Name: exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv
Uploaded: 2022-03-05T13:00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

这项工作得到了瑞士国家科学基金会的支持（赠款31003A_166412和314730_188877）。

<ol>
	<li>Machnicka, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways--2013+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways--2013 update.</a> Nucleic Acids Research. 41, 262-267 (2013).</li><li>Zaccara, S., Ries, R. J., Jaffrey, S. 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作者没有什么可透露的。

RNA修饰在病毒感染中的作用在很大程度上仍然是未知的。更好地了解表观转录组修饰在病毒感染中的作用可能有助于寻找新的抗病毒治疗靶点。
在这项工作中，我们提供了一个完整的工作流程，可以研究受感染细胞的m6A和m5C表观转录组。根据生物学问题，我们建议使用聚A选择的RNA作为起始材料。虽然是可选的，但由于管道可以与总RNA一起使用，但重要的是要记住，rRNA和小RNA都是高度修饰的，并且含有大量甲基化残基。这可能导致有意义的测序数据的质量和数量下降。
但是，如果研究的重点是非聚腺苷酸化RNA，则应调整RNA提取步骤，以避免丢弃小RNA（在基于柱的RNA提取的情况下），并优先使用核糖体消耗技术而不是poly-A选择进入管道。
为了确保高质量的RNA，正确的片段化以及合适的m6A富集和BS转化RNA质量用于文库制备，我们强烈建议使用片段分析仪或生物分析仪。但是，此设备并非始终可用。作为替代方案，RNA的质量，mRNA和片段RNA的大小也可以通过琼脂糖凝胶上的可视化来评估。或者，可以在不事先评估RNA数量的情况下进行文库制备。
我们使用基于抗体的MeRIP-Seq16技术来探索m6A表观转录组学景观。该技术基于RNA免疫沉淀，是成功的;但是，有些步骤需要仔细优化，并且可能很关键。虽然m6A甲基化被描述为主要发生在共识序列RRA * CH中，但该基序在mRNA分子上非常频繁，并且不允许精确鉴定甲基化位点。因此，实现可重复且一致的RNA片段化，产生小RNA片段，以提高基于RIP的分辨率至关重要。在该协议中，我们建议使用优化的程序，在我们的实验环境中提供可重复和一致的结果;但是，此碎片步骤可能需要根据特定的示例特征进行进一步优化。
最近描述了一种允许m6A直接测序的新技术。它基于使用特定的逆转录酶变体，这些变体表现出独特的RT特征，作为对遇到m6A RNA修饰的反应24。经过仔细优化，该技术可以规避MeRIP-Seq面临的主要限制（减少初始材料的数量并允许更高的分辨率）。为了探索m5C修饰，我们决定使用亚硫酸氢盐转化技术，以便在核苷酸分辨率下检测修饰的C残基。为了降低由于RNA二级结构的存在而导致的假阳性率，我们进行了3个变性/亚硫酸氢盐转化循环，并通过使用ERCC尖峰对照进一步控制亚硫酸氢盐转化率性能。与该技术相关的局限性之一是亚硫酸氢盐转化非常苛刻，三个变性/亚硫酸氢盐转化循环可能会降解某些RNA，从而降低分辨率。但是，在我们的设置中，我们选择采用可能略低的分辨率，以提高数据集的质量。
由于这些优化和对照，我们能够提供可靠和健全的工作流程，可以利用该工作流程来研究在病毒感染，宿主 - 病原体相互作用或任何暴露于特定治疗的背景下的表观转录组学景观及其改变。

众所周知，RNA分子可以被修饰，迄今为止已经描述了150多种转录后修饰1。它们包括将化学基团（主要是甲基）添加到RNA分子的嘧啶和嘌呤环的几乎任何位置2。这种转录后修饰已被证明在转移RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）中具有高度富集性，并且最近在mRNA分子上也有描述。
新技术的兴起，如下一代测序（NGS），以及识别明确化学修饰的特异性抗体的产生，首次允许在转录组范围内研究特定化学修饰的位置和频率。这些进步使人们更好地理解了RNA修饰，并绘制了mRNA分子上的几种修饰3，4。
虽然表观遗传学研究了DNA和组蛋白修饰在转录组调控中的作用，但表转录组学以类似的方式关注RNA修饰及其作用。对表观转录组修饰的研究为突出可能调谐各种细胞过程（即RNA剪接，导出，稳定性和翻译）的新调节机制提供了新的机会5。因此，最近的研究发现细胞和病毒RNA中病毒感染的许多表观转录组修饰也就不足为奇了6。迄今为止研究的病毒包括DNA和RNA病毒;其中，艾滋病毒可以被视为一个开创性的例子。总而言之，在病毒感染的背景下发现RNA甲基化可能允许研究尚未描述的病毒表达或复制机制，从而提供新的工具和靶标来控制它们7。
在HIV表观转录组学领域，病毒转录本的修饰已被广泛研究，并表明这种修饰的存在有利于病毒复制8，9，10，11，12，13。迄今为止，可以使用各种技术在转录组范围内检测表观转录组标记。最常用的m6A鉴定技术依赖于免疫沉淀技术，如MeRIP-Seq和miCLIP。虽然MeRIP-Seq依靠RNA片段化来捕获含有甲基化残基的片段，但miCLIP基于RNA-antibody UV交联时产生α-m6A抗体特异性特征突变，从而实现更精确的映射。
m5C修饰的检测可以通过类似于m6A检测（m5C RIP）的基于抗体的技术来实现，也可以通过亚硫酸氢盐转化或AZA-IP或miCLIP来实现。Aza-IP和m5C miCLIP都使用特定的甲基转移酶作为诱饵，在通过RNA甲基化时靶向RNA。在Aza-IP中，靶细胞暴露于5-氮杂胞苷，导致胞苷类似物5-氮杂胞苷位点随机引入新生RNA中。在miCLIP中，NSun2甲基转移酶经过基因改造，具有C271A突变14，15。
在这项工作中，我们专注于以HIV为模型，对受感染细胞中m6A和m5C修饰的双重表征。经过方法学优化，我们开发了一种结合甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）和RNA亚硫酸氢盐转化（BS）的工作流程，允许在细胞和病毒环境中同时在转录组范围内探索m6A和m5C表观转录组组标记。该工作流程可以在细胞RNA提取物以及从病毒颗粒中分离的RNA上实施。
甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）16 方法允许在转录组范围内研究m6A，并且迄今为止已有一系列m6A特异性抗体17。该方法包括使用m6A特异性抗体选择性捕获含有m6A的RNA片段。该技术的两个主要缺点是（i）分辨率有限，高度依赖于RNA片段的大小，因此提供了包含甲基化残基的近似位置和区域，以及（ii）执行分析所需的大量材料。在下面的优化方案中，我们将片段大小标准化为约150 nt，并将起始物质的量从10μg聚A选择的RNA（目前建议的起始材料量）减少到仅1μg的聚A选择RNA。我们还通过与m6A肽的竞争方法进行洗脱，而不是使用基于苯酚的技术或蛋白酶K的更常规和更不具体的洗脱方法，最大限度地提高了与特异性抗体结合的m6A RNA片段的回收效率。然而，这种基于RIP的测定的主要局限性仍然是次优分辨率，不允许鉴定精确修饰的A核苷酸。
目前可以使用两种不同的方法对m5C标记进行分析：基于RIP的方法，具有m5C特异性抗体和RNA亚硫酸氢盐转化。由于RIP在甲基化残基鉴定方面仅提供有限的分辨率，因此我们使用亚硫酸氢盐转化，可以提供单核苷酸分辨率。RNA暴露于亚硫酸氢盐（BS）会导致胞嘧啶脱氨，从而将胞嘧啶残基转化为尿嘧啶。因此，在RNA亚硫酸氢盐转化反应过程中，每个非甲基化的胞嘧啶被脱氨并转化为尿嘧啶，而在5位的甲基的存在具有保护作用，防止BS诱导的脱氨并保留胞嘧啶残基。基于BS的方法允许以单碱基分辨率检测m5C修饰的核苷酸，并评估每个转录本的甲基化频率，从而深入了解m5C修饰动力学18。然而，该技术的主要局限性依赖于甲基化残基的假阳性率。事实上，BS转化对具有可接触C残基的单链RNA有效。然而，紧密RNA二级结构的存在可能会掩盖N5C位置并阻碍BS转化，导致非甲基化C残基不转化为U残基，从而出现假阳性。为了规避这个问题并最大限度地减少假阳性率，我们应用了3轮变性和亚硫酸氢盐转化循环19。我们还在样品中引入了2个对照，以估计亚硫酸氢盐转化效率：我们增加了ERCC测序对照（非甲基化标准化和市售序列）20 以及聚A-耗尽RNA，以评估亚硫酸氢盐转化率，并通过RT-PCR验证是否存在已知且保守的甲基化位点C4447， 另一方面，在28S核糖体RNA上21。
在病毒学领域，将这两种表观转录组学研究方法与下一代测序和准确的生物信息学分析相结合，可以深入研究m6A和m5C动力学（即，病毒感染时可能发生的RNA修饰时间变化，并且可以发现一系列新的治疗相关靶点供临床使用）。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrime Pfx SuperMix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12344-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ RNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>EZR5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-472-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-471-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina TruSeq Stranded mRNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Beads A/G Blend</td>
			<td>Merck</td>
			<td>16-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-Methyladenosine, 5&#8242;-monophosphate sodium salt (m6A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2780-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse IgG</td>
			<td>Merk</td>
			<td>12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo(dT)25</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61005,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRapace</td>
			<td>Stratec</td>
			<td>1020220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick RNA Viral Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Fragmentation Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv

在过去几年中，RNA修饰在生物过程中的作用一直是越来越多的研究的重点，现在被称为表转录组学。其中，N6-甲基腺苷（m6A）和5-甲基胞嘧啶（m5C）RNA修饰已经在mRNA分子上被描述，并且可能在调节细胞过程中起作用。因此，表观转录组学是除转录组学分析之外还必须考虑的新调节层，因为它也可以通过暴露于任何化学或生物制剂（包括病毒感染）来改变或调节。
在这里，我们提出了一个工作流程，该工作流程允许在感染或未感染人类免疫缺陷病毒（HIV）的细胞中同时分析m6A和m5C标记的联合细胞和病毒表观转录组学景观。在从HIV感染和未感染的细胞中分离和片段化mRNA后，我们使用两种不同的程序：MeRIP-Seq，一种基于RNA免疫沉淀的技术，以富集含有m6A标记的RNA片段和BS-Seq，一种基于亚硫酸氢盐转化的技术，以单核苷酸分辨率鉴定m5C标记。在甲基化特异性捕获后，为高通量测序制备RNA文库。我们还开发了一个专用的生物信息学管道，以独立于其基础表达谱来鉴定差异甲基化（DM）转录本。
总体而言，该方法允许同时探索多个表观转录标记，并在病毒感染或任何其他细胞扰动时提供DM转录本的图谱。这种方法为识别新的参与者和细胞反应的新机制提供了新的机会，例如促进或限制病毒复制的细胞因子。

该工作流程已被证明可用于研究m6A和m5C甲基化在HIV感染中的作用。为此，我们使用CD4 + T细胞系模型（SupT1），我们要么感染HIV，要么未经治疗。我们开始了每个条件5000万个细胞的工作流程，并获得了平均500μg的总RNA，RNA质量数为10（图1A-B）。在poly-A选择后，我们为每个条件检索了10至12μg的mRNA（约占总RNA的2%）（图1B）。在这一点上，我们使用5μg聚A选择RNA用于MeRIP-Seq管道，1μg用于BS-Seq管道。由于HIV RNA是多腺苷基化的，因此不需要进一步的作用，可以直接应用MeRIP-Seq和BS-Seq程序。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig01.jpg"> 图1：用于下游应用的RNA制备。A） 描述同时用于 MeRIP-Seq 和 BS-Seq 管道的 RNA 制备和分布的工作流程。每个填充的六边形形状代表一种RNA修饰类型，例如m6A（绿色）或m5C（粉红色）。指示了进行实验所需的RNA物质量。 B）代表性结果，描绘了总RNA提取（上图）和poly-A选择（下图）的预期RNA分布曲线（大小和数量）。将样品装有标准灵敏度试剂盒的片段分析仪上，以便在进入特定的MeRIP-Seq和BS-Seq程序之前评估RNA质量。RQN： RNA质量数;nt：核苷酸。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
MeRIP-Seq管道是一种基于RNA免疫沉淀的技术，可以研究沿RNA分子的m6A修饰。为此，首先将RNA片段化，然后与偶联到磁珠上的m6A特异性抗体一起孵育以进行免疫沉淀和捕获。然后对富含MerIP的RNA片段和未触及的（输入）部分进行测序和比较，以鉴定m6A修饰的RNA区域，从而鉴定m6A甲基化的转录本（图2A）。该技术的分辨率取决于RNA片段化的效率。事实上，较短的片段允许更精确地定位m6A残基。在这里，将细胞多A选择的RNA和病毒RNA在20μL最终体积中与RNA片段化缓冲液在15分钟内进行基于离子的片段化，以获得100-150 nt的RNA片段。从5μgmRNA开始，我们回收了4.5μg片段RNA，相当于90%的回收率（图2B）。我们使用100 ng片段化、纯化的RNA作为输入对照，直接进行文库制备和测序。剩余的RNA（~4.4μg）根据MeRIP-Seq管道进行处理，该管道首先孵育片段RNA，其微球与抗m6A特异性抗体或抗IgG抗体结合作为对照。2.5μg片段RNA的m6A特异性RIP（MeRIP）允许检索约15ng经过文库制备和测序的m6A富集物质（图2B）。正如预期的那样，具有抗IgG控制的RIP没有产生足够的RNA以进行进一步分析（图2B）。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig02.jpg"> 图 2：MeRIP-Seq 管道。A） MeRIP-Seq 工作流程和输入控制的示意图。在poly-A选择后，将样品片段化成120-150 nt块，并在测序前直接进行测序（100ng，输入对照），或用于RNA免疫沉淀（2.5μg，RIP），抗m6A特异性抗体或抗IgG抗体作为阴性对照。B）代表性结果显示片段化（上图）和RIP（下图，MeRIP：左，IgG对照：右）时的预期RNA分布曲线（大小和数量）。将样品加载到片段分析仪上以评估RNA质量和浓度，然后进一步处理以进行文库制备和测序。使用RNA标准灵敏度试剂盒进行片段化RNA分析，而免疫沉淀RNA使用高灵敏度试剂盒。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
BS-Seq管道允许在核苷酸分辨率下探索m5C RNA修饰，并导致m5C甲基化转录本的鉴定。在亚硫酸氢盐转化时，非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变（图3A）。由于亚硫酸氢盐转化过程的苛刻条件 （即 高温和低pH值），转化的mRNA高度降解（图3B），但这不会干扰文库制备和测序。亚硫酸氢盐的转化仅对单链RNA有效，因此可能受到二级双链RNA结构的阻碍。为了评估C-U转换的效率，我们引入了两个控件。作为阳性对照，我们利用了先前描述的在28S rRNA23的位置C4447中存在高度甲基化的胞嘧啶。在RT-PCR扩增和对甲基化位点周围的200 bp片段进行测序后，我们可以观察到所有胞嘧啶都成功转化为尿嘧啶，从而在DNA序列中作为胸腺嘧啶出现，除了位于4447位置的胞嘧啶保持不变。作为亚硫酸氢盐转化率的控制，我们使用市售的合成ERCC RNA序列。该混合物由已知的，非甲基化和多腺苷化的RNA序列组成，具有各种二级结构和长度。在文库制备和测序时，我们专注于这些ERCC序列来计算转化率，这可以通过计算所有ERCC序列和每个样品中总C残基中转化的C的数量来执行。我们获得了99.5%的转化率，证实了亚硫酸氢盐转化反应的效率和成功（图3D）。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig03.jpg"> 图 3：BS-Seq 管道。A） BS-Seq工作流程的示意图。在选择聚A时，样品暴露于亚硫酸氢盐中，导致非甲基化C残基的C到U转化（由于脱氨）。相反，甲基化C残基（m5C）不受亚硫酸氢盐处理的影响，保持不变。 B）亚硫酸氢盐转化RNA分布曲线（大小和数量）的代表性结果，在用标准灵敏度试剂盒的片段分析仪上分析。 C）电泳图显示28S rRNA中100%甲基化C周围区域4447处的RT-PCR扩增子的代表性测序结果（以蓝色突出显示）。相反，由于亚硫酸氢盐转化成功，参考序列的C残基被鉴定为扩增子序列中的T残基。 D）通过分析HIV感染和非感染细胞中的ERCC尖峰序列来评估C-U转化率。平均转化率为99.5%。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
进一步处理富含M6A的样品，亚硫酸氢盐转化样品和输入对照，以进行文库制备，测序和生物信息学分析（图4）。根据实验设计和所解决的生物学问题，可以应用多种生物信息学分析。作为原理证明，我们展示了一种潜在应用（即差异甲基化分析）的代表性结果， 该分析侧重于鉴定HIV感染时诱导的差异甲基化转录本。简而言之，我们研究了转录本在非感染细胞和HIV感染细胞中的m6A或m5C甲基化水平，独立于它们的基因表达水平，以进一步了解RNA甲基化在病毒生命周期中的作用。在基因表达归一化后，我们鉴定ZNF469转录本根据感染状态被差异化为m6A甲基化，实际上该转录本在未感染细胞中未甲基化，而它在HIV感染时显示出几个甲基化峰（图5A）。对m5C的类似差异甲基化分析显示，PHLPP1转录本含有几种甲基化残基，这些残基在HIV条件下往往更频繁地甲基化（图5B）。在这种情况下，两项分析都表明HIV感染会影响细胞表转录组。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig04.jpg"> 图 4：用于分析 m6A 和 m5C 数据的生物信息学工作流程的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig05.jpg"> 图5：感染时差异甲基化转录本的示例。A）代表性结果显示HIV感染（绿色）和非感染（灰色）细胞中ZNF459转录本的m6A甲基化。峰值强度（在输入表达式减法时）显示在 y 轴上，并沿 x 轴显示在染色体中的位置。差异甲基化分析显示，ZFN469转录本在HIV感染时被高甲基化。 B）m5C甲基化基因在HIV感染（上泳道）和非感染（下泳道）细胞中的代表性结果。每个条形的高度表示每个核苷酸的读取次数，并允许进行覆盖率评估。每个C残基用红色表示，甲基化C的比例用蓝色表示。在每个C残基上方报告精确的甲基化速率（%）。箭头突出显示了具有统计学意义的差异甲基化C.使用IGV查看器可视化样品。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

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Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

RNA修饰在病毒感染中的作用才刚刚开始被探索，并可能突出新的病毒 - 宿主相互作用机制。在这项工作中，我们提供了一个管道来研究病毒感染背景下的m6A和m5C RNA修饰。

探索病毒感染时的m6A和m5C表继转录组：HIV示例

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

嗨，在本视频中，我们将向您展示如何在病毒感染时探索m6A和m5C表徵组。要开始实验，您需要5000万个细胞用于未感染者，5000万个细胞用于受感染情况。为了在分析时获得高质量的数据集，您需要实现普遍感染。在这里，我们用基于HIV的载体感染这些细胞，并通过FACS测量病毒编码的GFP。在这种情况下，我们有80%的受感染细胞，并继续从总RNA提取开始的工作流程。因此，我们将细胞分成1000万等分试样，并将它们裂解在1mL的Trizol中。然后，我们向细胞裂解物中加入200微升氯仿，并通过倒置混合。此时，我们让裂解物在室温下静置三分钟，然后在四度下高速离心所有样品15分钟。您将期望看到三个不同阶段的相分离，如图所示。RNA位于上相中，因此注意不要转移有机层，小心地将水相转移到新鲜的管中。此时，向水相中加入0.5mL异丙醇，并通过倒置小心混合。然后，可以在80度下将样品孵育一小时，以确保RNA沉淀。在高速离心时，您应该能够看到一个漂亮的RNA沉淀，如图所示。通过倒置或移液小心地丢弃上清液，注意不要破坏沉淀。然后用一mL的75%分子级乙醇洗涤RNA沉淀。并短暂地涡旋样品。离心后，确保取回一个漂亮的白色RNA沉淀。弃去上清液，让RNA沉淀在室温下干燥15分钟。将每个沉淀重悬于20微升水中，并将来自相同条件的所有样品聚集在一起。总RNA现在已准备好通过poly-A选择进行mRNA分离。对于每个75微克RNA样品，制备200微升寡核苷酸-DT磁珠，并在一mL结合缓冲液中洗涤。将管子放在磁性支架上，让磁珠在一次混合过程中与磁铁结合。弃去上清液并重复该过程进行第二次洗涤。然后从磁性支架上取出磁珠，并小心地将它们重悬于100微升的结合缓冲液中。此时，通过将RNA样品除以75微克RNA来制备，每等分试样重悬于100微升水中。加入100微升结合缓冲液，并在65度下孵育两分钟。然后旋转样品并在冰上孵育。然后将100微升洗涤的磁珠加入每个RNA样品中，并在室温下在旋转轮上结合15分钟。孵育后，将管子放回磁性架中，让它们孵育一分钟。然后将上清液回收到新鲜管中，并将其放在一边进行第二轮隔离。用200微升洗涤缓冲液洗涤珠子两次，然后进行洗脱。为了从磁珠中洗脱出聚A选择的RNA，向每个样品中加入20微升冰冷的TRIS HCl并小心移液。然后将样品在80度下孵育两分钟，以释放珠子中的RNA。将含有聚-A所选RNA的上清液转移到新鲜管中，小心避免珠子残留。洗脱步骤和分离步骤应重复两次，以提高mRNA产量。mRNA现在已经准备好在片段化步骤进入meRIP-Seq管道或直接进入亚硫酸氢盐转化。进入meRIP-Seq管道的第一步是mRNA片段化。为此，您需要将5微克mRNA分成18微升等分试样，装在0.2 mL管中。为了确保数据的一致性，快速工作并且当时只有很少的样本至关重要。对于该实验，已经优化了片段化，以获得大小在115至200个核苷酸之间的片段。然后将两微升片段化试剂加入到每个含有18微升mRNA的管中，小心地将液滴沉积在管壁上。旋转所有样品，以便试剂和RNA同时接触，并在70度下孵育15分钟。孵育结束后，通过加入两微升0.5M EDTA停止反应。此时，您可以使用您选择的方法纯化片段化的mRNA，并通过片段分析仪进行RNA质量控制。这一步是可选的，但它允许在参与RNA沉淀之前评估片段的大小。正如你在第四条泳道中看到的，我们获得了大约150个核苷酸的样本片段。然后，我们继续进行meRIP-Seq。第一步包括将A / G磁珠与抗m6A抗体或IgG对照组组成。对于每个反应计划，将25微升磁珠转移到新鲜管中。请注意，您将需要至少一个m6A特定条件和一个控制条件。用250微升IP缓冲液洗涤每25微升珠子。通过上下移液轻轻重悬珠，并将管子放在磁性架上一分钟，以便分离微珠。取出并丢弃上清液，注意不要吸出磁珠，并重复洗涤步骤一次。然后将磁珠重悬于每25微升原始体积的磁珠100微升IP缓冲液中。每种情况准备并标记一管。在我们的例子中，我们将有两个管子用于受感染的情况，一个用于m6A，一个用于IgG控制，两个管子用于未感染的情况。然后在每个管中加入100微升洗涤的珠子。磁珠现在已准备好与特异性抗体或IgG对照组配用。向含有100微升洗涤磁珠的试管中加入5微克特异性抗m6A抗体或抗IgG对照抗体。通过将试管在旋转的轮上孵育30分钟，允许抗体 - 微球偶联。同时，继续进行样品制备。对于每个计划条件，无论是m6A特异性还是IgG对照，您的起始材料将是2.5微克片段mRNA重悬100微升水。为了使最终反应体积为500微升，向每个样品中加入295微升水。然后加入5微升浓缩的RNA酶抑制剂，浓度为每微升40单位，每个样品的总量为200单位，并轻轻混合。最后向每个管中加入100微升5X浓缩IP缓冲液。样品现在已准备好进行免疫沉淀反应。从旋转的轮中取出与抗体偶联的磁珠，并将它们旋转下来。然后将500微升先前制备的样品加入到每个100微升的微珠中，并结合特异性抗体。通过上下移液几次轻轻混合，以完全重悬珠子。在两小时内将它们或您的meRIP反应以四度在旋转的轮上孵育。孵育结束后，将每个管子旋转下来，将它们放在磁性架上一分钟，以便分离磁珠。然后取出未结合的馏分，将其放在新鲜的试管上，并在需要时将其保留以进行进一步分析。从机架上取下磁铁，将所有样品重悬于500微升IP缓冲液中。通过上下移液小心地重悬每个样品。将磁铁插入架子上，孵育一分钟，然后小心地取出上清液。重复洗涤两次，然后继续洗脱。对于每对几个样品，m6A特异性和对照，制备含有20毫摩尔纯化m6A的225微升洗脱缓冲液。然后为每个样品加入100微升洗脱缓冲液。将所有样品在摇臂上以四度孵育一小时。然后将所有富含m6A的RNA样品收集在新鲜试管中，并进行第二轮洗脱。使用您选择的方法纯化富含m6A的RNA，然后此时样品准备好进行文库制备和测序。为了研究m5C修饰，我们使用亚硫酸氢盐转化。用500纳克聚腺苷化RNA开始实验。虽然是可选的，但在您的样品中添加500皮克的聚A耗尽RNA以确保核糖体的代表性和0.5微升的市售合成序列将允许您在测序时评估亚硫酸氢盐的转化率。将样品在水中调节至最终体积为20微升，然后向每个样品中加入130微升RNA转化试剂。通过上下移液并向下旋转所有样品来仔细混合，以确保管的侧面没有液滴残留。将所有样品在PCR机中孵育三个周期，变性70度，持续5分钟，亚硫酸氢盐转化54度，45分钟。通过直接在空柱上添加250微升RNA结合缓冲液和150微升亚硫酸氢盐转化样品来进行柱内脱氨。通过上下移液来混合样品，但请注意不要触摸色谱柱过滤器。直接在色谱柱中向样品RNA结合缓冲液混合物中加入400微升95-100%乙醇。合上盖子，立即倒置混合。将样品旋转30秒并丢弃流出物。用洗涤缓冲液洗涤色谱柱，然后向每色谱柱的中心加入200微升脱硫溶液。将所有样品在室温下孵育30分钟。将样品旋转30秒，然后进行两轮洗涤。向每个样品中加入400微升洗涤缓冲液，全速离心30秒并丢弃流出物。将色谱柱放入新的空管中，并将亚硫酸氢盐转化RNA洗脱成20微升水。通过RT-qPCR控制亚硫酸氢盐转化效率，然后进行文库制备和测序。在生物信息分析之后，以下是使用此工作流程可能获得的结果的一些示例。在这里，我们比较HIV感染细胞与未感染细胞的上表转录组。感染后 24 小时。在A面板中，您可以看到我们获得的研究结果探索m6A表转录组。在此图中，我们绘制了meRIP-Seq分析时m6A富集读取。我们可以很好地看到锌指在感染后24小时被高甲基化。我们对图 B.In 图中的m5C表转录组研究进行了相同类型的分析，每个非甲基化胞嘧啶都以红色显示，而已被m5C甲基化的胞嘧啶的比例以蓝色显示。正如你所看到的，PHLPP1，所有三种胞嘧啶都是在HIV感染后24小时超甲基化的。总体而言，该工作流程允许研究受感染细胞的M6A和m5C上表转录组，也可以应用于病毒颗粒。了解病毒感染能够改变宿主的表观转录组学景观将使我们能够获得新的一层调节。对病毒感染时差异甲基化转录本的研究当然将为新的治疗干预提供宝贵的资源。在下面的链接中，您可以找到我们的开放获取资源，用于调查HIV感染随时间推移的差异甲基化转录本。

Research

JoVE Journal

Biology

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

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科研

生物学

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