Name: exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv
Uploaded: 2022-03-05T13:00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Swiss National Science Foundation (tilskud 31003A_166412 og 314730_188877).

<ol>
	<li>Machnicka, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways--2013+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways--2013 update.</a> Nucleic Acids Research. 41, 262-267 (2013).</li><li>Zaccara, S., Ries, R. J., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading,+writing+and+erasing+mRNA+methylation.">Reading, writing and erasing mRNA methylation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 608-624 (2019).</li><li>Davalos, V., Blanco, S., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Messenger+RNA+Modifications.">SnapShot: Messenger RNA Modifications.</a> Cell. 174 (2), 498 (2018).</li><li>Saletore, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+birth+of+the+Epitranscriptome:+deciphering+the+function+of+RNA+modifications.">The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).</li><li>Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications.">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2017).</li><li>Netzband, R., Pager, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+marks:+Emerging+modulators+of+RNA+virus+gene+expression.">Epitranscriptomic marks: Emerging modulators of RNA virus gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (3), 1576 (2020).</li><li>Pereira-Montecinos, C., Valiente-Echeverria, F., Soto-Rifo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+regulation+of+viral+replication.">Epitranscriptomic regulation of viral replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (4), 460-471 (2017).</li><li>Lichinchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+human+and+viral+m(6)A+RNA+methylomes+during+HIV-1+infection+of+T+cells.">Dynamics of the human and viral m(6)A RNA methylomes during HIV-1 infection of T cells.</a> Nature Microbiology. 1, 16011 (2016).</li><li>Courtney, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+Addition+of+m(5)C+to+HIV-1+Transcripts+Regulates+Viral+Gene+Expression.">Epitranscriptomic Addition of m(5)C to HIV-1 Transcripts Regulates Viral Gene Expression.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).</li><li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+m(6)A+Editing+of+HIV-1+mRNAs+Enhances+Viral+Gene+Expression.">Posttranscriptional m(6)A Editing of HIV-1 mRNAs Enhances Viral Gene Expression.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 675-685 (2016).</li><li>Tirumuru, N., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+envelope+proteins+up-regulate+N+(6)-methyladenosine+levels+of+cellular+RNA+independently+of+viral+replication.">HIV-1 envelope proteins up-regulate N (6)-methyladenosine levels of cellular RNA independently of viral replication.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3249-3260 (2019).</li><li>Tirumuru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+of+HIV-1+RNA+regulates+viral+infection+and+HIV-1+Gag+protein+expression.">N(6)-methyladenosine of HIV-1 RNA regulates viral infection and HIV-1 Gag protein expression.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell.">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> Frontiers in Virology. 1 (11), (2021).</li><li>Khoddami, V., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+target+profiling+of+RNA+cytosine+methyltransferases+using+the+mechanism-based+enrichment+procedure+Aza-IP.">Transcriptome-wide target profiling of RNA cytosine methyltransferases using the mechanism-based enrichment procedure Aza-IP.</a> Nature Protocols. 9 (2), 337-361 (2014).</li><li>Hussain, S., Aleksic, J., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (11), 215 (2013).</li><li>Dominissini, D., Moshitch-Moshkovitz, S., Salmon-Divon, M., Amariglio, N., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+mapping+of+N6-methyladenosine+by+m6A-seq+based+on+immunocapturing+and+massively+parallel+sequencing.">Transcriptome-wide mapping of N6-methyladenosine by m6A-seq based on immunocapturing and massively parallel sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (1), 176-189 (2013).</li><li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq.">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li><li>Shobbir Hussain, J. A., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (215), (2013).</li><li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+5-methylcytosine+profiles+in+poly(A)+RNA+from+mouse+embryonic+stem+cells+and+brain.">Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain.</a> Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).</li><li>Endrullat, C., Gl&#246;kler, J., Franke, P., Frohme, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+and+quality+management+in+next-generation+sequencing.">Standardization and quality management in next-generation sequencing.</a> Applied &amp; Translational Genomics. 10, 2-9 (2016).</li><li>Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+cytosine+methylation+analysis+by+bisulfite+sequencing.">RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 12 (2009).</li><li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell.">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> biorxiv. 1 (11), (2021).</li><li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+noncoding+RNA.">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and noncoding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li><li>Aschenbrenner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+DNA+Polymerase+for+Direct+m(6)+A+Sequencing.">Engineering of a DNA Polymerase for Direct m(6) A Sequencing.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 57 (2), 417-421 (2018).</li><li>Didion, J. P., Martin, M., Collins, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atropos:+specific,+sensitive,+and+speedy+trimming+of+sequencing+reads.">Atropos: specific, sensitive, and speedy trimming of sequencing reads.</a> PeerJ. 5, 3720 (2017).</li><li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISAT:+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements.">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Okonechnikov, K., Conesa, A., Garc&#237;a-Alcalde, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualimap+2:+advanced+multi-sample+quality+control+for+high-throughput+sequencing+data.">Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., K&#228;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet Journal. 17 (1), (2011).</li><li>Shen, W., Le, S., Li, Y., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeqKit:+A+Cross-Platform+and+Ultrafast+Toolkit+for+FASTA/Q+File+Manipulation.">SeqKit: A Cross-Platform and Ultrafast Toolkit for FASTA/Q File Manipulation.</a> PLOS ONE. 11 (10), 0163962 (2016).</li><li>Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=meRanTK:+methylated+RNA+analysis+ToolKit.">meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit.</a> Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

RNA-modifikationernes rolle i virusinfektion er stadig stort set ukendt. En bedre forståelse af epitranscriptomiske modifikationers rolle i forbindelse med virusinfektion kan bidrage til at finde nye antivirale behandlingsmål.
I dette arbejde leverer vi en komplet arbejdsgang, der gør det muligt at undersøge m6A og m5C epitranscriptomes af inficerede celler. Afhængigt af det biologiske spørgsmål anbefaler vi at bruge poly-A-udvalgte RNA som udgangsmateriale. Selvom det er valgfrit, da rørledningen kan bruges med total RNA, er det vigtigt at huske på, at rRNAs samt små RNA'er er stærkt modificerede og indeholder et vigtigt antal methylerede rester. Dette kan resultere i en nedsat kvalitet og mængde meningsfulde sekventeringsdata.
Hvis undersøgelsens fokus imidlertid er ikke-poly-adenyleret RNA, bør RNA-ekstraktionstrinnet tilpasses for at undgå at kassere små RNA -tegn (i tilfælde af kolonnebaseret RNA-udvinding) og for at privilegere ribosomudtømningsteknikker i stedet for poly-A-udvælgelse for at komme ind i rørledningen.
For at sikre høj kvalitet RNA, korrekt fragmentering og egnet m6A-beriget og BS konverteret RNA kvalitet til bibliotek forberedelse vi kraftigt råde til at bruge et fragment analysator eller en bioanalyzer. Dette udstyr er dog ikke altid tilgængeligt. Som et alternativ kunne kvaliteten af RNA, mRNA og størrelsen af fragmenteret RNA også vurderes ved visualisering på agarosegel. Alternativt kan biblioteksforberedelse udføres uden forudgående vurdering af RNA-mængde.
Vi brugte den antistofbaserede MeRIP-Seq16-teknik til at udforske det m6A epitranscriptomiske landskab. Denne teknik er baseret på RNA immunprecipitation og er vellykket; Nogle trin kræver dog omhyggelig optimering og kan være kritiske. Selv om m6A methylering er blevet beskrevet til at forekomme primært inden for konsensus sekvens RRA * CH, dette motiv er meget hyppig langs mRNA molekyler og tillader ikke præcis identifikation af methyleret sted. Det er derfor afgørende at opnå en reproducerbar og konsekvent RNA-fragmentering, der genererer små RNA-fragmenter, for at forbedre den RIP-baserede opløsning. I denne protokol anbefaler vi en optimeret procedure, der giver reproducerbare og konsekvente resultater i vores eksperimentelle indstilling; Dette fragmenteringstrin kan dog kræve yderligere optimering i henhold til specifikke eksempelfunktioner.
For nylig en ny teknik, der tillader m6A direkte sekventering blev beskrevet. Den er baseret på brugen af specifikke omvendte transskriptasevarianter, der udviser unikke RT-signaturer som svar på at støde på m6A RNA-modifikation24. Denne teknologi, ved omhyggelig optimering, kunne omgå den store begrænsning står over for MeRIP-Seq (faldende mængden af indledende materiale og giver en højere opløsning). For at udforske m5C-modifikationen besluttede vi at bruge bisulfitkonverteringsteknikken til ved nukleotidopløsning at opdage de modificerede C-rester. For at reducere den falske positive sats på grund af tilstedeværelsen af RNA sekundære strukturer udførte vi 3 cyklusser af denaturering / bisulfitkonvertering og yderligere kontrol bisulfitkonverteringsfrekvens takket være brugen af ERCC spike-in kontroller. En af de begrænsninger, der er forbundet med denne teknik er, at bisulfit konvertering er meget hård og tre cyklusser af denaturering / bisulfit konvertering kunne forringe nogle RNA og dermed reducere opløsningen. Men i vores indstilling valgte vi at nøjes med en potentielt lidt lavere opløsning for at øge kvaliteten af datasættet.
Takket være disse optimeringer og kontroller var vi i stand til at levere en pålidelig og sund arbejdsgang, der kan udnyttes til at undersøge det epitranscriptomiske landskab og dets ændring i forbindelse med virusinfektioner, værtspatogeninteraktioner eller enhver eksponering for specifikke behandlinger.

Det er længe kendt, at RNA molekyler kan ændres, og mere end 150 post-transskriptionelle ændringer er blevet beskrevet til dato1. De består i tilsætning af kemiske grupper, hovedsagelig methylgrupper, til stort set enhver position af pyrimidin- og purinringe af RNA-molekyler2. Sådanne post-transskriptionelle ændringer har allerede vist sig at være højt beriget i overførsel RNA (tRNA) og ribosomale RNA (rRNA) og er for nylig blevet beskrevet på mRNA molekyler samt.
Fremkomsten af nye teknologier, såsom Next Generation Sequencing (NGS), og produktionen af specifikke antistoffer, der anerkender bestemte kemiske ændringer, gjorde det for første gang muligt at undersøge placeringen og hyppigheden af specifikke kemiske modifikationer på et transskriptom-dækkende niveau. Disse fremskridt har ført til en bedre forståelse af RNA-modifikationer og til kortlægning af flere modifikationer på mRNA-molekyler3,4.
Mens epigenetik undersøger DNA's og histonemodifikationers rolle i transskriptomregulering, fokuserer epitranscriptomics på samme måde på RNA-modifikationer og deres rolle. Undersøgelsen af epitranscriptomiske modifikationer giver nye muligheder for at fremhæve nye reguleringsmekanismer, der kan tune en række cellulære processer (dvs. RNA-splejsning, eksport, stabilitet og oversættelse)5. Det var derfor ingen stor overraskelse, at nylige undersøgelser afdækket mange epitranscriptomiske ændringer på virusinfektion i både cellulære og virale RNA'er6. De vira, der hidtil er undersøgt, omfatter både DNA- og RNA-vira; blandt dem kan hiv betragtes som et banebrydende eksempel. Alt i alt kan opdagelsen af RNA methylering i forbindelse med virusinfektioner gøre det muligt at undersøge endnu ubeskrevne mekanismer for virale udtryk eller replikation, hvilket giver nye værktøjer og mål til at kontrollere dem7.
Inden for hiv epitranscriptomics, modifikationer af virale udskrifter er blevet bredt undersøgt og har vist, at tilstedeværelsen af denne ændring var gavnligt for viral replikation8,9,10,11,12,13. Til dato forskellige teknikker kan bruges til at opdage epitranscriptomic mærker på transcriptome-dækkende niveau. De mest anvendte teknikker til m6A identifikation stole på immun nedbør teknikker såsom MeRIP-Seq og miCLIP. Mens MeRIP-Seq er afhængig af RNA fragmentering til at fange fragmenter, der indeholder methylerede rester, miCLIP er baseret på generering af α-m6A antistof specifikke signatur mutationer på RNA-antistof UV crosslinking, hvilket giver mulighed for en mere præcis kortlægning.
Påvisning af m5C-modifikation kan opnås enten ved antistofbaserede teknologier svarende til m6A-detektion (m5C RIP) eller ved bisulfitkonvertering eller ved AZA-IP eller ved miCLIP. Både Aza-IP og m5C miCLIP bruger en bestemt methyltransferase som agn til at målrette RNA, mens du går gennem RNA methylering. I Aza-IP udsættes målceller for 5-azacytidin, hvilket resulterer i tilfældig indførelse af cytidin analog 5-azacytidin steder i spirende RNA. I miCLIP er NSun2 methyltransferase genetisk modificeret til at huse C271A-mutationen14,15.
I dette arbejde fokuserer vi på den dobbelte karakterisering af m6A og m5C-modifikationer i inficerede celler ved hjælp af HIV som model. Ved metodologisk optimering har vi udviklet en arbejdsgang, der kombinerer methyleret RNA immunprecipitation (MeRIP) og RNA bisulfitkonvertering (BS), der muliggør samtidig udforskning af m6A og m5C epitranscriptomiske mærker på et transskriptom-dækkende niveau, i både cellulære og virale sammenhænge. Denne arbejdsgang kan implementeres på cellulære RNA-ekstrakter såvel som på RNA isoleret fra viruspartikler.
Methyleret RNA ImmunoPrecipitation (MeRIP)16-tilgangen , der gør det muligt at undersøge m6A på transskriptom-dækkende niveau, er veletableret, og en række m6A-specifikke antistoffer er kommercielt tilgængelige til dato17. Denne metode består i selektiv opsamling af m6A-holdige RNA-stykker ved hjælp af et m6A-specifikt antistof. De to største ulemper ved denne teknik er (i) den begrænsede opløsning, som er meget afhængig af størrelsen af RNA-fragmenter og dermed giver en omtrentlig placering og region, der indeholder methylerede rester, og (ii) den store mængde materiale, der er nødvendigt for at udføre analysen. I den følgende optimerede protokol standardiserede vi fragmentstørrelsen til ca. 150 nt og reducerede mængden af udgangsmateriale fra 10 μg poly-A-udvalgte RNA, som i øjeblikket er den anbefalede mængde udgangsmateriale, til kun 1 μg poly-A-valgt RNA. Vi maksimerede også nyttiggørelseseffektiviteten af m6A RNA-fragmenter bundet til specifikke antistoffer ved hjælp af en elution ved en konkurrencetilgang med en m6A peptid i stedet for mere konventionelle og mindre specifikke elutionsmetoder ved hjælp af phenolbaserede teknikker eller proteinase K. Den væsentligste begrænsning af denne RIP-baserede analyse er imidlertid fortsat den suboptimale opløsning, der ikke gør det muligt at identificere den præcise modificerede A-nukleotid.
Analyse af m5C-mærket kan i øjeblikket udføres ved hjælp af to forskellige tilgange: en RIP-baseret metode med m5C-specifikke antistoffer og RNA bisulfitkonvertering. Da RIP kun tilbyder begrænset opløsning på identifikationen af methylerede rester, brugte vi bisulfitkonvertering, der kan tilbyde enkelt nukleotidopløsning. RNA-eksponering for bisulfit (BS) fører til cytosindeaminering og omdanner derved cytosinresterne til uracil. Under RNA bisulfitkonverteringsreaktionen afamineres og omdannes hver ikke-methyleret cytosin til uracil, mens tilstedeværelsen af en methylgruppe i position 5 af cytosinen har en beskyttende virkning, der forhindrer BS-induceret deaminering og bevarer cytosinresterne. Den BS-baserede tilgang giver mulighed for påvisning af et m5C modificeret nukleotid ved enkelt basisopløsning og til vurdering af methyleringsfrekvensen for hver udskrift, hvilket giver indsigt i m5C-modifikationsdynamik18. Den vigtigste begrænsning af denne teknik er imidlertid afhængig af den falske positive sats af methylerede rester. BS-konverteringen er faktisk effektiv på enkeltstrenget RNA med tilgængelige C-rester. Tilstedeværelsen af en stram RNA sekundær struktur kan imidlertid maskere N5C-positionen og hæmme BS-konverteringen, hvilket resulterer i ikke-methylerede C-rester, der ikke omdannes til U-rester og dermed falske positiver. For at omgå dette problem og minimere den falske positive sats anvendte vi 3 runder denaturerings- og bisulfitkonverteringscyklusser19. Vi har også indført 2 kontroller i prøverne for at muliggøre estimering af bisulfitkonverteringseffektivitet: Vi spike-in ERCC sekventering kontrol (ikke-methyleret standardiserede og kommercielt tilgængelige sekvenser)20 samt poly-A-udtømte RNA'er til at vurdere bisulfit konverteringsfrekvens på den ene side, og at kontrollere ved RT-PCR tilstedeværelsen af en kendt og velbevaret methyleret site, C4447, på 28S ribosomale RNA på den anden side21.
Inden for virologi giver kobling af disse to epitranscriptomiske undersøgelsesmetoder med næste generations sekventering og nøjagtig bioinformatisk analyse mulighed for en dybdegående undersøgelse af m6A- og m5C-dynamik (dvs. RNA-modifikationstidlige ændringer, der kan forekomme ved virusinfektion og kunne afdække en række nye terapeutisk relevante mål for klinisk brug).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrime Pfx SuperMix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12344-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ RNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>EZR5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-472-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-471-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina TruSeq Stranded mRNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Beads A/G Blend</td>
			<td>Merck</td>
			<td>16-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-Methyladenosine, 5&#8242;-monophosphate sodium salt (m6A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2780-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse IgG</td>
			<td>Merk</td>
			<td>12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo(dT)25</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61005,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRapace</td>
			<td>Stratec</td>
			<td>1020220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick RNA Viral Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Fragmentation Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv

RNA-modifikationernes rolle i biologiske processer har været i fokus for et stigende antal undersøgelser i de sidste par år og er i dag kendt som epitranscriptomics. Blandt andet, N6-methyladenosin (m6A) og 5-methylcytosin (m5C) RNA ændringer er blevet beskrevet på mRNA molekyler og kan have en rolle i modulerende cellulære processer. Epitranscriptomics er således et nyt reguleringslag, der skal overvejes ud over transskriptomiske analyser, da det også kan ændres eller moduleres ved eksponering for kemiske eller biologiske agenser, herunder virusinfektioner.
Her præsenterer vi en arbejdsgang, der gør det muligt at analysere det fælles cellulære og virale epitranscriptomiske landskab af m6A- og m5C-mærkerne samtidigt, i celler, der er inficeret eller ej med human immundefektvirus (HIV). Ved mRNA-isolation og fragmentering fra hiv-inficerede og ikke-inficerede celler brugte vi to forskellige procedurer: MeRIP-Seq, en RNA-immunprecipitationsbaseret teknik, til at berige for RNA-fragmenter, der indeholder m6A-mærket og BS-Seq, en bisulfitkonverteringsbaseret teknik, til at identificere m5C-mærket ved en enkelt nukleotidopløsning. Ved methyleringsspecifik fangst er RNA-biblioteker forberedt til sekventering med høj kapacitetshastighed. Vi udviklede også en dedikeret bioinformatik pipeline til at identificere differentieret methylerede (DM) udskrifter uafhængigt af deres basal udtryk profil.
Samlet set metoden tillader udforskning af flere epitranscriptomic mærker samtidigt og giver et atlas af DM udskrifter på virusinfektion eller enhver anden celleforstyrrelse. Denne tilgang giver nye muligheder for at identificere nye spillere og nye mekanismer for cellerespons, såsom cellulære faktorer, der fremmer eller begrænser viral replikation.

Denne arbejdsgang har vist sig nyttig til at undersøge den rolle, m6A og m5C methylering i forbindelse med hiv-infektion. Til dette brugte vi en CD4 + T-cellelinjemodel (SupT1), som vi enten inficerer med hiv eller venstre ubehandlet. Vi startede arbejdsgangen med 50 millioner celler pr. betingelse og opnåede i gennemsnit 500 μg af det samlede RNA med et RNA-kvalitetstal på 10 (figur 1A-B). Ved poly-A udvælgelse hentede vi mellem 10 og 12 μg mRNA pr. betingelse (svarende til ca. 2% af det samlede RNA) (figur 1B). På dette tidspunkt brugte vi 5 μg poly-A-udvalgte RNA til MeRIP-Seq-rørledningen og 1 μg til BS-Seq-rørledningen. Da HIV RNA er poly-adenyleret, er der ikke behov for yderligere foranstaltninger, og MeRIP-Seq- og BS-Seq-procedurer kan anvendes direkte.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig01.jpg"> Figur 1: RNA-klargøring til downstream-applikationer. A) Workflow, der skildrer RNA-forberedelse og -distribution til samtidige MeRIP-Seq- og BS-Seq-rørledninger. Hver udfyldt sekskantet form repræsenterer en RNA-ændringstype, f.eks. Mængden af RNA-materiale, der er nødvendigt for at udføre eksperimentet, er angivet. B) Repræsentative resultater, der viser forventede RNA-distributionsprofiler (størrelse og mængde) ved den samlede RNA-udvinding (øverste panel) og poly-A-markering (nederste panel). Prøverne blev indlæst på fragmentanalysator med standardfølsomhedssæt for at vurdere RNA-kvaliteten, før der blev indtastet specifikke MeRIP-Seq- og BS-Seq-procedurer. RQN: RNA-kvalitetsnummer; nt: nukleotider. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
MeRIP-Seq pipeline er en RNA immunprecipitationsbaseret teknik, der gør det muligt at undersøge m6A-modifikation langs RNA-molekyler. Til dette er RNA først fragmenteret og derefter inkuberet med m6A-specifikke antistoffer koblet til magnetiske perler til immunprecipitation og opsamling. MeRIP-berigede RNA-fragmenter og den uberørte (input)brøk sorteres derefter og sammenlignes med identifikation af m6A-modificerede RNA-områder og dermed m6A-methylerede udskrifter (figur 2A). Løsningen af teknikken afhænger af effektiviteten af RNA fragmentering. Kortere fragmenter giver faktisk mulighed for en mere præcis lokalisering af m6A-restkoncentrationen. Her blev cellulære poly-A-udvalgte RNA'er og virale RNA'er udsat for ionbaseret fragmentering med RNA-fragmenteringsbuffer i løbet af 15 min i et 20 μL-endeligt volumen for at opnå RNA-fragmenter på 100-150 nt. Begyndende med 5 μg mRNA genvandt vi 4,5 μg fragmenteret RNA, svarende til en genopretningshastighed på 90% (figur 2B). Vi brugte 100 ng fragmenteret, renset RNA som input kontrol, udsat direkte for bibliotek forberedelse og sekventering. Den resterende RNA (~4,4 μg) blev behandlet i henhold til MeRIP-Seq-rørledningen, som starter med inkubation af fragmenteret RNA med perler bundet enten til anti-m6A specifikke antistoffer eller til anti-IgG antistoffer som kontrol. m6A-specifik RIP (MeRIP) på 2,5 μg fragmenteret RNA gjorde det muligt at hente ca. 15 ng m6A-beriget materiale, der gennemgik biblioteksforberedelse og sekventering (figur 2B). RIP med anti-IgG-kontrol gav som forventet ikke nok RNA til at muliggøre yderligere analyse (figur 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig02.jpg"> Figur 2: MeRIP-Seq pipeline. A) Skematisk repræsentation af MeRIP-Seqs arbejdsgange og inputstyring. Ved poly-A-udvælgelse blev prøverne fragmenteret i 120-150 nt stykker og, enten direkte udsat for sekventering (100 ng, inputkontrol) eller anvendt til RNA-immunprecipitation (2,5 μg, RIP) med anti-m6A specifikt antistof eller anti-IgG-antistof som negativ kontrol før sekventering. B) Repræsentative resultater, der viser forventede RNA-distributionsprofiler (størrelse og beløb) ved fragmentering (øverste panel) og RIP (underpaneler, MeRIP: venstre, IgG-kontrol: højre). Prøver blev indlæst på fragment analysator til at evaluere RNA kvalitet og koncentration før yderligere behandling til biblioteket forberedelse og sekventering. Fragmenteret RNA-analyse blev udført ved hjælp af RNA-standardfølsomhedssættet, mens immunprecipiterede RNA brugte højfølsomt sæt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
BS-Seq rørledning tillader udforskning af m5C RNA modifikation ved nukleotidopløsning og fører til identifikation af m5C-methylerede udskrifter. Ved bisulfitkonvertering omdannes ikke-methylerede cytosiner til uracil, mens methylerede cytosiner forbliver uændrede (figur 3A). På grund af de barske forhold i bisulfitkonverteringsproceduren (dvs. høj temperatur og lav pH)) er konverterede mRNAs stærkt nedbrudte (figur 3B), men dette forstyrrer ikke biblioteksforberedelse og sekventering. Bisulfitkonvertering er kun effektiv på enkeltstrenget RNA og kan således potentielt hæmmes af sekundære dobbeltstrengede RNA-strukturer. For at evaluere effektiviteten af C-U-konvertering introducerede vi to kontroller. Som en positiv kontrol udnyttede vi den tidligere beskrevne tilstedeværelse af en stærkt methyleret cytosin i position C4447 af 28S rRNA23. Ved RT-PCR forstærkning og sekventering af et 200 bp fragment omkring methylerede sted kunne vi observere, at alle cytosiner med succes blev konverteret til uracils og derved fremstår som thymidiner i DNA-sekvensen, undtagen cytosin i position 4447, der forblev uændret. Som en kontrol for bisulfitkonverteringsfrekvens brugte vi kommercielt tilgængelige syntetiske ERCC RNA-sekvenser. Denne blanding består i en pulje af kendte, ikke-methylerede og poly-adenylerede RNA sekvenser, med en række sekundære strukturer og længder. Ved biblioteksforberedelse og sekventering fokuserede vi på disse ERCC-sekvenser for at beregne konverteringsfrekvensen, som kan udføres ved at tælle antallet af konverterede C blandt de samlede C-rester i alle ERCC-sekvenser og i hver prøve. Vi opnåede en konverteringsfrekvens på 99,5%, hvilket bekræftede effektiviteten og succesen af bisulfitkonverteringsreaktionen (figur 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig03.jpg"> Figur 3: BS-Seq-rørledningen. A) Skematisk repræsentation af arbejdsgangen BS-Seq. Ved poly-A-udvælgelse udsættes prøver for bisulfit, hvilket resulterer i C til U-konvertering (på grund af deaminering) for ikke-methylerede C-rester. I modsætning hertil påvirkes methylerede C-rester (m5C) ikke af bisulfitbehandling og forbliver uændrede. B) Repræsentativt resultat af bisulfit konverteret RNA fordelingsprofil (størrelse og mængde) ved analyse på fragmentanalysator med et standardfølsomhedssæt. C) Elektropherogram, der viser repræsentativ sekventeringsresultat af RT-PCR-amplicon i området omkring 100% methyleret C ved position 4447 i 28S rRNA (fremhævet med blåt). I modsætning hertil blev C-rester af referencesekvensen identificeret som T-rester i ampliconsekvensen på grund af bisulfitkonverteringssucces. D) Evaluering af C-U-konverteringsfrekvens ved analyse af ERCC spike-in sekvenser i hiv-inficerede og ikke-inficerede celler. Den gennemsnitlige konverteringsfrekvens er på 99,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
M6A-berigede prøver, bisulfitomerede prøver og inputkontroller behandles yderligere til biblioteksforberedelse, sekventering og bioinformatisk analyse (figur 4). Ifølge det eller de eksperimentelle design og biologiske spørgsmål, der behandles, kan der anvendes flere bioinformatiske analyser. Som bevis for princippet her viser vi repræsentative resultater fra en potentiel anvendelse (dvs. differential methyleringsanalyse), der fokuserer på identifikation af differentieret methylerede udskrifter induceret ved hiv-infektion. Kort, vi undersøgte m6A eller m5C methylering niveau af udskrifter, uafhængigt af deres genekspressionsniveau, i både ikke-inficerede og HIV-inficerede celler, for yderligere at forstå den rolle, RNA methyleringer under viral livscyklus. Ved genekspression normalisering, vi identificeret, at ZNF469 udskrift var differentieret m6A-methyleret i henhold til infektionen status, ja denne udskrift var ikke methyleret i ikke-inficerede celler, mens det viste flere methylerede toppe på HIV-infektion (Figur 5A). En lignende differential methyleringsanalyse på m5C viste, at PHLPP1-udskriften indeholdt flere methylerede rester, som har tendens til at være hyppigere methyleret i HIV-tilstanden (figur 5B). I denne sammenhæng tyder begge analyser på, at hiv-infektion påvirker det cellulære epitranscriptom.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig04.jpg"> Figur 4: Skematisk repræsentation af den bioinformatiske arbejdsgang til analyse af m6A- og m5C-data <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig04large.jpg" target="_blank">. Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig05.jpg"> Figur 5: Eksempel på differentieret methylerede udskrifter ved infektion. A) Repræsentativt resultat, der viser m6A methylering af ZNF459 udskrift i HIV-inficerede (grønne) og ikke-inficerede (grå) celler. Peak intensitet (ved input udtryk subtraktion) er vist på y-aksen og position i kromosomet langs x-aksen. Differential methylering analyse afslører, at ZFN469 udskrift er hypermethylated på HIV-infektion. B) Repræsentativt resultat af m5C methyleret gen i HIV-inficerede (øvre bane) og ikke-inficerede (nedre bane) celler. Højden af hver bjælke repræsenterer antallet af aflæsninger pr. nukleotid og giver mulighed for dækningsvurdering. Hver C-rest i repræsenteret i rødt, og andelen af methyleret C er repræsenteret i blåt. Den nøjagtige methyleringshastighed (%) rapporteres over hver C-rest. Pile fremhæver statistisk signifikant differentieret methyleret C. Prøver blev visualiseret ved hjælp af IGV viewer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

RNA-modifikationernes rolle i virusinfektioner er lige begyndt at blive undersøgt og kunne fremhæve nye virale interaktionsmekanismer. I dette arbejde leverer vi en pipeline til at undersøge m6A og m5C RNA ændringer i forbindelse med virusinfektioner.

Udforskning af m6A og m5C Epitranscriptomes om virusinfektion: et eksempel med HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

Hej, i denne video vil vi vise dig, hvordan du udforsker m6A og m5C epitranscriptomes ved virusinfektion. For at starte eksperimentet skal du bruge 50 millioner celler til de ikke-inficerede og 50 millioner til den inficerede tilstand. For at opnå en høj kvalitet datasæt ved analyse, du bliver nødt til at opnå en universel infektion.Her inficerer vi disse celler med en HIV-baseret vektor og måler den viralt kodede GFP af FACS. I dette tilfælde havde vi 80% af inficerede celler og fortsatte med arbejdsgangen startende med den samlede RNA-ekstraktion. Vi delte cellerne i 10 millioner hver og lysede dem i 1 mL Trizol.Vi tilføjede derefter 200 mikroliter kloroform til cellelyset og blandet ved inversion. På dette tidspunkt lader vi lysatet sidde i tre minutter ved stuetemperatur og centrifugere derefter alle prøver ved høj hastighed i 15 minutter ved fire grader. Du forventer at se en faseadskillelse i tre forskellige faser, som det er vist her.RNA sidder i den øverste fase, så overfør forsigtigt den vandige fase til et frisk rør ved at være opmærksom på ikke at overføre det organiske lag. På dette tidspunkt tilsættes 0,5 mL isopropanol til den vandige fase og blandes omhyggeligt ved inversion. Prøver kan derefter inkuberes en time ved 80 grader for at sikre RNA nedbør.Ved centrifugering ved høj hastighed, bør du være i stand til at se en dejlig RNA pellet som det er vist her. Kassér forsigtigt supernatanten enten ved inversion eller ved pipettering, idet du er opmærksom på ikke at forstyrre pelleten. Vask derefter RNA pellet med en mL på 75% molekylær kvalitet ethanol.Og hvirvle prøven kort. Ved centrifugering skal du sørge for at hente en dejlig hvid RNA pellet. Kassér supernatanten og lad RNA-pelleten tørre i 15 minutter ved stuetemperatur.Resuspend hver pellet i 20 mikroliter vand og pool alle prøve fra samme tilstand sammen. Total RNA er nu klar til mRNA isolation ved poly-A udvælgelse. For hver prøve på 75 mikrogram RNA skal der forberedes 200 mikroliter oligo-DT magnetiske perler og vaskes i en mL bindende buffer.Placer røret på en magnetisk stativ og lad perlerne til at binde sig til magneten under en blanding. Kassér supernatanten, og gentag proceduren for en anden vask. Fjern derefter perlerne fra de magnetiske stativer og genbrug dem forsigtigt i 100 mikroliter bindende buffer.På dette tidspunkt skal du forberede RNA-prøven ved at dividere dem i 75 mikrogram RNA pr. aliquot, der er suspenderet i 100 mikroliter vand. Tilsæt 100 mikroliter bindende buffer og inkuber i to minutter ved 65 grader. Drej derefter prøverne ned og inkuberes på is.Tilsæt derefter 100 mikroliter af vaskede magnetiske perler til hver RNA-prøve og lad binding på et roterende hjul i 15 minutter ved stuetemperatur. Ved inkubation skal du placere røret tilbage i et magnetisk rack og lade dem inkubere i et minut. Derefter inddrive supernatant i et frisk rør og holde det til side for en anden runde af isolation.Vask perlerne to gange med 200 mikroliter vaskebuffer og fortsæt derefter til elution. For at elute poly-A udvalgte RNA fra de magnetiske perler, tilføje 20 mikroliter af iskold TRIS HCl til hver prøve og pipette omhyggeligt. Inkuber derefter dine prøver ved 80 grader i to minutter for at frigøre RNA fra perlerne.Overfør supernatanten, der indeholder poly-A udvalgte RNA til et frisk rør, idet man er forsigtig med at undgå perleroverførsel. Elutionstrinnet samt isolationstrinnet skal gentages to gange for at øge mRNA-udbyttet. mRNA er nu klar til enten at komme ind i meRIP-Seq-rørledningen ved fragmenteringstrinnet eller gå direkte til bisulfitkonvertering.Det første skridt til at komme ind i meRIP-Seq-rørledningen består i mRNA-fragmentering. Til dette har du brug for fem mikrogram mRNA opdelt i aliquots af 18 mikroliter i 0,2 ML rør. For at sikre ensartede data er det afgørende at arbejde hurtigt og med kun få eksempler på det tidspunkt.Til dette eksperiment er fragmenteringen blevet optimeret for at opnå fragment af en størrelse mellem 115 og 200 nukleotider. Derefter tilsættes to mikroliter fragmentering reagens til hvert rør, der indeholder 18 mikroliter af mRNA er omhyggelig med at deponere dråben på rørvæggen. Skru ned for alle prøver for at muliggøre kontakt mellem reagenset og RNA på samme tid og inkuberes ved 70 grader i 15 minutter.Når inkubationen er overstået, skal reaktionen stoppes ved at tilsætte to mikroliter på 0,5 M EDTA. På dette tidspunkt kan du rense dit fragmenterede mRNA med din valgte metode og fortsætte til en RNA-kvalitetskontrol ved fragmentanalysator. Dette trin er valgfrit, men det vil gøre det muligt at vurdere størrelsen af fragmentet, før du aktiverer RNA nedbør.Som du kan se her i fjerde vognbane, får vi for både vores prøve fragment på omkring 150 nukleotid hver. Vi fortsatte derefter med meRIP-Seq. Det første trin består i par A /G magnetiske perler med enten anti-m6A antistoffer eller IgG kontrol.For hver reaktionsplan overføres 25 mikroliter magnetiske perler til et friskrør. Bemærk, at du skal bruge mindst en m6A-specifik tilstand og en kontroltilstand. Vask hver 25 mikroliter af perler med 250 mikroliter IP-buffer.Forsigtigt genbruge perlerne ved pipetter op og ned og placere røret på den magnetiske rack i et minut for at tillade perle adskillelse. Fjern og kassér supernatanten, vær opmærksom ved ikke at aspirer de magnetiske perler og gentag vasketrinnet en gang. Derefter genbruges de magnetiske perler i 100 mikroliter IP-buffer pr. hver 25 mikroliter af original mængde perler.Forbered og mærk et rør pr. betingelse. I vores tilfælde vil vi have to rør til den inficerede tilstand, En til m6A og en til IgG-kontrol og to rør til den ikke-inficerede tilstand. Tilsæt derefter 100 mikroliter vaskede perler i hvert rør.Perler er nu klar til at blive kombineret med specifikke antistoffer eller IgG kontrol. Tilsæt fem mikrogram af enten specifikke anti-m6A antistof eller anti-IgG kontrol antistof til hvert rør, der indeholder 100 mikroliter af vaskede magnetiske perler. Tillad antistofperler bøjning ved at inkubere røret 30 minutter på et roterende hjul.I mellemtiden skal du fortsætte med prøveforberedelse. For hver planlagt tilstand, enten m6A-specifik eller IgG-kontrol, vil dit udgangsmateriale være 2,5 mikrogram fragmenteret mRNA suspenderet 100 mikroliter vand. Hvis du vil have et endeligt reaktionsvolumen på 500 mikroliter, skal du tilsætte 295 mikroliter vand til hver prøve.Tilsæt derefter fem mikroliter RNAase-hæmmer koncentreret ved 40 enheder pr. mikroliter for en samlet mængde på 200 enheder pr. prøve og bland forsigtigt. Endelig tilsættes 100 mikroliter af 5X koncentreret IP buffer til hvert rør. Prøverne er nu klar til immunudfældningsreaktionen.Hent de magnetiske perler kombineret med antistof fra det roterende hjul og drej dem ned. Tilsæt derefter 500 mikroliter af de tidligere forberedte prøver til hver 100 mikroliter af perler kombineret med de specifikke antistoffer. Bland forsigtigt ved pipetter op og ned flere gange for helt at genbruge perlerne.Inkuber dem eller din meRIP reaktion på et roterende hjul ved fire grader i løbet af to timer. Når inkubationen er overstået, drej ned hvert rør og læg dem på et magnetisk rack i et minut for at tillade perleadskillelse. Fjern derefter den ubundne brøk og læg den på et nyt rør og hold den til yderligere analyse, hvis det er nødvendigt.Fjern magneten fra stativet og genbrug alle prøver i 500 mikroliter IP-buffer. Brug hver prøve omhyggeligt ved at pipetter op og ned. Indsæt magneten på stativet, inkuber i et minut, og fjern derefter forsigtigt supernatanten.Gentag vasken to gange, og fortsæt derefter med elution. For hvert par prøver, m6A specifik og kontrol, forberede 225 mikroliter af elution buffer indeholdende 20 millimolar af renset m6A. Tilsæt derefter 100 mikroliter elutionbuffer pr. prøve.Inkuber alle prøve en time ved fire grader på en rocker. Derefter samles alle m6A beriget RNA prøve i et frisk rør og fortsætte med en anden runde af elution. Rense m6A beriget RNA med din valgte metode Og så på dette tidspunkt prøver er klar til bibliotek forberedelse og sekventering.For at undersøge m5C-ændringen bruger vi bisulfitkonvertering. Start eksperimentet med 500 nanogram poly-adenyleret RNA. Selvom det er valgfrit, vil tilføjelse til din prøve 500 pikogram af poly-A udtømt RNA for at sikre ribosomale repræsentation og 0,5 mikroliter af kommercielt tilgængelige syntetiske sekvens giver dig mulighed for at vurdere bisulfit konverteringsfrekvens ved sekventering.Juster prøven til et endeligt volumen på 20 mikroliter i vand, og tilsæt derefter 130 mikroliter RNA-konverteringsreagens til hver prøve. Bland forsigtigt ved pipetter op og ned og spin ned alle prøve for at sikre, at der ikke er dråber tilbage på siden af rørene. Inkuberes alle prøver i en PCR-maskine i tre cyklusser af denaturering 70 grader i fem minutter og bisulfitkonvertering ved 54 grader i løbet af 45 minutter.Udfør deaminering i kolonnen ved at tilføje direkte på en tom kolonne, 250 mikroliter RNA-bindingsbuffer, 150 mikroliter af din bisulfitkonomerede prøve. Bland prøven ved pipetter op og ned, men vær opmærksom ved ikke at røre kolonnefiltrene. Der tilsættes 400 mikroliter 95-100% ethanol til den prøve RNA-bindingsbufferblanding, der er direkte i kolonnen.Luk hætten og bland straks ved inversion. Skru ned for prøven i 30 sekunder, og kassér gennemstrømningen. Vask din kolonne med vaskebuffer, og tilsæt derefter 200 mikroliter desulfoneringsopløsning til midten af hver kolonne.Inkuber alle dine prøver i 30 minutter ved stuetemperatur. Drej prøven ned i 30 sekunder, og fortsæt derefter med to vaskerunder. Tilsæt 400 mikroliter vaskebuffer til hver prøve, centrifuge i 30 sekunder ved fuld hastighed og kassér flow-through.Placer kolonnen i et nyt tomt rør og elute bisulfit konverteret RNA i 20 mikroliter vand. Kontroller bisulfitkonverteringseffektiviteten ved RT-qPCR, og fortsæt derefter til biblioteksforberedelse og -rækkefølge. Ved bioinformatisk analyse er her et eksempel på resultater, som du kan opnå med denne arbejdsgang.Her sammenligner vi epitranscriptomet af HIV-inficerede celler versus ikke-inficerede celler. efter infektion. I A-panelet kan du se de resultater, vi får ved at udforske m6A epitranscriptom.I denne graf plotter vi m6A beriget læser på meRIP-Seq analyse. Vi kan godt se, at en zinkfinger er hypermethyleret 24 timer efter infektionen. Vi udførte den samme type analyse for m5C epitranscriptom undersøgelse i panel B.In denne graf, hver ikke-methyleret cytosin vises i rødt, mens andelen af cytosin, der er blevet m5C methyleret er vist med blåt.Som du kan se, PHLPP1, alle tre cytosiner, der er hyper-methyleret 24 timers post-HIV-infektion. Samlet set denne arbejdsgang gør det muligt at undersøge både M6A og m5C epitranscriptom af inficerede celler og kan anvendes som sådan på viruspartikler samt. Forståelse af virusinfektion er i stand til at ændre værten epitranscriptomic landskab vil give os adgang til et nyt lag af regulering.Undersøgelsen af differentierede methylerede udskrifter på virusinfektion vil naturligvis give en værdifuld ressource for nye terapeutiske intervention. På linket her nedenfor kan du finde vores open access ressource til undersøgelse af differentieret methyleret udskrift om hiv-infektion over tid.

Research

JoVE Journal

Biology

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Måling af Osmotisk Vand permeabilitetskoefficienten (P<sub&gt; F</sub&gt;) Af sfæriske celler: Isolerede planteprotoplaster som et eksempel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

Infiltrationen-centrifugering Teknik for Udvinding af apoplastisk Fluid fra Plant Blade Brug<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Som et eksempel

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfektion RAW264.7 Celler med en luciferasereportergen

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Vurdering af mineraltilgængelighed i fiskefoder ved hjælp af komplementære metoder demonstreret med eksemplet med zink i atlanterhavslaks

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Enkelt celle mikro-aspiration som en alternativ strategi for fluorescens-aktiverede celle sortering for Giant virus blanding adskillelse

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Isolering, spredning og differentiering af stamceller fra rhesus Macaque

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...