع. تعتمد التقنيات الأكثر استخداما لتحديد M6A على تقنيات هطول الأمطار المناعية مثل MeRIP-Seq و miCLIP. في حين تعتمد MeRIP-Seq على تجزئة الحمض النووي الريبي لالتقاط الشظايا التي تحتوي على بقايا ميثيليتات ، يستند miCLIP على توليد طفرات توقيع محددة للأجسام المضادة α-m6A على ربط الأشعة فوق البنفسجية بالأجسام المضادة للجيش الملكي النيبالي ، مما يسمح برسم خرائط أكثر دقة.
يمكن تحقيق الكشف عن تعديل M5C إما عن طريق تقنيات تعتمد على الأجسام المضادة مماثلة للكشف عن m6A (m5C RIP) ، أو عن طريق تحويل بيسوليت أو بواسطة AZA-IP أو بواسطة miCLIP. يستخدم كل من Aza-IP و m5C miCLIP ميثيل ترانسفيراز محدد كطعم لاستهداف الحمض النووي الريبي أثناء المرور بالمثيلة الحمض النووي الريبي. في Aza-IP ، تتعرض الخلايا المستهدفة إلى 5-azacytidine ، مما يؤدي إلى إدخال عشوائي لمواقع cytidine التناظرية 5-azacytidine في الحمض النووي الريبي الوليد. في miCLIP، يتم تعديل ميثيل ترانسفيراز NSun2 وراثيا لإيواء طفرة C271A14،15.
في هذا العمل، نركز على التوصيف المزدوج لتعديلات m6A و m5C في الخلايا المصابة، باستخدام فيروس نقص المناعة البشرية كنموذج. عند التحسين المنهجي ، قمنا بتطوير سير عمل يجمع بين السهد المناعي الحمض النووي الريبي الميثيلي (MeRIP) وتحويل بيسوليت الحمض النووي الريبي (BS) ، مما يسمح بالاستكشاف المتزامن للعلامات epitranscriptomic m6A و m5C على مستوى النص على مستوى واسع ، في السياقين الخلوي والفيروسية. يمكن تنفيذ سير العمل هذا على مستخلصات الحمض النووي الريبي الخلوي وكذلك على الحمض النووي الريبي المعزول عن الجسيمات الفيروسية.
إن نهج إعادة التأهيل المناعي الحمض النووي الريبي الميثيلي (MeRIP)16 الذي يسمح بالتحقيق في m6A على مستوى النسخ على مستوى النسخ راسخ ومجموعة من الأجسام المضادة الخاصة ب m6A متاحة تجاريا حتى الآن17. وتتكون هذه الطريقة من التقاط انتقائي لقطع الحمض النووي الريبي المحتوية على M6A باستخدام الأجسام المضادة الخاصة ب m6A. وعيبان رئيسيان لهذه التقنية هما:1) الدقة المحدودة، التي تعتمد اعتمادا كبيرا على حجم شظايا الحمض النووي الريبي، وبالتالي توفر موقعا ومنطقة تقريبيتين تحتويان على بقايا الميثيل، و'2' الكمية الكبيرة من المواد اللازمة لإجراء التحليل. في البروتوكول الأمثل التالي، قمنا بتوحيد حجم الجزء إلى حوالي 150 nt وخفضنا كمية المواد الأولية من 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي متعدد الاختر، وهو حاليا المبلغ الموصى به من مواد البداية، إلى 1 ميكروغرام فقط من الحمض النووي الريبي متعدد الاختر. كما قمنا بتعظيم كفاءة استرداد شظايا الحمض النووي الريبي m6A المرتبطة بأجسام مضادة محددة باستخدام elution من خلال نهج المنافسة مع الببتيد m6A بدلا من طرق elution أكثر تقليدية وأقل تحديدا باستخدام تقنيات القائمة على الفينول أو البروتين K. ومع ذلك، يبقى القيد الرئيسي لهذا المقايسة المستندة إلى RIP هو الدقة دون المستوى الأمثل التي لا تسمح بتحديد النيوكليوتيدات A المعدلة بدقة.
يمكن حاليا إجراء تحليل لعلامة m5C باستخدام نهجين مختلفين: طريقة تستند إلى RIP مع أجسام مضادة خاصة ب m5C وتحويل بيسوليت الحمض النووي الريبي. وبما أن RIP لا يقدم سوى دقة محدودة بشأن تحديد بقايا الميثيل، استخدمنا تحويل البيسلفيت الذي يمكن أن يوفر دقة واحدة للنيوكليوتيدات. التعرض الحمض النووي الريبي إلى بيسلفيت (BS) يؤدي إلى إزالة السمية السيتوزين، وبالتالي تحويل بقايا السيتوزين إلى uracil. وهكذا، خلال تفاعل تحويل بيسوليت الحمض النووي الريبي، يتم إزالة السمية من كل سيتوسين غير ميثيلي وتحويله إلى أوراكيل، في حين أن وجود مجموعة الميثيل في الموضع 5 من السيتوزين له تأثير وقائي، مما يمنع التخلص من السمية الناجمة عن BS والحفاظ على بقايا السيتوستين. ويتيح النهج القائم على نظام BS الكشف عن النيوكليوتيدات المعدلة M5C بدقة قاعدة واحدة وتقييم تردد الميثيل لكل نسخة، مما يوفر رؤى حول ديناميات تعديل M5C18. ومع ذلك، يعتمد القيد الرئيسي لهذه التقنية على المعدل الإيجابي الزائف للمخلفات الميثيلية. في الواقع ، تحويل BS فعال على الحمض النووي الريبي أحادية تقطعت بهم السبل مع بقايا C يمكن الوصول إليها. ومع ذلك، فإن وجود هيكل ثانوي ضيق للجيش الملكي النيبالي يمكن أن يخفي موضع N5C ويعوق تحويل BS، مما يؤدي إلى بقايا C غير الميثيلية التي لا يتم تحويلها إلى بقايا U، وبالتالي إيجابيات كاذبة. للتحايل على هذه المشكلة وتقليل معدل إيجابي كاذبة، طبقنا 3 جولات من دورات تحويل التشبع والبيسلفيت19. كما قدمنا عنصري تحكم في العينات لتمكين تقدير كفاءة تحويل البيسلفيت: نحن نطبق ضوابط تسلسل ERCC (تسلسلات قياسية وغير مثيلة ومتاحة تجاريا)20 بالإضافة إلى RNAs متعددة الاستنفاد لتقييم معدل تحويل البيسوليت من ناحية، وللتحقق من وجود موقع ميثيليت معروف ومحفظ جيدا، C4447، على 28S الحمض النووي الريبي ريبوسومال من ناحية أخرى21.
في مجال علم الفيروسات، اقتران هاتين الطريقتين التحقيق epitranscriptomic مع تسلسل الجيل القادم وتحليل المعلوماتية الحيوية دقيقة يسمح لدراسة متعمقة من ديناميات M6A و M5C (أي، التغيرات الزمنية تعديل الحمض النووي الريبي التي يمكن أن تحدث عند العدوى الفيروسية ويمكن أن تكشف عن مجموعة من الأهداف العلاجية ذات الصلة الجديدة للاستخدام السريري).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrime Pfx SuperMix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12344-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ RNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>EZR5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-472-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-471-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina TruSeq Stranded mRNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Beads A/G Blend</td>
			<td>Merck</td>
			<td>16-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-Methyladenosine, 5&#8242;-monophosphate sodium salt (m6A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2780-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse IgG</td>
			<td>Merk</td>
			<td>12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo(dT)25</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61005,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRapace</td>
			<td>Stratec</td>
			<td>1020220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick RNA Viral Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Fragmentation Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv

كان دور تعديلات الحمض النووي الريبي في العمليات البيولوجية محور عدد متزايد من الدراسات في السنوات القليلة الماضية ويعرف في الوقت الحاضر باسم epitranscriptomics. من بين أمور أخرى، تم وصف N6-ميثيلادينوسين (m6A) و 5-ميثيلسيتوسين (m5C) تعديلات الحمض النووي الريبي على جزيئات مرنا، وربما يكون لها دور في تحوير العمليات الخلوية. وبالتالي فإن Epitranscriptomics هو طبقة جديدة من التنظيم التي يجب النظر فيها بالإضافة إلى التحليلات النسخية ، حيث يمكن أيضا تغييرها أو تعديلها عن طريق التعرض لأي عامل كيميائي أو بيولوجي ، بما في ذلك العدوى الفيروسية.
هنا، نقدم سير عمل يسمح بتحليل المشهد الخلوي والفيروسية المشتركة epitranscriptomic من علامات M6A و m5C في وقت واحد، في الخلايا المصابة أو غير المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV). عند عزل الحمض النووي الريبي وتجزؤه من الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية وغير المصابة، استخدمنا إجراءين مختلفين: MeRIP-Seq، وهي تقنية تعتمد على المناعة الحمض النووي الريبي، لإثراء شظايا الحمض النووي الريبي التي تحتوي على علامة M6A وBS-Seq، وهي تقنية تعتمد على تحويل البيسلفيت، لتحديد علامة m5C بدقة نوكليوتيد واحدة. عند التقاط الميثيل الخاصة، يتم إعداد مكتبات الحمض النووي الريبي لتسلسل الإنتاجية العالية. كما قمنا بتطوير خط أنابيب المعلوماتية الحيوية مخصص لتحديد النصوص الميثيلية التفاضلية (DM) بشكل مستقل عن ملف التعبير القاعدي الخاص بهم.
وعموما، تسمح المنهجية باستكشاف علامات epitranscriptomic متعددة في وقت واحد وتوفر أطلسا لنصوص DM عند العدوى الفيروسية أو أي اضطراب آخر في الخلايا. ويوفر هذا النهج فرصا جديدة لتحديد اللاعبين الجدد والآليات الجديدة للاستجابة للخلايا، مثل العوامل الخلوية التي تعزز أو تقيد تكرار الفيروس.

وقد ثبت أن سير العمل هذا مفيد في التحقيق في دور ميثيل M6A و m5C في سياق الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. لهذا، استخدمنا CD4 + T نموذج خط الخلية (SupT1) أننا إما المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية أو تركت دون علاج. بدأنا سير العمل مع 50 مليون خلية لكل حالة وحصلنا على متوسط 500 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي مع عدد جودة الحمض النووي الريبي من 10 (الشكل 1A-B). عند اختيار البولي-أ استعدنا ما بين 10 و12 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لكل حالة (تمثل حوالي 2٪ من إجمالي الحمض النووي الريبي) (الشكل 1B). عند هذه النقطة، استخدمنا 5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي متعدد الاختر لخط أنابيب MeRIP-Seq و 1 ميكروغرام لخط أنابيب BS-Seq. وبما أن الحمض النووي الريبي لفيروس نقص المناعة البشرية متعدد الغدد، فلا حاجة إلى اتخاذ أي إجراء آخر، ويمكن تطبيق إجراءات MeRIP-Seq و BS-Seq مباشرة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig01.jpg"> الشكل 1: إعداد الحمض النووي الريبي لتطبيقات المصب. أ) سير العمل الذي يصور إعداد الجيش الملكي النيبالي وتوزيعه لخطوط أنابيب MeRIP-Seq و BS-Seq المتزامنة. يمثل كل شكل سداسي مملوء نوع تعديل الحمض النووي الريبي، مثل m6A (أخضر) أو m5C (وردي). ويشار إلى كميات من مواد الحمض النووي الريبي اللازمة لتنفيذ التجربة. ب) النتائج التمثيلية التي تصور ملامح توزيع الحمض النووي الريبي المتوقع (الحجم والمبلغ) عند إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي (اللوحة العليا) واختيار البولي-أ (اللوحة السفلية). تم تحميل العينات على محلل الشظايا مع مجموعة الحساسية القياسية من أجل تقييم جودة الحمض النووي الريبي قبل إدخال إجراءات محددة MeRIP-Seq و BS-Seq. RQN: رقم جودة الحمض النووي الريبي؛ nt: النيوكليوتيدات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
خط أنابيب MeRIP-Seq هو تقنية تعتمد على مناعة الحمض النووي الريبي تسمح بالتحقيق في تعديل m6A على طول جزيئات الحمض النووي الريبي. لهذا، يتم تجزئة الحمض النووي الريبي أولا ثم احتضانه بأجسام مضادة خاصة ب m6A إلى جانب الخرز المغناطيسي للانشاء المناعي والالتقاط. ثم يتم تسلسل أجزاء الحمض النووي الريبي المخصب MeRIP والكسر (الإدخال) الذي لم يمسه ومقارنة لتحديد مناطق الحمض النووي الريبي المعدلة m6A وبالتالي النصوص الميثيلية m6A (الشكل 2A). يعتمد حل هذه التقنية على كفاءة تجزئة الحمض النووي الريبي. والواقع أن الشظايا الأقصر تسمح بتوطين أكثر دقة لبقايا M6A. هنا، تعرضت الحمض النووي الريبي الخلوي متعدد الاختر والحمى الريبية الفيروسية للتجزؤ القائم على الأيونات مع مخزن تجزئة الحمض النووي الريبي خلال 15 دقيقة في حجم نهائي 20 ميكرولتر للحصول على شظايا الحمض النووي الريبي من 100-150 nt. بدءا من 5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي، استعدنا 4.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المجزأ، وهو ما يقابل معدل استرداد قدره 90٪ (الشكل 2B). استخدمنا 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي المجزأ المنقى كتحكم في المدخلات ، وتعرض مباشرة لإعداد المكتبة وتسلسلها. تمت معالجة الحمض النووي الريبي المتبقي (~ 4.4 ميكروغرام) وفقا لخط أنابيب MeRIP-Seq ، الذي يبدأ باحتضان الحمض النووي الريبي المجزأ مع حبات مرتبطة إما بأجسام مضادة محددة مضادة M6A أو بأجسام مضادة مضادة ل IgG كتحكم. M6A محددة RIP (MeRIP) من 2.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجزأة سمحت استرجاع حوالي 15 نانوغرام من المواد المخصب M6A التي خضعت لإعداد المكتبة وتسلسل (الشكل 2B). لم RIP مع مكافحة IgG السيطرة، كما هو متوقع، لم تسفر عن ما يكفي من الحمض النووي الريبي للسماح بمزيد من التحليل (الشكل 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig02.jpg"> الشكل 2: خط أنابيب MeRIP-Seq. أ) التمثيل التخطيطي لسير عمل MeRIP-Seq والتحكم في الإدخال. عند اختيار البولي-أ، تم تجزئة العينات إلى 120-150 قطعة NT، وإما تخضع مباشرة للتسلسل (100 نانوغرام، التحكم في الإدخال)، أو تستخدم ل RNA المناعي (2.5 ميكروغرام، RIP) مع الأجسام المضادة المضادة M6A محددة أو الأجسام المضادة IgG كسيطرة سلبية قبل التسلسل. ب) النتائج التمثيلية التي تظهر ملامح توزيع الحمض النووي الريبي المتوقع (الحجم والمبلغ) عند التجزئة (اللوحة العليا) وRIP (اللوحات السفلية، MeRIP: اليسار، التحكم IgG: يمين). تم تحميل العينات على محلل الشظايا لتقييم جودة وتركيز الحمض النووي الريبي قبل إجراء مزيد من المعالجة لإعداد المكتبة وتسلسلها. تم إجراء تحليل الحمض النووي الريبي المجزأ باستخدام مجموعة الحساسية القياسية للجيش الملكي النيبالي في حين استخدم الحمض النووي الريبي عالي النسيلة مجموعة الحساسية العالية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يسمح خط أنابيب BS-Seq باستكشاف تعديل الحمض النووي الريبي m5C بدقة النيوكليوتيدات ويؤدي إلى تحديد النصوص الميثيلية m5C. عند تحويل البيسلفيت، يتم تحويل السيتوستينات غير الميثيلية إلى أوراسيل، في حين تبقى السيتوستينات الميثيلية دون تغيير (الشكل 3A). ونظرا للظروف القاسية لإجراء تحويل البيسوليت (أي ارتفاع درجة الحرارة وانخفاض درجة الحموضة)، فإن الرنانات المحولة متدهورة بدرجة عالية (الشكل 3B)، ولكن هذا لا يتعارض مع إعداد المكتبة وتسلسلها. تحويل بيسلفيت فعالة فقط على الحمض النووي الريبي واحد تقطعت بهم السبل، وبالتالي يمكن أن يعوقها هياكل الحمض النووي الريبي مزدوجة تقطعت بهم السبل الثانوية. لتقييم كفاءة تحويل C-U قدمنا عنصري تحكم. كتحكم إيجابي، استفدنا من وجود السيتوسين الميثيلي للغاية الموصوف سابقا في الموضع C4447 من rRNA23 28S. عند تضخيم RT-PCR وتسلسلها من جزء 200 bp المحيطة بالموقع الميثيلي يمكننا أن نلاحظ أن جميع السيتوستينات تم تحويلها بنجاح إلى uracils، وبالتالي تظهر كما thymidines في تسلسل الحمض النووي، باستثناء السيتوزين في الموقف 4447 التي ظلت دون تغيير. كتحكم في معدل تحويل بيسلفيت ، استخدمنا تسلسل الحمض النووي الريبي الاصطناعي المتاح تجاريا. يتكون هذا الخليط في مجموعة من تسلسلات الحمض النووي الريبي المعروفة وغير الميثيلية والمليئة بال أدينلاتيد ، مع مجموعة متنوعة من الهياكل والأطوال الثانوية. وعند إعداد المكتبة وتسلسلها، ركزنا على تسلسلات ERCC هذه لحساب معدل التحويل، والذي يمكن إجراؤه عن طريق حساب عدد C المحول بين إجمالي بقايا C في جميع تسلسلات ERCC وفي كل عينة. حصلنا على معدل تحويل 99.5٪، مما يؤكد كفاءة ونجاح تفاعل تحويل بيسلفيت (الشكل 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig03.jpg"> الشكل 3: خط أنابيب BS-Seq. أ) التمثيل التخطيطي لسير عمل BS-Seq. عند اختيار البولي-أ، تتعرض العينات للبيسلفيت، مما يؤدي إلى تحويل C إلى U (بسبب إزالة البروم) لمخلفات C غير الميثيلية. وعلى النقيض من ذلك، لا تتأثر بقايا C الميثيلية (m5C) بمعالجة البيسوليت وتظل دون تغيير. ب) النتيجة التمثيلية للبيسوليت تحويل ملف توزيع الحمض النووي الريبي (حجم وكمية) عند تحليل على محلل جزء مع مجموعة حساسية القياسية. ج) Electropherogram تظهر نتيجة تسلسل ممثل من أمبليكون RT-PCR للمنطقة المحيطة 100٪ ميثيل C في موقف 4447 في 28S rRNA (أبرز باللون الأزرق). وعلى النقيض من ذلك، تم تحديد بقايا C من التسلسل المرجعي كمخلفات T في تسلسل الأمبليكون بسبب نجاح تحويل البيسلفيت. د) تقييم معدل التحويل C-U من خلال تحليل تسلسل ارتفاع ERCC في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية وغير المصابة. متوسط معدل التحويل هو 99.5٪. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
كما يجري تجهيز العينات المخصبة بال M6A، والعينات المحولة من البيسوليت، وضوابط الإدخال لإعداد المكتبة وتسلسلها وتحليلها المعلوماتية الحيوية (الشكل 4). ووفقا للتصميم التجريبي والسؤال (الأسئلة) البيولوجية التي عولجت، يمكن تطبيق تحليلات المعلوماتية الحيوية المتعددة. وكدليل على المبدأ هنا، نعرض نتائج تمثيلية من تطبيق محتمل واحد (أي تحليل الميثيل التفاضلي)، الذي يركز على تحديد النصوص المثيلة بشكل متفاوت الناجمة عن الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. باختصار، قمنا بالتحقيق في مستوى ميثيل M6A أو m5C من النصوص، بشكل مستقل عن مستوى التعبير الجيني، في كل من الخلايا غير المصابة والمصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، من أجل زيادة فهم دور ميثيل الحمض النووي الريبي خلال دورة الحياة الفيروسية. عند تطبيع التعبير الجيني، حددنا أن نسخة ZNF469 كانت مثيلة m6A بشكل متفاوت وفقا لحالة العدوى، في الواقع لم يتم ميثيل هذا النص في الخلايا غير المصابة بينما عرض العديد من القمم الميثيلية عند الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية (الشكل 5A). وكشف تحليل تفاضلي مماثل للمثيلة على M5C أن نسخة PHLPP1 تحتوي على العديد من المخلفات الميثيلية، والتي تميل إلى أن تكون أكثر تكرارا ميثيلية في حالة فيروس نقص المناعة البشرية (الشكل 5B). وفي هذا السياق، يشير التحليلان إلى أن عدوى فيروس نقص المناعة البشرية تؤثر على الإبترانوسكريبتوم الخلوي.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig04.jpg"> الشكل 4: التمثيل التخطيطي لسير العمل المعلوماتية الحيوية لتحليل بيانات M6A و m5C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig05.jpg"> الشكل 5: مثال على النصوص المثيلية التفاضلية عند العدوى. أ) النتيجة التمثيلية التي تظهر ميثيل M6A من ZNF459 نسخة في المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية (الأخضر) وغير المصابة (الرمادية) الخلايا. تظهر كثافة الذروة (عند طرح تعبير الإدخال) على المحور ص والموضع في الكروموسوم على طول المحور س. يكشف تحليل الميثيل التفاضلي أن نسخة ZFN469 يتم تضخيمها بشكل مفرط عند الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. ب) النتيجة التمثيلية للجين المثيل M5C في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية (الممر العلوي) وغير المصابة (الممر السفلي). ارتفاع كل شريط يمثل عدد القراءات لكل نيوكليوتيد ويسمح بتقييم التغطية. كل بقايا C ممثلة باللون الأحمر، ونسبة المثيلة C ممثلة باللون الأزرق. يتم الإبلاغ عن معدل الميثيل الدقيق (٪) فوق كل بقايا C. الأسهم تسليط الضوء على ذات دلالة إحصائية مثيلة بشكل متفاوت C. تم تصور عينات باستخدام عارض IGV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

دور تعديلات الحمض النووي الريبي في العدوى الفيروسية بدأت للتو لاستكشاف ويمكن تسليط الضوء على آليات جديدة للتفاعل الفيروسي المضيف. في هذا العمل، ونحن نقدم خط أنابيب للتحقيق في M6A و M5C التعديلات الحمض النووي الريبي في سياق العدوى الفيروسية.

استكشاف m6A و m5C Epitranscriptomes على العدوى الفيروسية: مثال مع فيروس نقص المناعة البشرية

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

مرحبا، في هذا الفيديو سوف نعرض لكم كيفية استكشاف m6A و m5C epitranscriptomes على العدوى الفيروسية. لبدء التجربة، ستحتاج إلى 50 مليون خلية لغير المصابين و 50 مليون للحالة المصابة. من أجل الحصول على مجموعة بيانات عالية الجودة عند التحليل ، ستحتاج إلى تحقيق عدوى عالمية.هنا نصيب هذه الخلايا بناقل قائم على فيروس نقص المناعة البشرية ونقوم بقياس GFP المشفرة بشكل فيروسي من قبل FACS. في هذه الحالة، كان لدينا 80٪ من الخلايا المصابة وشرع مع سير العمل بدءا من استخراج الحمض النووي الريبي الكلي. لذلك قسمنا الخلايا في الاقتباسات من 10 مليون لكل منهما وليز لهم في 1 مل من تريزول.ثم أضفنا 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى lysate الخلية ومختلطة عن طريق الانعكاس. عند هذه النقطة، تركنا lysate الجلوس لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة ومن ثم الطرد المركزي جميع العينات بسرعة عالية لمدة 15 دقيقة في أربع درجات. تتوقع أن ترى فصل المرحلة في ثلاث مراحل مختلفة، كما هو مبين هنا.يجلس الحمض النووي الريبي في المرحلة العليا ، لذلك قم بنقل المرحلة المائية بعناية إلى أنبوب جديد عن طريق الانتباه إلى عدم نقل الطبقة العضوية. عند هذه النقطة، إضافة 0.5 مل من ايزوبروبانول إلى المرحلة المائية وتخلط بعناية عن طريق عكس. ويمكن بعد ذلك احتضان العينات ساعة واحدة في 80 درجة لضمان هطول الأمطار الحمض النووي الريبي.عند الطرد المركزي بسرعة عالية، يجب أن تكون قادرة على رؤية بيليه الجيش الملكي النيبالي لطيفة كما هو مبين هنا. تجاهل بعناية supernatant إما عن طريق الانعكاس أو عن طريق pipetting، مع إيلاء الاهتمام في عدم تعطيل بيليه. ثم غسل بيليه الحمض النووي الريبي مع مل واحد من الإيثانول الصف الجزيئي 75٪.ودوامة العينة لفترة وجيزة. عند الطرد المركزي، تأكد من استرداد بيليه الحمض النووي الريبي الأبيض لطيفة. تخلص من المادة الفائقة واترك حبيبات الحمض النووي الريبي تجف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.Resuspend كل بيليه في 20 ميكرولتر من الماء وتجمع كل عينة من نفس الحالة معا. مجموع الجيش الملكي النيبالي الآن على استعداد لعزل ميرنا عن طريق اختيار بولي-A. لكل عينة من 75 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي، وإعداد 200 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي Oligo-DT وغسلها في مل واحد من العازلة ملزمة.ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي واسمح للخرزات بالارتباط بالمغناطيس أثناء مزيج واحد. تخلص من المادة الزائدة وكرر الإجراء لغسله مرة ثانية. ثم إزالة الخرز من المدرجات المغناطيسية وإعادة إنفاقها بعناية في 100 ميكرولتر من العازلة ملزمة.عند هذه النقطة، وإعداد عينة الجيش الملكي النيبالي بقسمتها على 75 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لكل aliquot إعادة إنفاقها في 100 ميكرولتر من الماء. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة ملزمة واحتضان لمدة دقيقتين في 65 درجة. ثم تدور أسفل العينات واحتضان على الجليد.أضف بعد ذلك 100 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المغسول إلى كل عينة من عينات الحمض النووي الريبي واترك الربط على عجلة دوارة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. عند الحضانة، ضع الأنبوب مرة أخرى في رف مغناطيسي والسماح لهم باحتضان لمدة دقيقة واحدة. ثم استرجع المادة الفائقة في أنبوب جديد واحتفظ بها جانبا لجولة ثانية من العزلة.غسل الخرز مرتين مع 200 ميكرولتر من العازلة الغسيل ومن ثم المضي قدما إلى elution. من أجل elute بولي ألف الحمض النووي الريبي مختارة من الخرز المغناطيسي، إضافة 20 ميكرولتر من الجليد الباردة TRIS HCl إلى كل عينة وماصة بعناية. ثم احتضان العينات الخاصة بك في 80 درجة لمدة دقيقتين للافراج عن الحمض النووي الريبي من الخرز.انقل الحمض النووي الريبي الفائق الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي المختار من البولي A إلى أنبوب جديد ، مع توخي الحذر في تجنب ترحيل الخرز. يجب تكرار خطوة الحذف وكذلك خطوة العزل مرتين من أجل زيادة إنتاجية الحمض النووي الريبوزي المرسال. أصبح mRNA جاهزا الآن إما لإدخال خط أنابيب meRIP-Seq في خطوة التجزئة أو الانتقال مباشرة إلى تحويل bisulfite.الخطوة الأولى لدخول خط أنابيب meRIP-Seq تتكون من تجزئة مرنا. لهذا ، تحتاج إلى خمسة ميكروغرام من mRNA مقسمة إلى أليكوت من 18 ميكرولتر في أنابيب 0.2 مل. ولضمان اتساق البيانات، من المهم العمل بسرعة وبقلة عينة فقط في ذلك الوقت.لهذه التجربة، تم تحسين التجزؤ من أجل الحصول على جزء من حجم بين 115 و 200 نيوكليوتيدات. ثم أضف اثنين من ميكرولتر من كاشف التجزئة إلى كل أنبوب يحتوي على 18 ميكرولتر من مرنا توخي الحذر في إيداع قطرة على جدار الأنبوب. قم بتدريج جميع العينات من أجل السماح بالاتصال بين الكاشف والجيش الملكي النيبالي في نفس الوقت واحتضانه عند 70 درجة لمدة 15 دقيقة.بمجرد انتهاء الحضانة ، أوقف التفاعل بإضافة اثنين من الميكرويتر من 0.5 M EDTA. عند هذه النقطة، يمكنك تنقية مرنا مجزأة الخاص بك مع الطريقة التي تختارها والمضي قدما إلى مراقبة الجودة الجيش الملكي النيبالي من قبل محلل جزء. هذه الخطوة اختيارية ، ولكنها ستسمح بتقييم حجم الجزء قبل إشراك هطول الحمض النووي الريبي.كما ترون هنا في الممر الرابع، نحصل على كل من جزء العينة لدينا من حوالي 150 نيوكليوتيد لكل منهما. ثم شرعنا مع meRIP- Seq. وتتكون الخطوة الأولى في زوجين A / G الخرز المغناطيسي مع الأجسام المضادة لل M6A أو الضوابط IgG.لكل خطة رد فعل، نقل 25 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى أنبوب جديد. يرجى ملاحظة أنك ستحتاج إلى حالة واحدة على الأقل خاصة ب m6A وحالة تحكم واحدة. اغسل كل 25 ميكرولتر من الخرز مع 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت IP.أعد تعليق الخرز بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل وضع الأنبوب على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة للسماح بفصل الخرز. قم بإزالة وتخلص من supernatant ، مع الانتباه إلى عدم شفط الخرز المغناطيسي وكرر خطوة الغسيل مرة واحدة. ثم أعد تعليق الخرز المغناطيسي في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت IP لكل 25 ميكرولتر من الحجم الأصلي للخرز.قم بإعداد وتسمية أنبوب واحد لكل حالة. في حالتنا، سيكون لدينا أنبوبين للحالة المصابة، واحد ل M6A وواحد للسيطرة على IgG، وأنابيب اثنين للحالة غير المصابة. ثم أضف 100 ميكرولتر من الخرز المغسول في كل أنبوب.الخرز جاهزة الآن لتكون مقترنة بأجسام مضادة محددة أو ضوابط IgG. إضافة خمسة ميكروغرام من الأجسام المضادة لل m6A محددة أو المضادة للسيطرة على IgG الأجسام المضادة لكل أنبوب يحتوي على 100 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي غسلها. السماح للأجسام المضادة حبات اقتران عن طريق احتضان أنبوب 30 دقيقة على عجلة دوارة.وفي الوقت نفسه ، تابع إعداد العينة. لكل حالة مخطط لها، إما خاصة ب m6A أو التحكم في IgG، ستكون مادة البدء الخاصة بك 2.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي المرسال المجزأ المعاد تعليقه 100 ميكرولتر من الماء. للحصول على حجم تفاعل نهائي قدره 500 ميكرولتر، أضف 295 ميكرولتر من الماء إلى كل عينة.أضف بعد ذلك خمسة ميكرولتر من مثبط RNAase تتركز في 40 وحدة لكل ميكرولتر بمبلغ إجمالي قدره 200 وحدة لكل عينة وتخلط بلطف. وأخيرا إضافة 100 ميكرولتر من 5X مركزة IP العازلة لكل أنبوب. العينات جاهزة الآن لرد فعل هطول الأمطار المناعي.استرجع الخرز المغناطيسي إلى جانب الأجسام المضادة من العجلة الدوارة وقم بتدويرها لأسفل. أضف بعد ذلك 500 ميكرولتر من العينات المعدة مسبقا إلى كل 100 ميكرولتر من الخرز إلى جانب الأجسام المضادة المحددة. اخلطي بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات لإعادة تعليق الخرز بالكامل.احتضنها أو تفاعل meRIP الخاص بك على عجلة دوارة عند أربع درجات خلال ساعتين. بمجرد انتهاء الحضانة ، قم بتدير كل أنبوب ووضعها على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة للسماح بفصل الخرز. ثم قم بإزالة الكسر غير المنضم ووضعه على أنبوب جديد والاحتفاظ به لمزيد من التحليل، إذا لزم الأمر.قم بإزالة المغناطيس من الحامل وأعد تعليق جميع العينات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت IP. إعادة إنفاق كل عينة بعناية عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. أدخل المغناطيس على الرف، واحتضان لمدة دقيقة واحدة، ومن ثم إزالة بعناية supernatant.كرر الغسيل مرتين، ثم انتقل مع الغبطة. لكل عينة، M6A محددة والتحكم، وإعداد 225 ميكرولتر من العازلة elution تحتوي على 20 ملليمولار من m6A النقي. ثم أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت elution لكل عينة.احتضان كل عينة ساعة واحدة في أربع درجات على الروك. ثم جمع كل M6A المخصب عينة الجيش الملكي النيبالي في أنبوب جديد والمضي قدما في جولة ثانية من elution. تنقية RNA المخصب M6A مع الطريقة التي تختارها ومن ثم في هذه المرحلة عينات جاهزة لإعداد المكتبة والتسلسل.للتحقيق في تعديل m5C ، نستخدم تحويل bisulfite. بدء التجربة مع 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي متعدد adenylated. على الرغم من اختياري، إضافة إلى عينة الخاص بك 500 picogram من الحمض النووي الريبي البولي-A المنضب لضمان تمثيل ريبوسومي و 0.5 ميكرولتر من تسلسل الاصطناعية المتاحة تجاريا سوف تسمح لك لتقييم معدل تحويل بيسلفيت عند التسلسل.ضبط العينة الخاصة بك إلى حجم النهائي من 20 ميكرولتر في الماء، ومن ثم إضافة 130 ميكرولتر من كاشف تحويل الحمض النووي الريبي إلى كل عينة. اخلطي بعناية عن طريق السحب لأعلى ولأسفل وقلبي كل العينة للتأكد من عدم وجود قطرات متبقية على جانب الأنابيب. احتضان جميع العينات في جهاز PCR لثلاث دورات من تمسخ 70 درجة لمدة خمس دقائق وتحويل bisulfite عند 54 درجة خلال 45 دقيقة.قم بإجراء إزالة الأمين داخل العمود عن طريق الإضافة مباشرة على عمود فارغ ، 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط الحمض النووي الريبي ، 150 ميكرولتر من عينة bisulfite المحولة. امزج العينة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، ولكن مع الانتباه إلى عدم لمس مرشحات العمود. أضف 400 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 95-100٪ إلى خليط المخزن المؤقت لربط الحمض النووي الريبي مباشرة في العمود.إغلاق الغطاء وتخلط على الفور عن طريق عكس. قم بتدير العينة لمدة 30 ثانية وتجاهل التدفق. اغسل عمودك بحاجز الغسيل ثم أضف 200 ميكرولتر من محلول إزالة الشفط إلى وسط كل عمود.احتضان كل ما تبذلونه من العينة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتدسير العينة لمدة 30 ثانية ثم تابع جولتين من الغسيل. إضافة 400 ميكرولتر من العازلة غسل لكل عينة، والطرد المركزي لمدة 30 ثانية بأقصى سرعة وتجاهل تدفق من خلال.ضع العمود في أنبوب فارغ جديد وeee البيسوليت تحويل الحمض النووي الريبي إلى 20 ميكرولتر من الماء. التحكم في كفاءة تحويل البيسوليت بواسطة RT-qPCR ثم الانتقال إلى إعداد المكتبة وتسلسلها. بناء على التحليل المعلوماتي الحيوي، إليك بعض الأمثلة على النتائج التي قد تحصل عليها مع سير العمل هذا.هنا نقارن epitranscriptome من الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية مقابل الخلايا غير المصابة. في 24 ساعة بعد الإصابة. في لوحة A، يمكنك أن ترى النتائج التي نحصل عليها استكشاف epitranscriptome m6A.في هذا الرسم البياني، نرسم القراءات المخصبة m6A بناء على تحليل meRIP-Seq. يمكننا أن نرى بشكل جيد إصبع الزنك مفرط الميثيل بعد 24 ساعة من الإصابة. أجرينا نفس النوع من التحليل للتحقيق في m5C epitranscriptome في لوحة B.In هذا الرسم البياني ، يتم عرض كل سيتوزين غير ميثيل باللون الأحمر ، في حين تظهر نسبة السيتوزين الذي تم ميثيل m5C باللون الأزرق.كما ترون، PHLPP1، جميع السيتوستينات الثلاثة التي هي فرط الميثيل 24 ساعة بعد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. وعموما، يسمح سير العمل هذا بالتحقيق في كل من M6A و m5C epitranscriptome من الخلايا المصابة ويمكن تطبيقه على هذا النحو على الجسيمات الفيروسية أيضا. فهم العدوى الفيروسية قادرة على تعديل المشهد epitranscriptomic المضيف سوف تعطينا الوصول إلى طبقة جديدة من التنظيم.إن التحقيق في النصوص المثيلية التفاضلية عند العدوى الفيروسية سيوفر بالطبع موردا قيما للتدخل العلاجي الجديد. في الرابط أدناه يمكنك العثور على مواردنا الوصول المفتوح للتحقيق في نسخة الميثيل التفاضلية على عدوى فيروس نقص المناعة البشرية مع مرور الوقت.

Research

JoVE Journal

Biology

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

مقابلة : HIV - 1 الحمض النووي الختان Proviral باستخدام تطورت Recombinase

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

بروتوكولات العدوى عن طريق الفم من اليرقات Lepidopteran مع الفيروسة العصوية

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

استكشاف الوظائف المعرفية لدى الأطفال والرضع والكبار مع التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء القريبة

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

توصيف آليات المقاومة آكل النبات : Spittlebugs على Brachiaria النيابة. كمثال

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

قياس معامل نفاذية المياه الأسموزي (P<sub&gt; و</sub&gt;) من خلايا كروية: Protoplasts محطة معزولة كمثال

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

تقنية تسلل الطرد المركزي لاستخراج Apoplastic السوائل من أوراق النبات عن طريق<em&gt; فاصيلوس الشائع</em&gt; كمثال

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

بنقل العدوى إلى خلايا RAW264.7 مع luciferase المراسل مراسل جين

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

تقييم توافر المعادن في أعلاف الأسماك باستخدام أساليب تكميلية موضحة مع مثال الزنك في سمك السلمون الأطلسي

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

خليه واحده الطموح الصغير كاستراتيجية بديله لفرز الخلايا المنشطة الفلورية لفصل خليط الفيروسات العملاقة

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

عزل وتكاثر وتمايز الخلايا الجذعية المشتقة من المكاك الريسوس الدهنية

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...