Name: exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv
Uploaded: 2022-03-05T13:00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (subsidies 31003A_166412 en 314730_188877).

<ol>
	<li>Machnicka, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways--2013+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways--2013 update.</a> Nucleic Acids Research. 41, 262-267 (2013).</li><li>Zaccara, S., Ries, R. J., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading,+writing+and+erasing+mRNA+methylation.">Reading, writing and erasing mRNA methylation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 608-624 (2019).</li><li>Davalos, V., Blanco, S., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Messenger+RNA+Modifications.">SnapShot: Messenger RNA Modifications.</a> Cell. 174 (2), 498 (2018).</li><li>Saletore, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+birth+of+the+Epitranscriptome:+deciphering+the+function+of+RNA+modifications.">The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).</li><li>Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications.">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2017).</li><li>Netzband, R., Pager, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+marks:+Emerging+modulators+of+RNA+virus+gene+expression.">Epitranscriptomic marks: Emerging modulators of RNA virus gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (3), 1576 (2020).</li><li>Pereira-Montecinos, C., Valiente-Echeverria, F., Soto-Rifo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+regulation+of+viral+replication.">Epitranscriptomic regulation of viral replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (4), 460-471 (2017).</li><li>Lichinchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+human+and+viral+m(6)A+RNA+methylomes+during+HIV-1+infection+of+T+cells.">Dynamics of the human and viral m(6)A RNA methylomes during HIV-1 infection of T cells.</a> Nature Microbiology. 1, 16011 (2016).</li><li>Courtney, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+Addition+of+m(5)C+to+HIV-1+Transcripts+Regulates+Viral+Gene+Expression.">Epitranscriptomic Addition of m(5)C to HIV-1 Transcripts Regulates Viral Gene Expression.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).</li><li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+m(6)A+Editing+of+HIV-1+mRNAs+Enhances+Viral+Gene+Expression.">Posttranscriptional m(6)A Editing of HIV-1 mRNAs Enhances Viral Gene Expression.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 675-685 (2016).</li><li>Tirumuru, N., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+envelope+proteins+up-regulate+N+(6)-methyladenosine+levels+of+cellular+RNA+independently+of+viral+replication.">HIV-1 envelope proteins up-regulate N (6)-methyladenosine levels of cellular RNA independently of viral replication.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3249-3260 (2019).</li><li>Tirumuru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+of+HIV-1+RNA+regulates+viral+infection+and+HIV-1+Gag+protein+expression.">N(6)-methyladenosine of HIV-1 RNA regulates viral infection and HIV-1 Gag protein expression.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell.">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> Frontiers in Virology. 1 (11), (2021).</li><li>Khoddami, V., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+target+profiling+of+RNA+cytosine+methyltransferases+using+the+mechanism-based+enrichment+procedure+Aza-IP.">Transcriptome-wide target profiling of RNA cytosine methyltransferases using the mechanism-based enrichment procedure Aza-IP.</a> Nature Protocols. 9 (2), 337-361 (2014).</li><li>Hussain, S., Aleksic, J., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (11), 215 (2013).</li><li>Dominissini, D., Moshitch-Moshkovitz, S., Salmon-Divon, M., Amariglio, N., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+mapping+of+N6-methyladenosine+by+m6A-seq+based+on+immunocapturing+and+massively+parallel+sequencing.">Transcriptome-wide mapping of N6-methyladenosine by m6A-seq based on immunocapturing and massively parallel sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (1), 176-189 (2013).</li><li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq.">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li><li>Shobbir Hussain, J. A., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (215), (2013).</li><li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+5-methylcytosine+profiles+in+poly(A)+RNA+from+mouse+embryonic+stem+cells+and+brain.">Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain.</a> Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).</li><li>Endrullat, C., Gl&#246;kler, J., Franke, P., Frohme, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+and+quality+management+in+next-generation+sequencing.">Standardization and quality management in next-generation sequencing.</a> Applied &amp; Translational Genomics. 10, 2-9 (2016).</li><li>Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+cytosine+methylation+analysis+by+bisulfite+sequencing.">RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 12 (2009).</li><li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell.">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> biorxiv. 1 (11), (2021).</li><li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+noncoding+RNA.">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and noncoding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li><li>Aschenbrenner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+DNA+Polymerase+for+Direct+m(6)+A+Sequencing.">Engineering of a DNA Polymerase for Direct m(6) A Sequencing.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 57 (2), 417-421 (2018).</li><li>Didion, J. P., Martin, M., Collins, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atropos:+specific,+sensitive,+and+speedy+trimming+of+sequencing+reads.">Atropos: specific, sensitive, and speedy trimming of sequencing reads.</a> PeerJ. 5, 3720 (2017).</li><li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISAT:+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements.">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Okonechnikov, K., Conesa, A., Garc&#237;a-Alcalde, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualimap+2:+advanced+multi-sample+quality+control+for+high-throughput+sequencing+data.">Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., K&#228;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet Journal. 17 (1), (2011).</li><li>Shen, W., Le, S., Li, Y., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeqKit:+A+Cross-Platform+and+Ultrafast+Toolkit+for+FASTA/Q+File+Manipulation.">SeqKit: A Cross-Platform and Ultrafast Toolkit for FASTA/Q File Manipulation.</a> PLOS ONE. 11 (10), 0163962 (2016).</li><li>Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=meRanTK:+methylated+RNA+analysis+ToolKit.">meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit.</a> Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De rol van RNA-modificaties bij virale infecties is nog grotendeels onbekend. Een beter begrip van de rol van epitranscriptomische modificaties in de context van virale infectie zou kunnen bijdragen aan de zoektocht naar nieuwe antivirale behandelingsdoelen.
In dit werk bieden we een complete workflow die onderzoek van de m6A- en m5C-epitranscriptomen van geïnfecteerde cellen mogelijk maakt. Afhankelijk van de biologische vraag adviseren wij om poly-A-geselecteerd RNA als uitgangsmateriaal te gebruiken. Hoewel optioneel, omdat de pijplijn kan worden gebruikt met totaal RNA, is het belangrijk om in gedachten te houden dat rRNA's en kleine RNA's sterk gemodificeerd zijn en een belangrijk aantal gemethyleerde residuen bevatten. Dit kan resulteren in een verminderde kwaliteit en kwantiteit van zinvolle sequencinggegevens.
Als de focus van de studie echter niet-poly-geïdenyleerd RNA is, moet de RNA-extractiestap worden aangepast om te voorkomen dat klein RNA wordt weggegooid (in het geval van kolomgebaseerde RNA-extractie) en om ribosoom-depletietechnieken te bevoordelen in plaats van poly-A-selectie om de pijplijn binnen te gaan.
Om te zorgen voor RNA van hoge kwaliteit, correcte fragmentatie en geschikte m6A-verrijkte en BS geconverteerde RNA-kwaliteit voor bibliotheekvoorbereiding, raden we ten zeerste aan om een fragmentanalysator of een bioanalysator te gebruiken. Deze apparatuur is echter niet altijd beschikbaar. Als alternatief kunnen de kwaliteit van RNA, mRNA en de grootte van gefragmenteerd RNA ook worden beoordeeld door visualisatie op agarosegel. Als alternatief kan bibliotheekvoorbereiding worden uitgevoerd zonder voorafgaande beoordeling van de RNA-hoeveelheid.
We gebruikten de op antilichamen gebaseerde MeRIP-Seq16-techniek om het m6A epitranscriptomische landschap te verkennen. Deze techniek is gebaseerd op RNA-immunoprecipitatie en is succesvol; sommige stappen vereisen echter zorgvuldige optimalisatie en kunnen van cruciaal belang zijn. Hoewel m6A-methylatie voornamelijk binnen de consensussequentie RRA*CH voorkomt, komt dit motief zeer vaak voor langs mRNA-moleculen en maakt het geen nauwkeurige identificatie van de gemethyleerde plaats mogelijk. Het is dus van cruciaal belang om een reproduceerbare en consistente RNA-fragmentatie te bereiken, waarbij kleine RNA-fragmenten worden gegenereerd, om de op RIP gebaseerde resolutie te verbeteren. In dit protocol bevelen we een geoptimaliseerde procedure aan, die reproduceerbare en consistente resultaten oplevert in onze experimentele omgeving; Deze fragmentatiestap moet echter mogelijk verder worden geoptimaliseerd op basis van specifieke voorbeeldfuncties.
Onlangs werd een nieuwe techniek beschreven die m6A directe sequencing mogelijk maakt. Het is gebaseerd op het gebruik van specifieke reverse transcriptasevarianten die unieke RT-handtekeningen vertonen als reactie op het tegenkomen van m6A RNA-modificatie24. Deze technologie zou, na zorgvuldige optimalisatie, de belangrijkste beperking van MeRIP-Seq kunnen omzeilen (het verminderen van de hoeveelheid initieel materiaal en het toestaan van een hogere resolutie). Om de m5C-modificatie te onderzoeken, hebben we besloten om de bisulfietconversietechniek te gebruiken om bij nucleotideresolutie de gemodificeerde C-residuen te detecteren. Om de fout-positieve snelheid als gevolg van de aanwezigheid van secundaire RNA-structuren te verminderen, voerden we 3 cycli van denaturatie / bisulfietconversie uit en controleerden we de prestaties van de bisulfietconversie dankzij het gebruik van ERCC-spike-in-controles. Een van de beperkingen die aan deze techniek zijn gekoppeld, is dat bisulfietconversie zeer hard is en dat drie cycli van denaturatie / bisulfietconversie een deel van het RNA kunnen afbreken en dus de resolutie kunnen verminderen. In onze setting hebben we er echter voor gekozen om genoegen te nemen met een mogelijk iets lagere resolutie om de kwaliteit van de dataset te verhogen.
Dankzij deze optimalisaties en controles waren we in staat om een betrouwbare en degelijke workflow te bieden die kan worden gebruikt om het epitranscriptomische landschap en de verandering ervan te onderzoeken in de context van virale infecties, gastheer-pathogeen interacties of blootstelling aan specifieke behandelingen.

Het is al lang bekend dat RNA-moleculen kunnen worden gemodificeerd en tot op heden zijn er meer dan 150 post-transcriptionele modificaties beschreven1. Ze bestaan uit de toevoeging van chemische groepen, voornamelijk methylgroepen, aan vrijwel elke positie van de pyrimidine- en purineringen van RNA-moleculen2. Van dergelijke post-transcriptionele modificaties is al aangetoond dat ze sterk verrijkt zijn in transfer RNA (tRNA) en ribosomaal RNA (rRNA) en zijn onlangs ook beschreven op mRNA-moleculen.
De opkomst van nieuwe technologieën, zoals Next Generation Sequencing (NGS), en de productie van specifieke antilichamen die bepaalde chemische modificaties herkennen, maakten voor het eerst het onderzoek naar de locatie en de frequentie van specifieke chemische modificaties op transcriptoombreed niveau mogelijk. Deze ontwikkelingen hebben geleid tot een beter begrip van RNA-modificaties en tot het in kaart brengen van verschillende modificaties op mRNA-moleculen3,4.
Terwijl epigenetica de rol van DNA en histonmodificaties in transcriptoomregulatie onderzoekt, richt epitranscriptomics zich op een vergelijkbare manier op RNA-modificaties en hun rol. Het onderzoek naar epitranscriptomische modificaties biedt nieuwe mogelijkheden om nieuwe reguleringsmechanismen te benadrukken die een verscheidenheid aan cellulaire processen kunnen afstemmen (d.w.z. RNA-splicing, export, stabiliteit en translatie)5. Het was dus geen grote verrassing dat recente studies veel epitranscriptomische modificaties bij virale infectie in zowel cellulaire als virale RNA's6 blootlegden. Virussen die tot nu toe zijn onderzocht, omvatten zowel DNA- als RNA-virussen; onder hen kan HIV worden beschouwd als een baanbrekend voorbeeld. Al met al kan de ontdekking van RNA-methylatie in de context van virale infecties het onderzoek naar nog onbeschreven mechanismen van virale expressie of replicatie mogelijk maken, waardoor nieuwe hulpmiddelen en doelen worden geboden om ze te beheersen7.
Op het gebied van HIV-epitranscriptomica zijn modificaties van virale transcripten op grote schaal onderzocht en hebben aangetoond dat de aanwezigheid van deze modificatie gunstig was voor virale replicatie8,9,10,11,12,13. Tot op heden kunnen verschillende technieken worden gebruikt om epitranscriptomische tekens op transcriptoombreed niveau te detecteren. De meest gebruikte technieken voor m6A-identificatie zijn gebaseerd op immuunprecipitatietechnieken zoals MeRIP-Seq en miCLIP. Terwijl MeRIP-Seq vertrouwt op RNA-fragmentatie om fragmenten met gemethyleerde residuen te vangen, is miCLIP gebaseerd op het genereren van α-m6A-antilichaamspecifieke signatuurmutaties op RNA-antilichaam UV-crosslinking, waardoor een nauwkeurigere mapping mogelijk is.
Detectie van m5C-modificatie kan worden bereikt door op antilichamen gebaseerde technologieën die vergelijkbaar zijn met m6A-detectie (m5C RIP), of door bisulfietconversie of door AZA-IP of door miCLIP. Zowel Aza-IP als m5C miCLIP gebruiken een specifiek methyltransferase als lokaas om RNA te targeten terwijl ze door RNA-methylatie gaan. In Aza-IP worden doelcellen blootgesteld aan 5-azacytidine, wat resulteert in de willekeurige introductie van cytidine-analoge 5-azacytidine-sites in ontluikend RNA. In miCLIP is het NSun2-methyltransferase genetisch gemodificeerd om de C271A-mutatie te herbergen14,15.
In dit werk richten we ons op de dubbele karakterisering van m6A- en m5C-modificaties in geïnfecteerde cellen, met HIV als model. Op methodologische optimalisatie hebben we een workflow ontwikkeld die gemethyleerde RNA-immunoprecipitatie (MeRIP) en RNA-bisulfietconversie (BS) combineert, waardoor de gelijktijdige verkenning van m6A- en m5C-epitranscriptomische markeringen op transcriptoombreed niveau mogelijk is, in zowel cellulaire als virale contexten. Deze workflow kan worden geïmplementeerd op cellulaire RNA-extracten en op RNA geïsoleerd uit virale deeltjes.
De Methylated RNA ImmunoPrecipitation (MeRIP)16-benadering die onderzoek van m6A op transcriptoombreed niveau mogelijk maakt, is goed ingeburgerd en een reeks m6A-specifieke antilichamen zijn tot op heden commercieel beschikbaar17. Deze methode bestaat uit het selectief vastleggen van m6A-bevattende RNA-stukjes met behulp van een m6A-specifiek antilichaam. De twee belangrijkste nadelen van deze techniek zijn (i) de beperkte resolutie, die sterk afhankelijk is van de grootte van RNA-fragmenten en dus een geschatte locatie en regio biedt die het gemethyleerde residu bevat, en (ii) de grote hoeveelheid materiaal die nodig is om de analyse uit te voeren. In het volgende geoptimaliseerde protocol hebben we de fragmentgrootte gestandaardiseerd tot ongeveer 150 nt en de hoeveelheid uitgangsmateriaal teruggebracht van 10 μg poly-A-geselecteerd RNA, wat momenteel de geadviseerde hoeveelheid uitgangsmateriaal is, tot slechts 1 μg poly-A-geselecteerd RNA. We hebben ook de herstelefficiëntie van m6A-RNA-fragmenten die gebonden zijn aan specifieke antilichamen gemaximaliseerd met behulp van een elutie door een concurrentiebenadering met een m6A-peptide in plaats van meer conventionele en minder specifieke elutiemethoden met behulp van fenolgebaseerde technieken of proteïnase K. De belangrijkste beperking van deze rip-gebaseerde test blijft echter de suboptimale resolutie die de identificatie van het precieze gemodificeerde A-nucleotide niet mogelijk maakt.
Analyse van het m5C-merkteken kan momenteel worden uitgevoerd met behulp van twee verschillende benaderingen: een op RIP gebaseerde methode met m5C-specifieke antilichamen en RNA-bisulfietconversie. Omdat RIP slechts een beperkte resolutie biedt voor de identificatie van het gemethyleerde residu, hebben we bisulfietconversie gebruikt die een enkele nucleotideresolutie kan bieden. RNA-blootstelling aan bisulfiet (BS) leidt tot cytosine-deaminering, waardoor het cytosineresidu wordt omgezet in uracil. Tijdens de RNA-bisulfietconversiereactie wordt dus elke niet-gemethyleerde cytosine gedeamineerd en omgezet in uracil, terwijl de aanwezigheid van een methylgroep op positie 5 van de cytosine een beschermend effect heeft, waardoor de BS-geïnduceerde deaminering wordt voorkomen en het cytosineresidu behouden blijft. De BS-gebaseerde benadering maakt de detectie van een m5C-gemodificeerd nucleotide bij enkelvoudige baseresolutie mogelijk en voor de beoordeling van de methylatiefrequentie van elk transcript, waardoor inzicht wordt verkregen in m5C-modificatiedynamiek18. De belangrijkste beperking van deze techniek is echter gebaseerd op de fout-positieve snelheid van gemethyleerde residuen. Inderdaad, BS-conversie is effectief op enkelstrengs RNA met toegankelijke C-residuen. De aanwezigheid van een strakke secundaire RNA-structuur kan echter de N5C-positie maskeren en BS-conversie belemmeren, wat resulteert in niet-gemethyleerde C-residuen die niet worden omgezet in U-residuen en dus valse positieven. Om dit probleem te omzeilen en het fout-positieve percentage te minimaliseren, hebben we 3 rondes van denaturatie- en bisulfietconversiecycli toegepast19. We hebben ook 2 controles in de monsters geïntroduceerd om de efficiëntie van bisulfietconversie te kunnen schatten: we spike-in ERCC-sequencingcontroles (niet-gemethyleerde gestandaardiseerde en commercieel beschikbare sequenties)20 evenals poly-A-uitgeputte RNA's om enerzijds de bisulfietconversiesnelheid te beoordelen en om door RT-PCR de aanwezigheid van een bekende en goed geconserveerde gemethyleerde locatie, C4447, te verifiëren, op 28S ribosomaal RNA daarentegen21.
Op het gebied van virologie maakt het koppelen van deze twee epitranscriptomische onderzoeksmethoden met next generation sequencing en nauwkeurige bioinformatische analyse de diepgaande studie van m6A- en m5C-dynamica mogelijk (d.w.z. RNA-modificatie temporele veranderingen die kunnen optreden bij virale infectie en een reeks nieuwe therapeutisch relevante doelen voor klinisch gebruik kunnen blootleggen).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrime Pfx SuperMix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12344-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ RNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>EZR5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-472-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-471-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina TruSeq Stranded mRNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Beads A/G Blend</td>
			<td>Merck</td>
			<td>16-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-Methyladenosine, 5&#8242;-monophosphate sodium salt (m6A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2780-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse IgG</td>
			<td>Merk</td>
			<td>12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo(dT)25</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61005,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRapace</td>
			<td>Stratec</td>
			<td>1020220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick RNA Viral Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Fragmentation Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv

De rol van RNA-modificaties in biologische processen is de afgelopen jaren de focus geweest van een toenemend aantal studies en staat tegenwoordig bekend als epitranscriptomics. Onder andere N6-methyladenosine (m6A) en 5-methylcytosine (m5C) RNA-modificaties zijn beschreven op mRNA-moleculen en kunnen een rol spelen bij het moduleren van cellulaire processen. Epitranscriptomics is dus een nieuwe laag van regulatie die naast transcriptomische analyses moet worden overwogen, omdat het ook kan worden gewijzigd of gemoduleerd door blootstelling aan een chemisch of biologisch agens, inclusief virale infecties.
Hier presenteren we een workflow die analyse mogelijk maakt van het gezamenlijke cellulaire en virale epitranscriptomische landschap van de m6A- en m5C-markeringen tegelijkertijd, in cellen die al dan niet zijn geïnfecteerd met het humaan immunodeficiëntievirus (HIV). Bij mRNA-isolatie en fragmentatie van HIV-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen, gebruikten we twee verschillende procedures: MeRIP-Seq, een op RNA-immunoprecipitatie gebaseerde techniek, om te verrijken voor RNA-fragmenten die het m6A-merk bevatten en BS-Seq, een op bisulfietconversie gebaseerde techniek, om de m5C-markering te identificeren met een enkele nucleotideresolutie. Bij methylatiespecifieke vangst worden RNA-bibliotheken voorbereid op high-throughput sequencing. We hebben ook een speciale bioinformatica-pijplijn ontwikkeld om differentieel gemethyleerde (DM) transcripties onafhankelijk van hun basale expressieprofiel te identificeren.
Over het algemeen maakt de methodologie het mogelijk om meerdere epitranscriptomische tekens tegelijkertijd te verkennen en biedt een atlas van DM-transcripten bij virale infectie of andere celverstoring. Deze aanpak biedt nieuwe mogelijkheden om nieuwe spelers en nieuwe mechanismen van celrespons te identificeren, zoals cellulaire factoren die virale replicatie bevorderen of beperken.

Deze workflow is nuttig gebleken om de rol van m6A- en m5C-methylatie in de context van HIV-infectie te onderzoeken. Hiervoor gebruikten we een CD4+ T cellijnmodel (SupT1) dat we ofwel infecteren met HIV of onbehandeld lieten. We begonnen de workflow met 50 miljoen cellen per aandoening en verkregen gemiddeld 500 μg totaal RNA met een RNA-kwaliteitsgetal van 10 (figuur 1A-B). Bij poly-A selectie haalden we tussen de 10 en 12 μg mRNA per conditie op (wat ongeveer 2% van het totale RNA vertegenwoordigt) (figuur 1B). Op dit punt gebruikten we 5 μg poly-A-geselecteerd RNA voor de MeRIP-Seq-pijplijn en 1 μg voor de BS-Seq-pijplijn. Omdat HIV-RNA gepoly-geïdenyleerd is, is er geen verdere actie nodig en kunnen MeRIP-Seq- en BS-Seq-procedures direct worden toegepast.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig01.jpg"> Figuur 1: RNA-voorbereiding voor downstreamtoepassingen. A) Workflow met RNA-voorbereiding en -distributie voor gelijktijdige MeRIP-Seq- en BS-Seq-pijplijnen. Elke gevulde zeshoekige vorm vertegenwoordigt een RNA-modificatietype, zoals m6A (groen) of m5C (roze). Hoeveelheden RNA-materiaal die nodig zijn om het experiment uit te voeren, worden aangegeven. B) Representatieve resultaten die de verwachte RNA-distributieprofielen (grootte en hoeveelheid) weergeven bij totale RNA-extractie (bovenste paneel) en poly-A-selectie (onderste paneel). Monsters werden op de fragmentanalysator geladen met standaard gevoeligheidskit om de RNA-kwaliteit te beoordelen voordat specifieke MeRIP-Seq- en BS-Seq-procedures werden ingevoerd. RQN: RNA-kwaliteitsnummer; nt: nucleotiden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
MeRIP-Seq-pijplijn is een op RNA-immunoprecipitatie gebaseerde techniek die onderzoek naar m6A-modificatie langs RNA-moleculen mogelijk maakt. Hiervoor wordt RNA eerst gefragmenteerd en vervolgens geïncubeerd met m6A-specifieke antilichamen gekoppeld aan magnetische kralen voor immunoprecipitatie en -vangst. MeRIP-verrijkte RNA-fragmenten en de onaangeroerde (input) fractie worden vervolgens gesequenced en vergeleken om m6A-gemodificeerde RNA-gebieden en dus m6A-gemethyleerde transcripten te identificeren (figuur 2A). De resolutie van de techniek is afhankelijk van de efficiëntie van RNA-fragmentatie. Kortere fragmenten zorgen inderdaad voor een nauwkeurigere lokalisatie van het m6A-residu. Hier werden cellulaire poly-A-geselecteerde RNA's en virale RNA's onderworpen aan iongebaseerde fragmentatie met RNA-fragmentatiebuffer gedurende 15 minuten in een eindvolume van 20 μL om RNA-fragmenten van 100-150 nt te verkrijgen. Beginnend met 5 μg mRNA, herstelden we 4,5 μg gefragmenteerd RNA, wat overeenkomt met een herstelpercentage van 90% (figuur 2B). We gebruikten 100 ng gefragmenteerd, gezuiverd RNA als inputcontrole, direct onderworpen aan bibliotheekvoorbereiding en sequencing. Het resterende RNA (~4,4 μg) werd verwerkt volgens de MeRIP-Seq-pijplijn, die begint met incubatie van gefragmenteerd RNA met kralen gebonden aan anti-m6A-specifieke antilichamen of aan anti-IgG-antilichamen als controle. m6A-specifieke RIP (MeRIP) van 2,5 μg gefragmenteerd RNA maakte het mogelijk om ongeveer 15 ng m6A-verrijkt materiaal op te halen dat bibliotheekvoorbereiding en sequencing onderging (figuur 2B). RIP met anti-IgG-controle leverde, zoals verwacht, niet genoeg RNA op om verdere analyse mogelijk te maken (figuur 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig02.jpg"> Figuur 2: MeRIP-Seq pipeline. A) Schematische weergave van MeRIP-Seq workflow en input control. Na poly-A-selectie werden monsters gefragmenteerd in 120-150 nt-stukken en ofwel direct onderworpen aan sequencing (100 ng, inputcontrole), of gebruikt voor RNA-immunoprecipitatie (2,5 μg, RIP) met anti-m6A-specifiek antilichaam of anti-IgG-antilichaam als negatieve controle voorafgaand aan sequencing. B) Representatieve resultaten met verwachte RNA-distributieprofielen (grootte en hoeveelheid) bij fragmentatie (bovenste paneel) en RIP (onderste panelen, MeRIP: links, IgG-controle: rechts). Monsters werden geladen op fragmentanalysator om de RNA-kwaliteit en -concentratie te evalueren voordat ze verder werden verwerkt tot bibliotheekvoorbereiding en sequencing. Gefragmenteerde RNA-analyse werd uitgevoerd met behulp van de RNA-standaardgevoeligheidskit, terwijl immunoprecipiteerd RNA de hoge gevoeligheidskit gebruikte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
BS-Seq-pijplijn maakt exploratie van m5C-RNA-modificatie bij nucleotideresolutie mogelijk en leidt tot de identificatie van m5C-gemethyleerde transcripten. Bij bisulfietconversie worden niet-gemethyleerde cytosines omgezet in uracil, terwijl gemethyleerde cytosines onveranderd blijven (figuur 3A). Vanwege de zware omstandigheden van de bisulfietconversieprocedure (d.w.z. hoge temperatuur en lage pH), worden geconverteerde mRNA's sterk afgebroken (figuur 3B), maar dit interfereert niet met bibliotheekvoorbereiding en sequencing. Bisulfietconversie is alleen efficiënt op enkelstrengs RNA en kan dus mogelijk worden belemmerd door secundaire dubbelstrengs RNA-structuren. Om de efficiëntie van C-U conversie te evalueren, hebben we twee controles geïntroduceerd. Als positieve controle maakten we gebruik van de eerder beschreven aanwezigheid van een sterk gemethyleerde cytosine in positie C4447 van het 28S rRNA23. Na RT-PCR-amplificatie en sequencing van een 200 bp-fragment rond de gemethyleerde site konden we waarnemen dat alle cytosines met succes werden omgezet in uracils, waardoor ze als thymidines in de DNA-sequentie verschenen, behalve de cytosine op positie 4447 die onveranderd bleef. Als controle voor de conversiesnelheid van bisulfiet gebruikten we in de handel verkrijgbare synthetische ERCC-RNA-sequenties. Dit mengsel bestaat uit een pool van bekende, niet-gemethyleerde en poly-gedenyleerde RNA-sequenties, met een verscheidenheid aan secundaire structuren en lengtes. Bij de voorbereiding en sequencing van de bibliotheek hebben we ons gericht op deze ERCC-sequenties om de conversieratio te berekenen, die kan worden uitgevoerd door het aantal geconverteerde C te tellen onder de totale C-residuen in alle ERCC-sequenties en in elk monster. We verkregen een conversiepercentage van 99,5%, wat de efficiëntie en het succes van de bisulfietconversiereactie bevestigt (figuur 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig03.jpg"> Figuur 3: BS-Seq pijplijn. A) Schematische weergave van bs-seq workflow. Bij poly-A-selectie worden monsters blootgesteld aan bisulfiet, wat resulteert in C naar U-conversie (als gevolg van deaminering) voor niet-gemethyleerde C-residuen. Gemethyleerde C-residuen (m5C) worden daarentegen niet beïnvloed door bisulfietbehandeling en blijven ongewijzigd. B) Representatief resultaat van bisulfiet geconverteerd RNA-distributieprofiel (grootte en hoeveelheid) na analyse op fragmentanalysator met een standaard gevoeligheidskit. C) Elektroferogram met representatief sequencingresultaat van RT-PCR-amplicon van het gebied rond de 100% gemethyleerde C op positie 4447 in 28S-rRNA (blauw gemarkeerd). Daarentegen werden C-residuen van de referentiesequentie geïdentificeerd als T-residuen in de ampliconsequentie als gevolg van bisulfietconversiesucces. D) Evaluatie van de C-U-conversieratio door analyse van ERCC-spike-in-sequenties in HIV-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen. De gemiddelde conversieratio is 99,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
M6A-verrijkte monsters, bisulfiet geconverteerde monsters en inputcontroles worden verder verwerkt voor bibliotheekvoorbereiding, sequencing en bioinformatische analyse (figuur 4). Volgens het experimentele ontwerp en de biologische vraag(en) die aan bod komen, kunnen meerdere bioinformatische analyses worden toegepast. Als bewijs van principe tonen we hier representatieve resultaten van één mogelijke toepassing (d.w.z. differentiële methylatieanalyse), die zich richt op de identificatie van differentieel gemethyleerde transcripten geïnduceerd bij HIV-infectie. In het kort onderzochten we het m6A- of m5C-methylatieniveau van transcripten, onafhankelijk van hun genexpressieniveau, in zowel niet-geïnfecteerde als HIV-geïnfecteerde cellen, om de rol van RNA-methylaties tijdens de virale levenscyclus verder te begrijpen. Bij normalisatie van de genexpressie identificeerden we dat het ZNF469-transcript differentieel m6A-gemethyleerd was volgens de infectiestatus, inderdaad was dit transcript niet gemethyleerd in niet-geïnfecteerde cellen terwijl het verschillende gemethyleerde pieken vertoonde bij HIV-infectie (figuur 5A). Een vergelijkbare differentiële methylatieanalyse op m5C onthulde dat het PHLPP1-transcript verschillende gemethyleerde residuen bevatte, die vaker worden gemethyleerd in de HIV-toestand (figuur 5B). In deze context suggereren beide analyses dat HIV-infectie het cellulaire epitranscriptoom beïnvloedt.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig04.jpg"> Figuur 4: Schematische weergave van de bioinformatische workflow voor de analyse van m6A- en m5C-gegevens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig05.jpg"> Figuur 5: Voorbeeld van differentieel gemethyleerde transcripten bij infectie. A) Representatief resultaat dat m6A-methylatie van ZNF459-transcript in HIV-geïnfecteerde (groene) en niet-geïnfecteerde (grijze) cellen laat zien. Piekintensiteit (bij aftrek van invoerexpressie) wordt weergegeven op de y-as en positie in het chromosoom langs de x-as. Differentiële methylatieanalyse onthult dat het ZFN469-transcript hypermethyleerd is bij HIV-infectie. B) Representatief resultaat van m5C gemethyleerd gen in HIV-geïnfecteerde (bovenste rijstrook) en niet-geïnfecteerde (onderste rijstrook) cellen. De hoogte van elke staaf vertegenwoordigt het aantal aflezingen per nucleotide en maakt een dekkingsbeoordeling mogelijk. Elk C-residu wordt weergegeven in rood en het aandeel gemethyleerde C wordt weergegeven in blauw. De exacte methylatiesnelheid (%) wordt boven elk C-residu gerapporteerd. Pijlen markeren statistisch significant differentieel gemethyleerd C. Monsters werden gevisualiseerd met behulp van IGV-viewer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

De rol van RNA-modificaties in virale infecties begint net te worden onderzocht en zou nieuwe interactiemechanismen tussen virussen en gastheren kunnen benadrukken. In dit werk bieden we een pijplijn om m6A- en m5C-RNA-modificaties te onderzoeken in de context van virale infecties.

Onderzoek naar m6A en m5C epitranscriptomen bij virale infectie: een voorbeeld met HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

Hallo, in deze video laten we je zien hoe je de m6A- en m5C-epitranscriptomen kunt verkennen bij virale infectie. Om het experiment te starten, heb je 50 miljoen cellen nodig voor de niet-geïnfecteerden en 50 miljoen voor de geïnfecteerde aandoening. Om bij analyse een dataset van hoge kwaliteit te verkrijgen, moet u een universele infectie bereiken.Hier infecteren we deze cellen met een hiv-gebaseerde vector en meten we de viraal gecodeerde GFP door FACS. In dit geval hadden we 80% van de geïnfecteerde cellen en gingen we verder met de workflow, beginnend met totale RNA-extractie. Dus verdeelden we de cellen in aliquots van elk 10 miljoen en lyseerden ze in 1 ml Trizol.Vervolgens voegden we 200 microliter chloroform toe aan het cellysaat en mengden we door inversie. Op dit punt laten we het lysaat drie minuten bij kamertemperatuur zitten en centrifugeren we vervolgens alle monsters op hoge snelheid gedurende 15 minuten bij vier graden. Je verwacht een fasescheiding in drie verschillende fasen, zoals hier wordt getoond.RNA zit in de bovenste fase, dus breng de waterige fase voorzichtig over in een nieuwe buis door erop te letten dat de organische laag niet wordt overgedragen. Voeg op dit punt 0,5 ml isopropanol toe aan de waterige fase en meng voorzichtig door inversie. Monsters kunnen vervolgens een uur bij 80 graden worden geïncubeerd om RNA-neerslag te garanderen.Bij centrifugeren op hoge snelheid zou je een mooie RNA-pellet moeten kunnen zien zoals hier te zien is. Gooi het supernatant voorzichtig weg door inversie of door pipetteren, let op het niet verstoren van de pellet. Was vervolgens de RNA-pellet met één ml 75% ethanol van moleculaire kwaliteit.En vortex het monster kort. Zorg er bij het centrifugeren voor dat je een mooie witte RNA-pellet terugkrijgt. Gooi het supernatant weg en laat de RNA-pellet 15 minuten drogen bij kamertemperatuur.Resuspend elke pellet in 20 microliter water en bundel alle monsters uit dezelfde toestand samen. Totaal RNA is nu klaar voor mRNA-isolatie door poly-A-selectie. Bereid voor elk monster van 75 microgram RNA 200 microliter oligo-DT magnetische kralen en was ze in één ml bindingsbuffer.Plaats de buis op een magnetische standaard en laat de kralen zich tijdens één mix aan de magneet binden. Gooi het supernatant weg en herhaal de procedure voor een tweede wasbeurt. Verwijder vervolgens de kralen uit de magnetische standaards en resuspend ze voorzichtig in 100 microliter bindingsbuffer.Bereid op dit punt het RNA-monster voor door ze te delen in 75 microgram RNA per aliquot geresuspendeerd in 100 microliter water. Voeg 100 microliter bindingsbuffer toe en incubeer gedurende twee minuten op 65 graden. Draai vervolgens de monsters naar beneden en incubeer op ijs.Voeg vervolgens 100 microliter gewassen magnetische kralen toe aan elk RNA-monster en laat de binding op een roterend wiel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur toe. Plaats de buis na incubatie terug in een magnetisch rek en laat ze een minuut incuberen. Herstel vervolgens het supernatant in een verse buis en houd het opzij voor een tweede isolatieronde.Was de kralen twee keer met 200 microliter wasbuffer en ga dan verder met elutie. Om poly-A geselecteerd RNA uit de magnetische kralen te elueren, voegt u 20 microliter ijskoude TRIS HCl toe aan elk monster en pipetteer u zorgvuldig. Incubeer vervolgens je monsters op 80 graden gedurende twee minuten om het RNA van de kralen vrij te maken.Breng het supernatant met poly-A geselecteerd RNA over naar een nieuwe buis, waarbij u voorzichtig bent met het vermijden van overdracht van kralen. De elutiestap en de isolatiestap moeten tweemaal worden herhaald om de mRNA-opbrengst te verhogen. mRNA is nu klaar om de meRIP-Seq-pijplijn binnen te gaan bij de fragmentatiestap of direct naar bisulfietconversie te gaan.De eerste stap om de meRIP-Seq-pijplijn binnen te gaan, bestaat uit mRNA-fragmentatie. Hiervoor heb je vijf microgram mRNA nodig, verdeeld in aliquots van 18 microliter in buisjes van 0,2 ml. Om consistente gegevens te garanderen, is het van cruciaal belang om snel en met slechts weinig monsters op dat moment te werken.Voor dit experiment is fragmentatie geoptimaliseerd om fragmenten van een grootte tussen 115 en 200 nucleotiden te verkrijgen. Voeg vervolgens twee microliter fragmentatiereagens toe aan elke buis met 18 microliter mRNA, waarbij u voorzichtig bent bij het afzetten van de druppel op de buiswand. Draai alle monsters naar beneden om tegelijkertijd contact tussen het reagens en het RNA mogelijk te maken en incubateer gedurende 15 minuten op 70 graden.Zodra de incubatie voorbij is, stopt u de reactie door twee microliter van 0,5 M EDTA toe te voegen. Op dit punt kunt u uw gefragmenteerde mRNA zuiveren met de methode van uw keuze en doorgaan met een RNA-kwaliteitscontrole door fragmentanalysator. Deze stap is optioneel, maar hiermee kunt u de grootte van het fragment beoordelen voordat RNA-neerslag wordt ingeschakeld.Zoals je hier in de vierde baan kunt zien, verkrijgen we voor beide ons monsterfragment van ongeveer 150 nucleotide elk. Daarna zijn we verder gegaan met meRIP-Seq. De eerste stap bestaat uit paar A / G magnetische kralen met anti-m6A-antilichamen of IgG-controles.Breng voor elk reactieplan 25 microliter magnetische kralen over in een nieuwe buis. Houd er rekening mee dat u ten minste één m6A-specifieke voorwaarde en één controlevoorwaarde nodig heeft. Was elke 25 microliter kralen met 250 microliter IP-buffer.Reuspend de kralen voorzichtig door op en neer te pipetteren en plaats de buis gedurende één minuut op het magnetische rek om de parelscheiding mogelijk te maken. Verwijder en gooi het supernatant weg, let op het niet aanzuigen van de magnetische kralen en herhaal de wasstap eenmaal. Resuspend de magnetische kralen vervolgens in 100 microliter IP-buffer per elke 25 microliter van het oorspronkelijke volume kralen.Bereid en label één buis per voorwaarde. In ons geval hebben we twee buizen voor de geïnfecteerde aandoening, een voor m6A en een voor IgG-controle en twee buizen voor de niet-geïnfecteerde aandoening. Voeg vervolgens 100 microliter gewassen kralen toe aan elke buis.Kralen zijn nu klaar om te worden gekoppeld aan specifieke antilichamen of IgG-controles. Voeg vijf microgram specifiek anti-m6A-antilichaam of anti-IgG-controleantilichaam toe aan elke buis met 100 microliter gewassen magnetische kralen. Laat antilichaam-kralenconjugatie toe door de buis 30 minuten op een roterend wiel te incuberen.Ga ondertussen verder met de monstervoorbereiding. Voor elke geplande toestand, m6A-specifieke of IgG-controle, is uw uitgangsmateriaal 2,5 microgram gefragmenteerd mRNA geresuspendeerd 100 microliter water. Om een eindreactievolume van 500 microliter te hebben, voegt u 295 microliter water toe aan elk monster.Voeg vervolgens vijf microliter RNAaseremmer geconcentreerd op 40 eenheid per microliter toe voor een totale hoeveelheid van 200 eenheden per monster en meng voorzichtig. Voeg ten slotte 100 microliter 5X geconcentreerde IP-buffer toe aan elke buis. Monsters zijn nu klaar voor de immuunprecipitatiereactie.Haal de magnetische kralen in combinatie met antilichamen uit het roterende wiel en draai ze naar beneden. Voeg vervolgens 500 microliter van de eerder bereide monsters toe aan elke 100 microliter kralen in combinatie met de specifieke antilichamen. Meng voorzichtig door meerdere keren op en neer te pipetteren om de kralen volledig opnieuw te verdelen.Incubeer ze of uw meRIP-reactie op een roterend wiel bij vier graden gedurende twee uur. Zodra de incubatie voorbij is, draai je elke buis naar beneden en plaats je ze gedurende één minuut op een magnetisch rek om de kraalscheiding mogelijk te maken. Verwijder vervolgens de ongebonden fractie en plaats deze op een verse buis en bewaar deze indien nodig voor verdere analyse.Verwijder de magneet uit het rek en voer alle monsters opnieuw op in 500 microliter IP-buffer. Resuspend elk monster zorgvuldig door op en neer te pipetteren. Plaats de magneet op het rek, incubeer gedurende één minuut en verwijder vervolgens voorzichtig het bovennatuurlijke middel.Herhaal de was twee keer en ga dan verder met de elutie. Bereid voor elk paar monsters, m6A-specifiek en controle, 225 microliter elutiebuffer met 20 millimolair gezuiverd m6A. Voeg vervolgens 100 microliter elutiebuffer per monster toe.Incubeer alle monsters een uur bij vier graden op een rocker. Verzamel vervolgens alle m6A verrijkte RNA-monsters in een verse buis en ga verder met een tweede ronde elutie. Zuiver het m6A verrijkte RNA met de methode van uw keuze En dan zijn op dit punt monsters klaar voor bibliotheekvoorbereiding en sequencing.Om de m5C-modificatie te onderzoeken, gebruiken we bisulfietconversie. Start het experiment met 500 nanogram poly-geïdenyleerd RNA. Hoewel optioneel, zal het toevoegen aan uw monster van 500 picogram van poly-A uitgeput RNA om ribosomale representatie en 0,5 microliter commercieel beschikbare synthetische sequentie te garanderen, u in staat stellen om de bisulfietconversiesnelheid bij sequencing te beoordelen.Pas uw monster aan tot een eindvolume van 20 microliter in water en voeg vervolgens 130 microliter RNA-conversiereagens toe aan elk monster. Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren en draai alle monsters naar beneden om ervoor te zorgen dat er geen druppels meer aan de zijkant van de buizen zitten. Incubeer alle monsters in een PCR-machine gedurende drie cycli van denaturatie 70 graden gedurende vijf minuten en bisulfietconversie bij 54 graden gedurende 45 minuten.Voer in-kolom deaminering uit door direct op een lege kolom 250 microliter RNA-bindingsbuffer, 150 microliter van uw bisulfiet geconverteerd monster toe te voegen. Meng het monster door op en neer te pipetteren, maar let op dat u de kolomfilters niet aanraakt. Voeg 400 microliter 95-100% ethanol toe aan het monster RNA-bindingsbuffermengsel direct in de kolom.Sluit de dop en meng onmiddellijk door inversie. Draai uw monster gedurende 30 seconden en gooi de doorstroming weg. Was uw kolom met wasbuffer en voeg vervolgens 200 microliter ontzwavelingsoplossing toe aan het midden van elke kolom.Incubeer al uw monster gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Draai het monster gedurende 30 seconden en ga dan verder met twee wasrondes. Voeg 400 microliter wasbuffer toe aan elk monster, centrifugeer gedurende 30 seconden op volle snelheid en gooi de doorstroming weg.Plaats de kolom in een nieuwe lege buis en eluteer het bisulfiet omgezete RNA in 20 microliter water. Controleer de efficiëntie van bisulfietconversie met RT-qPCR en ga vervolgens verder met bibliotheekvoorbereiding en sequencing. Na bio-informatica-analyse, hier is een voorbeeld van resultaten die u kunt verkrijgen met deze workflow.Hier vergelijken we het epitranscriptoom van HIV-geïnfecteerde cellen versus niet-geïnfecteerde cellen. 24 uur na infectie. In het A-paneel kunt u de resultaten zien die we verkrijgen bij het verkennen van het m6A-epitranscriptoom.In deze grafiek plotten we de m6A verrijkte reads op meRIP-Seq analyse. We kunnen mooi zien dat een zinken vinger 24 uur na infectie gehypermethyleerd is. We voerden hetzelfde type analyse uit voor het m5C-epitranscriptoomonderzoek in panel B.In deze grafiek wordt elke niet-gemethyleerde cytosine in rood weergegeven, terwijl het aandeel cytosine dat m5C-gemethyleerd is, in blauw wordt weergegeven.Zoals je kunt zien, PHLPP1, alle drie cytosines die 24 uur na hiv-infectie hyper-gemethyleerd zijn. Over het algemeen maakt deze workflow het mogelijk om zowel het M6A- als m5C-epitranscriptoom van geïnfecteerde cellen te onderzoeken en kan het ook als zodanig op virale deeltjes worden toegepast. Inzicht in virale infecties die in staat zijn om het epitranscriptomische landschap van de gastheer te wijzigen, geeft ons toegang tot een nieuwe laag van regulatie.Het onderzoek van differentiële gemethyleerde transcripten bij virale infectie zal natuurlijk een waardevolle bron zijn voor nieuwe therapeutische interventies. Op de onderstaande link vindt u onze open access bron voor het onderzoek van differentieel gemethyleerd transcript op HIV-infectie in de loop van de tijd.

Research

JoVE Journal

Biology

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

Interview: HIV-1 proviraal DNA Excisie Met behulp van een Evolved recombinase

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Protocollen voor orale infectie van lepidoptera Larven met Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

Het verkennen van cognitieve functies bij baby&#39;s, Kinderen &amp; Volwassenen met Near Infrared Spectroscopy

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Karakteriseren Herbivore resistentiemechanismen: Spittlebugs op Brachiaria Spp. als een voorbeeld

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Het meten van de osmotische Waterdoorlaatbaarheid (P<sub&gt; F</sub&gt;) Van Sferische Cellen: Isolated plantenprotoplasten als voorbeeld

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

De Infiltratie-centrifugeren Techniek voor de extractie van apoplastische Fluid uit bladeren van de planten met behulp van<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Als een voorbeeld

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfecteren RAW264.7 cellen met een luciferasereportergen

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Beoordeling van de beschikbaarheid van mineralen in visvoeders met behulp van aanvullende methoden die zijn aangetoond met het voorbeeld van zink in Atlantische zalm

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Single cell micro-aspiratie als alternatieve strategie voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering voor scheiding van gigantische virus mengsels

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Isolatie, proliferatie en differentiatie van rhesus makaken vet-afgeleide stamcellen

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...