Name: exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv
Uploaded: 2022-03-05T13:00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds unterstützt (Grants 31003A_166412 und 314730_188877).

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Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die Rolle von RNA-Modifikationen bei der Virusinfektion ist noch weitgehend unbekannt. Ein besseres Verständnis der Rolle epitranskriptomischer Modifikationen im Zusammenhang mit Virusinfektionen könnte zur Suche nach neuen antiviralen Behandlungszielen beitragen.
In dieser Arbeit stellen wir einen kompletten Workflow zur Verfügung, der die Untersuchung der m6A- und m5C-Epitranskriptome infizierter Zellen ermöglicht. Je nach biologischer Fragestellung empfehlen wir, Poly-A-selektierte RNA als Ausgangsmaterial zu verwenden. Obwohl optional, da die Pipeline mit Gesamt-RNA verwendet werden könnte, ist es wichtig zu bedenken, dass sowohl rRNAs als auch kleine RNAs stark modifiziert sind und eine wichtige Anzahl methylierter Rückstände enthalten. Dies könnte zu einer verminderten Qualität und Quantität aussagekräftiger Sequenzierungsdaten führen.
Wenn der Schwerpunkt der Studie jedoch auf nicht-poly-adenylierter RNA liegt, sollte der RNA-Extraktionsschritt angepasst werden, um zu vermeiden, dass kleine RNA verworfen wird (im Falle einer säulenbasierten RNA-Extraktion) und Ribosomen-Depletionstechniken anstelle der Poly-A-Selektion bevorzugt werden, um in die Pipeline zu gelangen.
Um eine hohe Qualität der RNA, eine korrekte Fragmentierung und eine geeignete m6A-angereicherte und BS-konvertierte RNA-Qualität für die Bibliotheksvorbereitung zu gewährleisten, empfehlen wir dringend, einen Fragmentanalysator oder einen Bioanalytiker zu verwenden. Diese Ausrüstung ist jedoch nicht immer verfügbar. Alternativ könnten die Qualität von RNA, mRNA und die Größe der fragmentierten RNA auch durch Visualisierung auf Agarosegel beurteilt werden. Alternativ kann die Bibliotheksvorbereitung ohne vorherige Beurteilung der RNA-Menge durchgeführt werden.
Wir verwendeten die Antikörper-basierte MeRIP-Seq16-Technik, um die epitranskriptomische m6A-Landschaft zu erforschen. Diese Technik basiert auf RNA-Immunpräzipitation und ist erfolgreich; Einige Schritte müssen jedoch sorgfältig optimiert werden und können kritisch sein. Obwohl beschrieben wurde, dass die m6A-Methylierung hauptsächlich innerhalb der Konsensussequenz RRA*CH auftritt, ist dieses Motiv entlang von mRNA-Molekülen sehr häufig und erlaubt keine genaue Identifizierung der methylierten Stelle. Es ist daher entscheidend, eine reproduzierbare und konsistente RNA-Fragmentierung zu erreichen, die kleine RNA-Fragmente erzeugt, um die RIP-basierte Auflösung zu verbessern. In diesem Protokoll empfehlen wir ein optimiertes Verfahren, das reproduzierbare und konsistente Ergebnisse in unserem experimentellen Umfeld liefert; Dieser Fragmentierungsschritt muss jedoch möglicherweise entsprechend bestimmten Beispielfunktionen weiter optimiert werden.
Kürzlich wurde eine neue Technik beschrieben, die eine direkte m6A-Sequenzierung ermöglicht. Es basiert auf der Verwendung spezifischer Reverse-Transkriptase-Varianten, die einzigartige RT-Signaturen als Reaktion auf die Begegnung mit der m6A-RNA-Modifikation aufweisen24. Diese Technologie könnte bei sorgfältiger Optimierung die Haupteinschränkung von MeRIP-Seq umgehen (Verringerung der Menge an Ausgangsmaterial und Ermöglichung einer höheren Auflösung). Um die m5C-Modifikation zu untersuchen, haben wir uns für die Bisulfit-Umwandlungstechnik entschieden, um die modifizierten C-Reste mit Nukleotidauflösung nachzuweisen. Um die Falsch-Positiv-Rate aufgrund des Vorhandenseins von RNA-Sekundärstrukturen zu reduzieren, haben wir 3 Zyklen der Denaturierung / Bisulfit-Umwandlung durchgeführt und die Bisulfit-Umwandlungsrate dank der Verwendung von ERCC-Spike-in-Kontrollen weiter kontrolliert. Eine der Einschränkungen, die mit dieser Technik verbunden sind, besteht darin, dass die Bisulfitkonversion sehr hart ist und drei Zyklen der Denaturierung / Bisulfit-Umwandlung etwas RNA abbauen und somit die Auflösung verringern könnten. In unserer Umgebung haben wir uns jedoch für eine möglicherweise etwas niedrigere Auflösung entschieden, um die Qualität des Datensatzes zu erhöhen.
Dank dieser Optimierungen und Kontrollen konnten wir einen zuverlässigen und soliden Workflow bereitstellen, der genutzt werden kann, um die epitranskriptomische Landschaft und ihre Veränderung im Zusammenhang mit Virusinfektionen, Wirt-Pathogen-Interaktionen oder einer Exposition gegenüber bestimmten Behandlungen zu untersuchen.

Es ist seit langem bekannt, dass RNA-Moleküle modifiziert werden können, und bis heute wurden mehr als 150 posttranskriptionelle Modifikationen beschrieben1. Sie bestehen in der Addition von chemischen Gruppen, hauptsächlich Methylgruppen, zu praktisch jeder Position der Pyrimidin- und Purinringe von RNA-Molekülen2. Solche posttranskriptionellen Modifikationen haben sich bereits als hochangereichert in Transfer-RNA (tRNA) und ribosomaler RNA (rRNA) erwiesen und wurden kürzlich auch an mRNA-Molekülen beschrieben.
Der Aufstieg neuer Technologien wie Next Generation Sequencing (NGS) und die Produktion spezifischer Antikörper, die bestimmte chemische Modifikationen erkennen, ermöglichten erstmals die Untersuchung des Ortes und der Häufigkeit spezifischer chemischer Modifikationen auf transkriptomweiter Ebene. Diese Fortschritte haben zu einem besseren Verständnis von RNA-Modifikationen und zur Kartierung mehrerer Modifikationen an mRNA-Molekülen geführt3,4.
Während die Epigenetik die Rolle von DNA- und Histonmodifikationen bei der Transkriptomregulation untersucht, konzentriert sich die Epitranskriptomik in ähnlicher Weise auf RNA-Modifikationen und ihre Rolle. Die Untersuchung epitranskriptomischer Modifikationen bietet neue Möglichkeiten, neuartige Regulationsmechanismen hervorzuheben, die eine Vielzahl zellulärer Prozesse (d.h. RNA-Spleißen, Export, Stabilität und Translation) abstimmen können5. Es war daher keine große Überraschung, dass neuere Studien viele epitranskriptomische Modifikationen bei einer Virusinfektion sowohl in zellulären als auch in viralen RNAs aufdeckten6. Zu den bisher untersuchten Viren gehören sowohl DNA- als auch RNA-Viren; unter ihnen kann HIV als wegweisendes Beispiel angesehen werden. Insgesamt könnte die Entdeckung der RNA-Methylierung im Zusammenhang mit Virusinfektionen die Untersuchung noch unbeschriebener Mechanismen der viralen Expression oder Replikation ermöglichen und so neue Werkzeuge und Ziele zu deren Kontrolle liefern7.
Auf dem Gebiet der HIV-Epitranskriptomik wurden Modifikationen viraler Transkripte umfassend untersucht und haben gezeigt, dass das Vorhandensein dieser Modifikation für die Virusreplikation von Vorteil war8,9,10,11,12,13. Bis heute können verschiedene Techniken verwendet werden, um epitranskriptomische Markierungen auf transkriptomweiter Ebene zu erkennen. Die am häufigsten verwendeten Techniken zur m6A-Identifizierung basieren auf Immunfällungstechniken wie MeRIP-Seq und miCLIP. Während MeRIP-Seq auf RNA-Fragmentierung setzt, um Fragmente zu erfassen, die methylierte Reste enthalten, basiert miCLIP auf der Erzeugung von α-m6A-Antikörper-spezifischen Signaturmutationen bei RNA-Antikörper-UV-Vernetzung, was eine genauere Kartierung ermöglicht.
Der Nachweis der m5C-Modifikation kann entweder durch Antikörper-basierte Technologien ähnlich dem m6A-Nachweis (m5C RIP) oder durch Bisulfit-Umwandlung oder durch AZA-IP oder miCLIP erreicht werden. Sowohl Aza-IP als auch m5C miCLIP verwenden eine spezifische Methyltransferase als Köder, um RNA anzugreifen, während sie die RNA-Methylierung durchlaufen. In Aza-IP werden Zielzellen mit 5-Azacytidin exponiert, was zur zufälligen Einführung von Cytidin-analogen 5-Azacytidin-Stellen in die entstehende RNA führt. In miCLIP ist die NSun2-Methyltransferase genetisch so verändert, dass sie die C271A-Mutation enthält14,15.
In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf die doppelte Charakterisierung von m6A- und m5C-Modifikationen in infizierten Zellen am Beispiel von HIV. Nach methodischer Optimierung haben wir einen Workflow entwickelt, der methylierte RNA-Immunpräzipitation (MeRIP) und RNA-Bisulfit-Umwandlung (BS) kombiniert und so die gleichzeitige Erforschung von m6A- und m5C-epitranskriptomischen Markierungen auf transkriptomweiter Ebene sowohl in zellulären als auch in viralen Kontexten ermöglicht. Dieser Workflow kann sowohl auf zellulären RNA-Extrakten als auch auf RNA, die aus viralen Partikeln isoliert wurde, implementiert werden.
Der Methylated RNA ImmunoPrecipitation (MeRIP)16-Ansatz, der die Untersuchung von m6A auf transkriptomweiter Ebene ermöglicht, ist gut etabliert und eine Reihe von m6A-spezifischen Antikörpern ist bis heute kommerziell erhältlich17. Diese Methode besteht in der selektiven Erfassung von m6A-haltigen RNA-Stücken mit einem m6A-spezifischen Antikörper. Die beiden Hauptnachteile dieser Technik sind (i) die begrenzte Auflösung, die stark von der Größe der RNA-Fragmente abhängt und somit einen ungefähren Ort und eine Region liefert, die den methylierten Rückstand enthält, und (ii) die große Menge an Material, die zur Durchführung der Analyse benötigt wird. Im folgenden optimierten Protokoll haben wir die Fragmentgröße auf etwa 150 nt standardisiert und die Menge an Ausgangsmaterial von 10 μg Poly-A-selektierter RNA, was derzeit die empfohlene Menge an Ausgangsmaterial ist, auf nur 1 μg Poly-A-selektierte RNA reduziert. Wir maximierten auch die Rückgewinnungseffizienz von m6A-RNA-Fragmenten, die an spezifische Antikörper gebunden sind, indem wir eine Elution durch einen Wettbewerbsansatz mit einem m6A-Peptid anstelle von konventionelleren und weniger spezifischen Elutionsmethoden mit phenolbasierten Techniken oder Proteinase K verwendeten. Die Haupteinschränkung dieses RIP-basierten Assays bleibt jedoch die suboptimale Auflösung, die die Identifizierung des präzisen modifizierten A-Nukleotids nicht zulässt.
Die Analyse der m5C-Markierung kann derzeit mit zwei verschiedenen Ansätzen durchgeführt werden: einer RIP-basierten Methode mit m5C-spezifischen Antikörpern und einer RNA-Bisulfit-Umwandlung. Da RIP nur eine begrenzte Auflösung für die Identifizierung des methylierten Rückstands bietet, haben wir die Bisulfitkonversion verwendet, die eine Einzelnukleotidauflösung bieten kann. Die RNA-Exposition gegenüber Bisulfit (BS) führt zu einer Cytosin-Desaminierung, wodurch der Cytosinrest in Uracil umgewandelt wird. So wird während der RNA-Bisulfit-Umwandlungsreaktion jedes nicht methylierte Cytosin deaminiert und in Uracil umgewandelt, während das Vorhandensein einer Methylgruppe in Position 5 des Cytosins eine schützende Wirkung hat, die BS-induzierte Desaminierung verhindert und den Cytosinrückstand konserviert. Der BS-basierte Ansatz ermöglicht den Nachweis eines m5C-modifizierten Nukleotids mit einzelner Basenauflösung und die Bewertung der Methylierungsfrequenz jedes Transkripts, wodurch Einblicke in die m5C-Modifikationsdynamik18 gegeben werden. Die Haupteinschränkung dieser Technik beruht jedoch auf der Falsch-Positiv-Rate methylierter Rückstände. Tatsächlich ist die BS-Umwandlung auf einzelsträngige RNA mit zugänglichen C-Resten wirksam. Das Vorhandensein einer engen RNA-Sekundärstruktur könnte jedoch die N5C-Position maskieren und die BS-Umwandlung behindern, was zu nicht methylierten C-Resten führt, die nicht in U-Reste umgewandelt werden, und somit zu falsch positiven Ergebnissen. Um dieses Problem zu umgehen und die Falsch-Positiv-Rate zu minimieren, haben wir 3 Runden Denaturierungs- und Bisulfit-Umwandlungszyklen angewendet19. Wir haben auch 2 Kontrollen in die Proben eingeführt, um die Abschätzung der Bisulfit-Umwandlungseffizienz zu ermöglichen: Wir spike-in ERCC-Sequenzierungskontrollen (nicht methylierte standardisierte und kommerziell erhältliche Sequenzen)20 sowie Poly-A-depletierte RNAs, um einerseits die Bisulfit-Umwandlungsrate zu bewerten und durch RT-PCR das Vorhandensein einer bekannten und gut konservierten methylierten Stelle, C4447, zu überprüfen. auf 28S ribosomaler RNA hingegen21.
Im Bereich der Virologie ermöglicht die Kopplung dieser beiden epitranskriptomischen Untersuchungsmethoden mit next generation sequencing und genauer bioinformatischer Analyse eine eingehende Untersuchung der m6A- und m5C-Dynamik (d.h. zeitliche Veränderungen der RNA-Modifikation, die bei einer Virusinfektion auftreten könnten und eine Reihe neuer therapeutisch relevanter Ziele für den klinischen Einsatz aufdecken könnten).

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	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrime Pfx SuperMix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12344-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ RNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>EZR5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-472-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-471-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina TruSeq Stranded mRNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Beads A/G Blend</td>
			<td>Merck</td>
			<td>16-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-Methyladenosine, 5&#8242;-monophosphate sodium salt (m6A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2780-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse IgG</td>
			<td>Merk</td>
			<td>12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo(dT)25</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61005,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRapace</td>
			<td>Stratec</td>
			<td>1020220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick RNA Viral Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Fragmentation Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv

Die Rolle von RNA-Modifikationen in biologischen Prozessen stand in den letzten Jahren immer mehr Studien im Fokus und wird heute als Epitranskriptomik bezeichnet. Unter anderem wurden N6-Methyladenosin (m6A) und 5-Methylcytosin (m5C) RNA-Modifikationen an mRNA-Molekülen beschrieben und können eine Rolle bei der Modulation zellulärer Prozesse spielen. Epitranscriptomics ist somit eine neue Regulierungsebene, die zusätzlich zu transkriptomischen Analysen berücksichtigt werden muss, da sie auch durch die Exposition gegenüber chemischen oder biologischen Agenzien, einschließlich Virusinfektionen, verändert oder moduliert werden kann.
Hier stellen wir einen Workflow vor, der die Analyse der gemeinsamen zellulären und viralen epitranskriptomischen Landschaft der m6A- und m5C-Markierungen gleichzeitig in Zellen ermöglicht, die mit dem humanen Immunschwächevirus (HIV) infiziert sind oder nicht. Nach der Isolierung und Fragmentierung von mRNA aus HIV-infizierten und nicht infizierten Zellen verwendeten wir zwei verschiedene Verfahren: MeRIP-Seq, eine auf RNA-Immunpräzipitation basierende Technik, um RNA-Fragmente mit der m6A-Markierung anzureichern, und BS-Seq, eine auf Bisulfit-Umwandlung basierende Technik, um die m5C-Markierung mit einer einzigen Nukleotidauflösung zu identifizieren. Nach der methylierungsspezifischen Erfassung werden RNA-Bibliotheken für die Hochdurchsatzsequenzierung vorbereitet. Wir haben auch eine dedizierte Bioinformatik-Pipeline entwickelt, um differentiell methylierte (DM) Transkripte unabhängig von ihrem basalen Expressionsprofil zu identifizieren.
Insgesamt ermöglicht die Methodik die gleichzeitige Untersuchung mehrerer epitranskriptomischer Markierungen und liefert einen Atlas von DM-Transkripten bei Virusinfektion oder anderen Zellstörungen. Dieser Ansatz bietet neue Möglichkeiten, neue Akteure und neuartige Mechanismen der Zellantwort zu identifizieren, wie z.B. zelluläre Faktoren, die die virale Replikation fördern oder einschränken.

Dieser Workflow hat sich als nützlich erwiesen, um die Rolle der m6A- und m5C-Methylierung im Zusammenhang mit einer HIV-Infektion zu untersuchen. Dazu haben wir ein CD4+ T-Zelllinienmodell (SupT1) verwendet, das wir entweder mit HIV infizieren oder unbehandelt lassen. Wir begannen den Workflow mit 50 Millionen Zellen pro Zustand und erhielten durchschnittlich 500 μg Gesamt-RNA mit einer RNA-Qualitätszahl von 10 (Abbildung 1A-B). Bei der Poly-A-Selektion haben wir zwischen 10 und 12 μg mRNA pro Zustand (was etwa 2% der gesamten RNA entspricht) gewonnen (Abbildung 1B). Zu diesem Zeitpunkt verwendeten wir 5 μg Poly-A-selektierte RNA für die MeRIP-Seq-Pipeline und 1 μg für die BS-Seq-Pipeline. Da HIV-RNA poly-adenyliert ist, ist keine weitere Aktion erforderlich und MeRIP-Seq- und BS-Seq-Verfahren können direkt angewendet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig01.jpg"> Abbildung 1: RNA-Vorbereitung für nachgeschaltete Anwendungen. A) Workflow zur Darstellung der RNA-Vorbereitung und -Verteilung für gleichzeitige MeRIP-Seq- und BS-Seq-Pipelines. Jede gefüllte sechseckige Form stellt einen RNA-Modifikationstyp dar, z. B. m6A (grün) oder m5C (rosa). Mengen an RNA-Material, die für die Durchführung des Experiments benötigt werden, sind angegeben. B) Repräsentative Ergebnisse, die die erwarteten RNA-Verteilungsprofile (Größe und Menge) bei der Gesamt-RNA-Extraktion (oberes Bild) und der Poly-A-Selektion (unteres Panel) darstellen. Die Proben wurden mit einem Standard-Sensitivitätskit auf den Fragmentanalysator geladen, um die RNA-Qualität zu beurteilen, bevor spezifische MeRIP-Seq- und BS-Seq-Verfahren eingegeben wurden. RQN: RNA-Qualitätszahl; nt: Nukleotide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die MeRIP-Seq-Pipeline ist eine auf RNA-Immunpräzipitation basierende Technik, die die Untersuchung der m6A-Modifikation entlang von RNA-Molekülen ermöglicht. Dazu wird RNA zunächst fragmentiert und dann mit m6A-spezifischen Antikörpern inkubiert, die zur Immunpräzipitation und -erfassung an magnetische Kügelchen gekoppelt sind. MeRIP-angereicherte RNA-Fragmente und die unberührte (Input-)Fraktion werden dann sequenziert und verglichen, um m6A-modifizierte RNA-Regionen und damit m6A-methylierte Transkripte zu identifizieren (Abbildung 2A). Die Auflösung der Technik beruht auf der Effizienz der RNA-Fragmentierung. Tatsächlich ermöglichen kürzere Fragmente eine genauere Lokalisierung des m6A-Rückstands. Hier wurden zelluläre Poly-A-selektierte RNAs und virale RNAs während 15 min in einem 20 μL-Endvolumen einer ionenbasierten Fragmentierung mit RNA-Fragmentierungspuffer unterzogen, um RNA-Fragmente von 100-150 nt zu erhalten. Ausgehend von 5 μg mRNA gewannen wir 4,5 μg fragmentierte RNA zurück, was einer Rückgewinnungsrate von 90% entspricht (Abbildung 2B). Wir verwendeten 100 ng fragmentierte, gereinigte RNA als Inputkontrolle, die direkt der Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung unterzogen wurde. Die verbleibende RNA (~4,4 μg) wurde gemäß der MeRIP-Seq-Pipeline verarbeitet, die mit der Inkubation von fragmentierter RNA mit Kügelchen beginnt, die entweder an Anti-m6A-spezifische Antikörper oder an Anti-IgG-Antikörper als Kontrolle gebunden sind. m6A-spezifische RIP (MeRIP) von 2,5 μg fragmentierter RNA ermöglichte die Rückholung von etwa 15 ng m6A-angereichertem Material, das einer Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung unterzogen wurde (Abbildung 2B). RIP mit Anti-IgG-Kontrolle lieferte erwartungsgemäß nicht genügend RNA, um eine weitere Analyse zu ermöglichen (Abbildung 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig02.jpg"> Abbildung 2: MeRIP-Seq-Pipeline. A) Schematische Darstellung des MeRIP-Seq-Workflows und der Eingabesteuerung. Bei der Poly-A-Selektion wurden die Proben in 120-150 nt Stücke fragmentiert und entweder direkt einer Sequenzierung (100 ng, Inputkontrolle) unterzogen oder für die RNA-Immunpräzipitation (2,5 μg, RIP) mit Anti-m6A-spezifischen Antikörpern oder Anti-IgG-Antikörpern als Negativkontrolle vor der Sequenzierung verwendet. B) Repräsentative Ergebnisse, die die erwarteten RNA-Verteilungsprofile (Größe und Menge) bei Fragmentierung (oberes Bild) und RIP (untere Panels, MeRIP: links, IgG-Kontrolle: rechts) zeigen. Die Proben wurden auf den Fragmentanalysator geladen, um die RNA-Qualität und -Konzentration vor der weiteren Verarbeitung zur Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung zu bewerten. Die fragmentierte RNA-Analyse wurde mit dem RNA-Standard-Sensitivitätskit durchgeführt, während immunpräzipitierte RNA das Hochempfindlichkeitskit verwendete. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die BS-Seq-Pipeline ermöglicht die Erforschung der m5C-RNA-Modifikation bei Nukleotidauflösung und führt zur Identifizierung von m5C-methylierten Transkripten. Bei der Umwandlung von Bisulfit werden nicht methylierte Cytosine in Uracil umgewandelt, während methylierte Cytosine unverändert bleiben (Abbildung 3A). Aufgrund der rauen Bedingungen des Bisulfit-Umwandlungsverfahrens (d. h. hohe Temperatur und niedriger pH-Wert) sind konvertierte mRNAs stark degradiert (Abbildung 3B), was jedoch die Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung nicht beeinträchtigt. Die Bisulfit-Umwandlung ist nur auf einzelsträngiger RNA effizient und kann daher potenziell durch sekundäre doppelsträngige RNA-Strukturen behindert werden. Um die Effizienz der C-U-Konvertierung zu bewerten, haben wir zwei Steuerelemente eingeführt. Als Positivkontrolle nutzten wir das zuvor beschriebene Vorhandensein eines hochmethylierten Cytosins in Position C4447 der 28S rRNA23. Bei der RT-PCR-Amplifikation und Sequenzierung eines 200 bp-Fragments, das die methylierte Stelle umgibt, konnten wir beobachten, dass alle Cytosine erfolgreich in Uracile umgewandelt wurden und dadurch als Thymidine in der DNA-Sequenz auftraten, mit Ausnahme des Cytosins in Position 4447, das unverändert blieb. Als Kontrolle für die Bisulfit-Umwandlungsrate verwendeten wir kommerziell erhältliche synthetische ERCC-RNA-Sequenzen. Diese Mischung besteht aus einem Pool bekannter, nicht methylierter und poly-adenylierter RNA-Sequenzen mit einer Vielzahl von Sekundärstrukturen und -längen. Bei der Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung konzentrierten wir uns auf diese ERCC-Sequenzen, um die Umwandlungsrate zu berechnen, die durchgeführt werden kann, indem die Anzahl der konvertierten C-Rückstände unter den gesamten C-Resten in allen ERCC-Sequenzen und in jeder Probe gezählt wird. Wir erhielten eine Umwandlungsrate von 99,5%, was die Effizienz und den Erfolg der Bisulfit-Umwandlungsreaktion bestätigt (Abbildung 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig03.jpg"> Abbildung 3: BS-Seq-Pipeline. A) Schematische Darstellung des BS-Seq-Workflows. Bei der Poly-A-Selektion werden die Proben Bisulfit ausgesetzt, was zu einer C-zu-U-Umwandlung (aufgrund von Deaminierung) für nicht methylierte C-Reste führt. Im Gegensatz dazu werden methylierte C-Reste (m5C) durch die Bisulfitbehandlung nicht beeinflusst und bleiben unverändert. B) Repräsentatives Ergebnis des in Bisulfit konvertierten RNA-Verteilungsprofils (Größe und Menge) bei der Analyse auf einem Fragmentanalysator mit einem Standard-Sensitivitätskit. C) Elektropherogramm mit repräsentativem Sequenzierungsergebnis des RT-PCR-Amplikons der Region um das 100% methylierte C an Position 4447 in 28S rRNA (blau hervorgehoben). Im Gegensatz dazu wurden C-Reste der Referenzsequenz aufgrund von Bisulfit-Umwandlungserfolgen als T-Reste in der Amplikonsequenz identifiziert. D) Bewertung der C-U-Umwandlungsrate durch Analyse von ERCC-Spike-in-Sequenzen in HIV-infizierten und nicht infizierten Zellen. Die durchschnittliche Conversion Rate liegt bei 99,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
M6A-angereicherte Proben, Bisulfit-konvertierte Proben und Eingangskontrollen werden für die Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung und bioinformatische Analyse weiterverarbeitet (Abbildung 4). Je nach experimentellem Design und der behandelten biologischen Frage(n) können mehrere bioinformatische Analysen angewendet werden. Als Prinzipnachweis zeigen wir hier repräsentative Ergebnisse aus einer möglichen Anwendung (d.h. der differentiellen Methylierungsanalyse), die sich auf die Identifizierung von differentiell methylierten Transkripten konzentriert, die bei einer HIV-Infektion induziert werden. Kurz gesagt, wir untersuchten den m6A- oder m5C-Methylierungsgrad von Transkripten, unabhängig von ihrem Genexpressionsniveau, sowohl in nicht infizierten als auch in HIV-infizierten Zellen, um die Rolle von RNA-Methylierungen während des viralen Lebenszyklus besser zu verstehen. Bei der Normalisierung der Genexpression stellten wir fest, dass das ZNF469-Transkript je nach Infektionsstatus unterschiedlich m6A-methyliert war, tatsächlich war dieses Transkript in nicht infizierten Zellen nicht methyliert, während es bei einer HIV-Infektion mehrere methylierte Peaks aufwies (Abbildung 5A). Eine ähnliche differentielle Methylierungsanalyse an m5C ergab, dass das PHLPP1-Transkript mehrere methylierte Rückstände enthielt, die im HIV-Zustand tendenziell häufiger methyliert werden (Abbildung 5B). In diesem Zusammenhang deuten beide Analysen darauf hin, dass eine HIV-Infektion das zelluläre Epitranskriptom beeinflusst.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig04.jpg"> Abbildung 4: Schematische Darstellung des bioinformatischen Workflows für die Analyse von m6A- und m5C-Daten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig05.jpg"> Abbildung 5: Beispiel für differentiell methylierte Transkripte bei der Infektion. A) Repräsentatives Ergebnis, das die m6A-Methylierung des ZNF459-Transkripts in HIV-infizierten (grün) und nicht infizierten (grauen) Zellen zeigt. Die Spitzenintensität (bei Subtraktion der Eingabeexpression) wird auf der y-Achse und der Position im Chromosom entlang der x-Achse angezeigt. Die analyse der differentiellen Methylierung zeigt, dass das ZFN469-Transkript bei einer HIV-Infektion hypermethyliert ist. B) Repräsentatives Ergebnis des m5C-methylierten Gens in HIV-infizierten (obere Spur) und nicht infizierten (untere Spur) Zellen. Die Höhe jedes Balkens stellt die Anzahl der Lesevorgänge pro Nukleotid dar und ermöglicht die Bewertung der Abdeckung. Jeder C-Rest ist rot dargestellt, und der Anteil an methyliertem C ist blau dargestellt. Die genaue Methylierungsrate (%) wird über jedem C-Rückstand angegeben. Pfeile heben statistisch signifikante differentiell methylierte C hervor. Proben wurden mit dem IGV-Viewer visualisiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Die Rolle von RNA-Modifikationen bei Virusinfektionen beginnt gerade erst erforscht zu werden und könnte neue Viral-Wirt-Interaktionsmechanismen aufzeigen. In dieser Arbeit stellen wir eine Pipeline zur Verfügung, um m6A- und m5C-RNA-Modifikationen im Zusammenhang mit Virusinfektionen zu untersuchen.

Erforschung von m6A- und m5C-Epitranskriptomen bei Virusinfektion: ein Beispiel mit HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

Hallo, in diesem Video zeigen wir Ihnen, wie Sie die m6A- und m5C-Epitranskriptome bei einer Virusinfektion erforschen können. Um das Experiment zu starten, benötigen Sie 50 Millionen Zellen für die nicht infizierten und 50 Millionen für die infizierte Erkrankung. Um bei der Analyse einen qualitativ hochwertigen Datensatz zu erhalten, müssen Sie eine universelle Infektion erreichen.Hier infizieren wir diese Zellen mit einem HIV-basierten Vektor und messen das viral kodierte GFP durch FACS. In diesem Fall hatten wir 80% der infizierten Zellen und fuhren mit dem Workflow fort, beginnend mit der gesamten RNA-Extraktion. Also teilten wir die Zellen in Aliquots von jeweils 10 Millionen auf und lysierten sie in 1 ml Trizol.Wir haben dann 200 Mikroliter Chloroform in das Zelllysat gegeben und durch Inversion gemischt. An dieser Stelle lassen wir das Lysat drei Minuten bei Raumtemperatur ruhen und zentrifugieren dann alle Proben mit hoher Geschwindigkeit für 15 Minuten bei vier Grad. Sie erwarten eine Phasentrennung in drei verschiedenen Phasen, wie hier gezeigt.RNA sitzt in der oberen Phase, also übertragen Sie die wässrige Phase vorsichtig in eine frische Röhre, indem Sie darauf achten, die organische Schicht nicht zu übertragen. An dieser Stelle 0,5 ml Isopropanol in die wässrige Phase geben und vorsichtig durch Inversion mischen. Die Proben können dann eine Stunde bei 80 Grad inkubiert werden, um die RNA-Ausfällung sicherzustellen.Bei der Zentrifugation mit hoher Geschwindigkeit sollten Sie in der Lage sein, ein schönes RNA-Pellet zu sehen, wie hier gezeigt. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig entweder durch Inversion oder durch Pipettieren und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Dann waschen Sie das RNA-Pellet mit einem ml Ethanol von 75% molekularer Qualität.Und wirbeln Sie die Probe kurz. Stellen Sie bei der Zentrifugation sicher, dass Sie ein schönes weißes RNA-Pellet abrufen. Entsorgen Sie den Überstand und lassen Sie das RNA-Pellet 15 Minuten bei Raumtemperatur trocknen.Resuspend jedes Pellet in 20 Mikroliter Wasser und poolen Sie alle Proben aus dem gleichen Zustand zusammen. Die Gesamt-RNA ist nun bereit für die mRNA-Isolierung durch Poly-A-Selektion. Für jede Probe von 75 Mikrogramm RNA werden 200 Mikroliter Oligo-DT-Magnetperlen hergestellt und in einem ml Bindungspuffer gewaschen.Stellen Sie das Rohr auf einen magnetischen Ständer und lassen Sie die Perlen während einer Mischung an den Magneten binden. Verwerfen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Vorgang für eine zweite Wäsche. Dann die Perlen von den Magnetständern entfernen und vorsichtig in 100 Mikroliter Bindungspuffer resuspendieren.Bereiten Sie zu diesem Zeitpunkt die RNA-Probe vor, indem Sie sie in 75 Mikrogramm RNA pro Aliquot aufteilen, resuspendiert in 100 Mikroliter Wasser. Fügen Sie 100 Mikroliter Bindungspuffer hinzu und inkubieren Sie für zwei Minuten bei 65 Grad. Dann drehen Sie die Proben herunter und inkubieren Sie auf Eis.Fügen Sie dann 100 Mikroliter gewaschene Magnetperlen zu jeder RNA-Probe hinzu und lassen Sie die Bindung auf einem rotierenden Rad für 15 Minuten bei Raumtemperatur zu. Legen Sie das Rohr nach der Inkubation wieder in ein Magnetgestell und lassen Sie es eine Minute lang inkubieren. Dann holen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen zurück und halten Sie ihn für eine zweite Runde der Isolierung beiseite.Waschen Sie die Perlen zweimal mit 200 Mikroliter Waschpuffer und fahren Sie dann mit der Elution fort. Um Poly-A-selektierte RNA aus den magnetischen Kügelchen zu eluieren, geben Sie 20 Mikroliter eiskaltes TRIS HCl zu jeder Probe und pipettieren Sie vorsichtig. Dann inkubieren Sie Ihre Proben bei 80 Grad für zwei Minuten, um die RNA aus den Kügelchen freizusetzen.Übertragen Sie den Überstand, der Poly-A-ausgewählte RNA enthält, in ein frisches Röhrchen, wobei Sie vorsichtig sein müssen, um die Verschleppung von Perlen zu vermeiden. Der Elutionsschritt sowie der Isolationsschritt sollten zweimal wiederholt werden, um die mRNA-Ausbeute zu erhöhen. mRNA ist nun bereit, entweder im Fragmentierungsschritt in die meRIP-Seq-Pipeline einzudringen oder direkt zur Bisulfit-Umwandlung überzugehen.Der erste Schritt zum Eintritt in die meRIP-Seq-Pipeline besteht in der mRNA-Fragmentierung. Dazu benötigen Sie fünf Mikrogramm mRNA, aufgeteilt in Aliquots von 18 Mikroliter in 0,2 ml Röhrchen. Um konsistente Daten zu gewährleisten, ist es wichtig, schnell und mit nur wenigen Proben zu arbeiten.Für dieses Experiment wurde die Fragmentierung optimiert, um Fragmente einer Größe zwischen 115 und 200 Nukleotiden zu erhalten. Dann fügen Sie zwei Mikroliter Fragmentierungsreagenz zu jedem Röhrchen hinzu, das 18 Mikroliter mRNA enthält, wobei Sie vorsichtig sein müssen, den Tröpfchen an der Röhrchenwand abzuscheiden. Drehen Sie alle Proben herunter, um den Kontakt zwischen dem Reagenz und der RNA gleichzeitig zu ermöglichen, und inkubieren Sie bei 70 Grad für 15 Minuten.Sobald die Inkubation beendet ist, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie zwei Mikroliter mit 0,5 M EDTA hinzufügen. An diesem Punkt können Sie Ihre fragmentierte mRNA mit der Methode Ihrer Wahl reinigen und mit einer RNA-Qualitätskontrolle durch Fragmentanalysator fortfahren. Dieser Schritt ist optional, ermöglicht es jedoch, die Größe des Fragments vor der RNA-Ausfällung zu beurteilen.Wie Sie hier in der vierten Spur sehen können, erhalten wir für unsere beiden Probenfragmente jeweils rund 150 Nukleotid. Wir fuhren dann mit meRIP-Seq fort. Der erste Schritt besteht aus Koppeln von A / G-Magnetperlen mit entweder Anti-m6A-Antikörpern oder IgG-Kontrollen.Für jeden Reaktionsplan werden 25 Mikroliter Magnetperlen in ein frisches Röhrchen gegeben. Bitte beachten Sie, dass Sie mindestens eine m6A-spezifische Bedingung und eine Kontrollbedingung benötigen. Waschen Sie jeweils 25 Mikroliter Perlen mit 250 Mikroliter IP-Puffer.Befestigen Sie die Perlen vorsichtig durch Pipettieren auf und ab und legen Sie das Rohr für eine Minute auf das Magnetgestell, um eine Perlentrennung zu ermöglichen. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand, achten Sie darauf, dass die Magnetperlen nicht angesaugt werden, und wiederholen Sie den Waschschritt einmal. Dann resuspendieren Sie die magnetischen Perlen in 100 Mikroliter IP-Puffer pro 25 Mikroliter des ursprünglichen Volumens der Perlen.Bereiten Sie eine Tube pro Bedingung vor und beschriften Sie sie. In unserem Fall haben wir zwei Röhrchen für die infizierte Erkrankung, eine für m6A und eine für die IgG-Kontrolle und zwei Röhren für die nicht infizierte Erkrankung. Dann fügen Sie 100 Mikroliter gewaschene Perlen in jedes Röhrchen hinzu.Perlen sind jetzt bereit, mit spezifischen Antikörpern oder IgG-Kontrollen gekoppelt zu werden. Jedem Röhrchen, das 100 Mikroliter gewaschene Magnetperlen enthält, werden fünf Mikrogramm entweder eines spezifischen Anti-m6A-Antikörpers oder eines Anti-IgG-Kontrollantikörpers hinzugefügt. Lassen Sie die Konjugation von Antikörper-Kügelchen zu, indem Sie das Röhrchen 30 Minuten auf einem rotierenden Rad inkubieren.Fahren Sie in der Zwischenzeit mit der Probenvorbereitung fort. Für jede geplante Bedingung, entweder m6A-spezifische oder IgG-Kontrolle, besteht Ihr Ausgangsmaterial aus 2,5 Mikrogramm fragmentierter mRNA, resuspendiert 100 Mikroliter Wasser. Um ein endgültiges Reaktionsvolumen von 500 Mikroliter zu erhalten, fügen Sie jeder Probe 295 Mikroliter Wasser hinzu.Fügen Sie dann fünf Mikroliter RNAase-Inhibitor bei 40 Einheiten pro Mikroliter für eine Gesamtmenge von 200 Einheiten pro Probe hinzu und mischen Sie vorsichtig. Schließlich fügen Sie 100 Mikroliter 5X konzentrierten IP-Puffer zu jedem Röhrchen hinzu. Die Proben sind nun bereit für die Immunfällungsreaktion.Holen Sie die mit Antikörpern gekoppelten Magnetperlen aus dem rotierenden Rad und drehen Sie sie nach unten. Fügen Sie dann 500 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Proben zu jedem 100 Mikroliter Perlen hinzu, die mit den spezifischen Antikörpern gekoppelt sind. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren, um die Perlen vollständig neu zu versenken.Inkubieren Sie sie oder Ihre meRIP-Reaktion auf einem rotierenden Rad bei vier Grad während zwei Stunden. Sobald die Inkubation vorbei ist, drehen Sie jedes Rohr herunter und legen Sie es für eine Minute auf ein magnetisches Rack, um die Perlentrennung zu ermöglichen. Entfernen Sie dann die ungebundene Fraktion und legen Sie sie auf ein frisches Röhrchen und bewahren Sie es bei Bedarf zur weiteren Analyse auf.Entfernen Sie den Magneten aus dem Rack und resuspendieren Sie alle Proben in 500 Mikroliter IP-Puffer. Resuspend jede Probe vorsichtig durch Pipettieren auf und ab. Setzen Sie den Magneten auf das Gestell ein, inkubieren Sie ihn eine Minute lang und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand.Wiederholen Sie die Wäsche zweimal und fahren Sie dann mit der Elution fort. Bereiten Sie für jedes Probenpaar, m6A spezifisch und Kontrolle, 225 Mikroliter Elutionspuffer mit 20 Millimol gereinigtem m6A vor. Dann fügen Sie 100 Mikroliter Elutionspuffer pro Probe hinzu.Inkubieren Sie alle Proben eine Stunde bei vier Grad auf einer Wippe. Sammeln Sie dann alle mit m6A angereicherten RNA-Proben in einem frischen Röhrchen und fahren Sie mit einer zweiten Elutionsrunde fort. Reinigen Sie die mit m6A angereicherte RNA mit der Methode Ihrer Wahl Und dann sind an dieser Stelle probenbereit für die Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung bereit.Um die m5C-Modifikation zu untersuchen, verwenden wir die Bisulfit-Umwandlung. Beginnen Sie das Experiment mit 500 Nanogramm poly-adenylierter RNA. Obwohl optional, können Sie durch Hinzufügen von 500 Pikogramm Poly-A-depletierter RNA zu Ihrer Probe, um eine ribosomale Repräsentation zu gewährleisten, und 0,5 Mikroliter kommerziell erhältlicher synthetischer Sequenz die Bisulfit-Umwandlungsrate bei der Sequenzierung beurteilen.Stellen Sie Ihre Probe auf ein Endvolumen von 20 Mikroliter in Wasser ein und geben Sie dann 130 Mikroliter RNA-Umwandlungsreagenz zu jeder Probe hinzu. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie alle Proben nach oben und unten pipettieren und nach unten drehen, um sicherzustellen, dass keine Tröpfchen auf der Seite der Röhrchen übrig sind. Inkubieren Sie alle Proben in einer PCR-Maschine für drei Zyklen der Denaturierung 70 Grad für fünf Minuten und der Bisulfitumwandlung bei 54 Grad während 45 Minuten.Führen Sie die In-Column-Deaminierung durch, indem Sie direkt auf eine leere Säule 250 Mikroliter RNA-Bindungspuffer, 150 Mikroliter Ihrer bisulfit-konvertierten Probe hinzufügen. Mischen Sie die Probe, indem Sie nach oben und unten pipettieren, aber achten Sie darauf, die Säulenfilter nicht zu berühren. 400 Mikroliter 95-100% Ethanol in die Proben-RNA-Bindungspuffermischung direkt in der Säule geben.Schließen Sie die Kappe und mischen Sie sofort durch Inversion. Drehen Sie Ihre Probe für 30 Sekunden herunter und verwerfen Sie den Durchfluss. Waschen Sie Ihre Säule mit Waschpuffer und fügen Sie dann 200 Mikroliter Entschwingungslösung in die Mitte jeder Säule hinzu.Inkubieren Sie Ihre gesamte Probe für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Drehen Sie die Probe für 30 Sekunden herunter und fahren Sie dann mit zwei Runden Waschen fort. Jeder Probe 400 Mikroliter Waschpuffer hinzufügen, 30 Sekunden lang mit voller Geschwindigkeit zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen.Legen Sie die Säule in ein neues leeres Röhrchen und eluieren Sie die umgewandelte Bisulfit-RNA in 20 Mikroliter Wasser. Kontrollieren Sie die Bisulfit-Umwandlungseffizienz durch RT-qPCR und fahren Sie dann mit der Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung fort. Nach der bioinformatischen Analyse finden Sie hier ein Beispiel für Ergebnisse, die Sie mit diesem Workflow erhalten können.Hier vergleichen wir das Epitranskriptom von HIV-infizierten Zellen mit nicht infizierten Zellen. 24 Stunden nach der Infektion. Im A-Panel können Sie die Ergebnisse sehen, die wir bei der Untersuchung des m6A-Epitranskriptoms erhalten.In diesem Diagramm zeichnen wir die mit m6A angereicherten Messwerte bei der meRIP-Seq-Analyse auf. Wir können gut sehen, dass ein Zinkfinger 24 Stunden nach der Infektion hypermethyliert ist. Wir haben die gleiche Art der Analyse für die m5C-Epitranskriptom-Untersuchung in Panel B.In dieser Grafik durchgeführt, jedes nicht methylierte Cytosin wird rot angezeigt, während der Anteil an Cytosin, der m5C-methyliert wurde, blau dargestellt wird.Wie Sie sehen können, PHLPP1, alle drei Cytosine, die 24 Stunden nach der HIV-Infektion hypermethyliert sind. Insgesamt erlaubt dieser Workflow, sowohl das M6A- als auch das m5C-Epitranskriptom infizierter Zellen zu untersuchen und kann als solches auch auf virale Partikel angewendet werden. Das Verständnis von Virusinfektionen, die in der Lage sind, die epitranskriptomische Wirtslandschaft zu verändern, wird uns Zugang zu einer neuen Regulierungsebene geben.Die Untersuchung von differentiell methylierten Transkripten nach einer Virusinfektion wird natürlich eine wertvolle Ressource für neue therapeutische Interventionen darstellen. Unter dem link hier unten finden Sie unsere Open-Access-Ressource für die Untersuchung des differentiellen methylierten Transkripts bei einer HIV-Infektion im Laufe der Zeit.

Research

JoVE Journal

Biology

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Forschung

Biologie

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Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfizieren RAW264.7-Zellen mit einem Luciferase-Reportergen

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Bewertung der Verfügbarkeit von Mineralien in Fischfuttermitteln mit komplementären Methoden, die am Beispiel von Zink im Atlantischen Lachs demonstriert wurden

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Single Cell Micro-Aspiration als Alternative zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung für die Trennung von Riesenviren

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Isolierung, Proliferation und Differenzierung von Rhesusaffen-Fettstammzellen

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...