Name: exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv
Uploaded: 2022-03-05T13:00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע בשווייץ (מענקים 31003A_166412 ו 314730_188877).

<ol>
	<li>Machnicka, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways--2013+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways--2013 update.</a> Nucleic Acids Research. 41, 262-267 (2013).</li><li>Zaccara, S., Ries, R. J., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading,+writing+and+erasing+mRNA+methylation.">Reading, writing and erasing mRNA methylation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 608-624 (2019).</li><li>Davalos, V., Blanco, S., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Messenger+RNA+Modifications.">SnapShot: Messenger RNA Modifications.</a> Cell. 174 (2), 498 (2018).</li><li>Saletore, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+birth+of+the+Epitranscriptome:+deciphering+the+function+of+RNA+modifications.">The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).</li><li>Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications.">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2017).</li><li>Netzband, R., Pager, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+marks:+Emerging+modulators+of+RNA+virus+gene+expression.">Epitranscriptomic marks: Emerging modulators of RNA virus gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (3), 1576 (2020).</li><li>Pereira-Montecinos, C., Valiente-Echeverria, F., Soto-Rifo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+regulation+of+viral+replication.">Epitranscriptomic regulation of viral replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (4), 460-471 (2017).</li><li>Lichinchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+human+and+viral+m(6)A+RNA+methylomes+during+HIV-1+infection+of+T+cells.">Dynamics of the human and viral m(6)A RNA methylomes during HIV-1 infection of T cells.</a> Nature Microbiology. 1, 16011 (2016).</li><li>Courtney, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+Addition+of+m(5)C+to+HIV-1+Transcripts+Regulates+Viral+Gene+Expression.">Epitranscriptomic Addition of m(5)C to HIV-1 Transcripts Regulates Viral Gene Expression.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).</li><li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+m(6)A+Editing+of+HIV-1+mRNAs+Enhances+Viral+Gene+Expression.">Posttranscriptional m(6)A Editing of HIV-1 mRNAs Enhances Viral Gene Expression.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 675-685 (2016).</li><li>Tirumuru, N., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+envelope+proteins+up-regulate+N+(6)-methyladenosine+levels+of+cellular+RNA+independently+of+viral+replication.">HIV-1 envelope proteins up-regulate N (6)-methyladenosine levels of cellular RNA independently of viral replication.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3249-3260 (2019).</li><li>Tirumuru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+of+HIV-1+RNA+regulates+viral+infection+and+HIV-1+Gag+protein+expression.">N(6)-methyladenosine of HIV-1 RNA regulates viral infection and HIV-1 Gag protein expression.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell.">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> Frontiers in Virology. 1 (11), (2021).</li><li>Khoddami, V., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+target+profiling+of+RNA+cytosine+methyltransferases+using+the+mechanism-based+enrichment+procedure+Aza-IP.">Transcriptome-wide target profiling of RNA cytosine methyltransferases using the mechanism-based enrichment procedure Aza-IP.</a> Nature Protocols. 9 (2), 337-361 (2014).</li><li>Hussain, S., Aleksic, J., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (11), 215 (2013).</li><li>Dominissini, D., Moshitch-Moshkovitz, S., Salmon-Divon, M., Amariglio, N., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+mapping+of+N6-methyladenosine+by+m6A-seq+based+on+immunocapturing+and+massively+parallel+sequencing.">Transcriptome-wide mapping of N6-methyladenosine by m6A-seq based on immunocapturing and massively parallel sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (1), 176-189 (2013).</li><li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq.">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li><li>Shobbir Hussain, J. A., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (215), (2013).</li><li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+5-methylcytosine+profiles+in+poly(A)+RNA+from+mouse+embryonic+stem+cells+and+brain.">Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain.</a> Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).</li><li>Endrullat, C., Gl&#246;kler, J., Franke, P., Frohme, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+and+quality+management+in+next-generation+sequencing.">Standardization and quality management in next-generation sequencing.</a> Applied &amp; Translational Genomics. 10, 2-9 (2016).</li><li>Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+cytosine+methylation+analysis+by+bisulfite+sequencing.">RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 12 (2009).</li><li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell.">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> biorxiv. 1 (11), (2021).</li><li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+noncoding+RNA.">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and noncoding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li><li>Aschenbrenner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+DNA+Polymerase+for+Direct+m(6)+A+Sequencing.">Engineering of a DNA Polymerase for Direct m(6) A Sequencing.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 57 (2), 417-421 (2018).</li><li>Didion, J. P., Martin, M., Collins, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atropos:+specific,+sensitive,+and+speedy+trimming+of+sequencing+reads.">Atropos: specific, sensitive, and speedy trimming of sequencing reads.</a> PeerJ. 5, 3720 (2017).</li><li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISAT:+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements.">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Okonechnikov, K., Conesa, A., Garc&#237;a-Alcalde, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualimap+2:+advanced+multi-sample+quality+control+for+high-throughput+sequencing+data.">Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., K&#228;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet Journal. 17 (1), (2011).</li><li>Shen, W., Le, S., Li, Y., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeqKit:+A+Cross-Platform+and+Ultrafast+Toolkit+for+FASTA/Q+File+Manipulation.">SeqKit: A Cross-Platform and Ultrafast Toolkit for FASTA/Q File Manipulation.</a> PLOS ONE. 11 (10), 0163962 (2016).</li><li>Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=meRanTK:+methylated+RNA+analysis+ToolKit.">meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit.</a> Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

תפקידם של שינויים ב- RNA בזיהום נגיפי עדיין אינו ידוע ברובו. הבנה טובה יותר של תפקידם של שינויים אפיטרנראציים בהקשר של זיהום ויראלי יכולה לתרום לחיפוש אחר מטרות טיפול אנטי ויראליות חדשות.
בעבודה זו, אנו מספקים זרימת עבודה מלאה המאפשרת חקירה של m6A ו- m5C epitranscriptomes של תאים נגועים. בהתאם לשאלה הביולוגית, אנו ממליצים להשתמש ב- RNA שנבחר בפולי-A כחומר התחלתי. למרות אופציונלי, כמו הצינור יכול לשמש עם RNA הכולל, חשוב לזכור כי rRNAs, כמו גם RNAs קטנים הם מאוד שונה ומכילים מספר חשוב של שאריות מתילציה. הדבר עלול לגרום לירידה באיכות ובכמות של נתוני רצף משמעותיים.
עם זאת, אם המוקד של המחקר הוא RNA שאינו פולי-adenylated, שלב החילוץ RNA צריך להיות מותאם על מנת למנוע השלכת RNA קטן (במקרה של חילוץ RNA מבוסס עמודה) וכדי הרשאות ריבוזום-דלדול טכניקות ולא בחירת poly-A להיכנס לצנרת.
על מנת להבטיח RNA באיכות גבוהה, פיצול נכון ואיכות RNA מועשרת m6A ו- BS מתאים להכנת הספרייה אנו ממליצים בחום להשתמש מנתח שברים או ביואנלייזר. עם זאת, ציוד זה אינו זמין תמיד. כחלופה, איכות הרנ"א, ה-mRNA והגודל של RNA מקוטע ניתן גם להעריך על ידי הדמיה על ג'ל אגרוז. לחלופין, ניתן לבצע הכנת ספריה ללא הערכה קודמת של כמות RNA.
השתמשנו בטכניקת MeRIP-Seq16 המבוססת על נוגדנים כדי לחקור את הנוף האפיטרנכתובי m6A. טכניקה זו מבוססת על אימונופרציפיטציה של RNA והיא מוצלחת; עם זאת, שלבים מסוימים זקוקים למיטוב זהיר ויכולים להיות קריטיים. למרות מתילציה m6A תואר להתרחש בעיקר בתוך רצף הקונצנזוס RRA * CH, מוטיב זה הוא שכיח מאוד לאורך מולקולות mRNA ואינו מאפשר זיהוי מדויק של האתר מתילציה. לכן חשוב להשיג פיצול RNA לשחזור ועקבי, יצירת שברי RNA קטנים, כדי לשפר את הרזולוציה מבוססת RIP. בפרוטוקול זה, אנו ממליצים על הליך ממוטב, המספק תוצאות ניתנות לשחזור ועקביות בסביבה הניסיונית שלנו; עם זאת, שלב פיצול זה עשוי להזדקק למיטוב נוסף בהתאם לתכונות לדוגמה ספציפיות.
לאחרונה תוארה טכניקה חדשה המאפשרת רצף ישיר של m6A. הוא מבוסס על השימוש בגרסאות תמלול הפוכות ספציפיות המציגות חתימות RT ייחודיות כתגובה למפגש עם m6A RNA modification24. טכנולוגיה זו, לאחר אופטימיזציה זהירה, יכולה לעקוף את המגבלה העיקרית העומדת בפני MeRIP-Seq (הפחתת כמות החומר הראשוני ומאפשרת רזולוציה גבוהה יותר). כדי לחקור את שינוי m5C החלטנו להשתמש בטכניקת ההמרה bisulfite על מנת לזהות ברזולוציית נוקלאוטיד שאריות C שונה. על מנת להפחית את שיעור החיובי השגוי בשל נוכחותם של מבנים משניים RNA, ביצענו 3 מחזורים של המרת denaturation / bisulfite ולשלוט נוסף בביצועי שיעור ההמרה bisulfite הודות לשימוש של בקרת ספייק-אין ERCC. אחת המגבלות הקשורות לטכניקה זו היא כי המרת bisulfite הוא קשה מאוד ושלושה מחזורים של denaturation / ביסולפיט המרה יכול לבזות כמה RNA ולכן להפחית את הרזולוציה. עם זאת, בהגדרה שלנו, בחרנו להסתפק ברזולוציה מעט נמוכה יותר על מנת להגדיל את איכות ערכת הנתונים.
הודות לאופטימיזציות ובקרות אלה, הצלחנו לספק זרימת עבודה אמינה וקול שניתן לנצל כדי לחקור את הנוף האפיטרנכתובי ואת השינוי שלו בהקשר של זיהומים ויראליים, אינטראקציות מארח-פתוגן, או כל חשיפה לטיפולים ספציפיים.

זה זמן רב ידוע כי מולקולות RNA ניתן לשנות, ויותר מ 150 שינויים לאחר שעתוק תוארו עד כה1. הם מורכבים בנוסף של קבוצות כימיות, בעיקר קבוצות מתיל, כמעט כל מיקום של טבעות pyrimidine ו purine של מולקולות RNA2. שינויים כאלה לאחר התמלול כבר הוכחו להיות מועשר מאוד בRNA העברה (tRNA) ו RNA ריבוזומלי (rRNA) ולאחרונה תוארו על מולקולות mRNA גם כן.
עלייתן של טכנולוגיות חדשות, כגון רצף הדור הבא (NGS), וייצור נוגדנים ספציפיים המזהים שינויים כימיים מוגדרים אפשרו, לראשונה, את חקירת המיקום ואת תדירות השינויים הכימיים הספציפיים ברמה של תמלול. התפתחויות אלה הובילו להבנה טובה יותר של שינויי RNA ומיפוי של מספר שינויים במולקולות mRNA3,4.
בעוד אפיגנטיקה חוקרת את התפקיד של שינויי DNA והיסטון בוויסות התמלול, epitranscriptomics באופן דומה מתמקד שינויים RNA ואת תפקידם. חקירת השינויים האפיטרנכתוביים מספקת הזדמנויות חדשות להדגיש מנגנוני רגולציה חדשניים שעשויים לכוונן מגוון תהליכים תאיים (כלומר, חבית RNA, ייצוא, יציבות ותרגום)5. לכן לא הייתה זו הפתעה גדולה כי מחקרים אחרונים חשפו שינויים אפיטרנכרומיים רבים על זיהום ויראלי הן ב- RNAs הסלולר והן ב- RNAs6 הנגיפי. וירוסים שנחקרו עד כה כוללים הן DNA והן וירוסי RNA; ביניהם, HIV יכול להיחשב כדוגמה חלוצית. בסך הכל, גילוי מתילציה של RNA בהקשר של זיהומים ויראליים עשוי לאפשר חקירה של מנגנונים שטרם נרשמו של ביטוי ויראלי או שכפול, ובכך לספק כלים ויעדים חדשים לשלוט בהם7.
בתחום האפיטרנכתובת של HIV, שינויים של תמלילים ויראליים נחקרו בהרחבה והראו כי נוכחותו של שינוי זה מועילה לשכפול נגיפי8,9,10,11,12,13. עד כה ניתן להשתמש בטכניקות שונות כדי לזהות סימנים אפיטרנראתומים ברמה של תמלול. הטכניקות הנפוצות ביותר לזיהוי m6A מסתמכות על טכניקות משקעים חיסוניות כגון MeRIP-Seq ו- miCLIP. בעוד MeRIP-Seq מסתמך על פיצול RNA כדי ללכוד שברים המכילים שאריות מתילציה, miCLIP מבוסס על הדור של α-m6A נוגדנים ספציפיים מוטציות חתימה על RNA-נוגדן UV crosslinking, ובכך מאפשר מיפוי מדויק יותר.
זיהוי של שינוי m5C יכול להיות מושגת על ידי טכנולוגיות מבוססות נוגדנים הדומות לזיהוי m6A (m5C RIP), או על ידי המרת ביסולפיט או על ידי AZA-IP או על ידי miCLIP. הן Aza-IP והן m5C miCLIP משתמשים במתיל-טרנספראז ספציפי כפיתיון ל-RNA ממוקד תוך כדי עבירת מתילציה של RNA. ב Aza-IP, תאי היעד נחשפים 5-azacytidine, וכתוצאה מכך המבוא אקראי של אתרי 5-אזציטידין אנלוגי ציטדין לתוך RNA המתהווה. ב- miCLIP, מתילטרנספראז NSun2 מהונדס גנטית כדי לספק מוטציה C271A14,15.
בעבודה זו, אנו מתמקדים באפיון הכפול של m6A ו- m5C שינויים בתאים נגועים, באמצעות HIV כמודל. לאחר אופטימיזציה מתודולוגית, פיתחנו זרימת עבודה המשלבת אימונופרציפיטציה של RNA מתילציה (MeRIP) והמרת RNA ביסולפיט (BS), המאפשרת חקירה סימולטנית של סימנים אפיטרנרתיים m6A ו- m5C ברמה רחבת התמלול, הן בהקשרים תאיים והן בהקשרים ויראליים. זרימת עבודה זו יכולה להיות מיושמת על תמציות RNA סלולרי, כמו גם על RNA מבודד מחלקיקים ויראליים.
הגישה של RNA ImmunoPrecipitation (MeRIP)16 המאפשרת חקירה של m6A ברמה הרחבה של התמלול מבוססת היטב ומערך של נוגדנים ספציפיים ל- m6A זמינים מסחרית עד כה17. שיטה זו מורכבת מלכידה סלקטיבית של חלקי RNA המכילים m6A באמצעות נוגדן ספציפי m6A. שני החסרונות העיקריים של טכניקה זו הם (i) הרזולוציה המוגבלת, התלויה מאוד בגודל של שברי RNA ובכך מספקת מיקום ואזור משוערים המכילים את שאריות המתילציה, ו- (ii) כמות החומר הגדולה הדרושה לביצוע הניתוח. בפרוטוקול הממוטב הבא, התקנו את גודל הקטע לכ-150 nt והפחתנו את כמות החומר ההתחלתי מ-10 מיקרוגרם של RNA שנבחר בפולי-A, שהוא כיום הכמות המומלצת של חומר התחלתי, ל-1 מיקרוגרם בלבד של RNA שנבחר בפולי-A. כמו כן, הגדלנו את יעילות ההתאוששות של שברי m6A RNA הקשורים לנוגדנים ספציפיים באמצעות אלוטציה על ידי גישת תחרות עם פפטיד m6A במקום שיטות אלוטציה קונבנציונליות יותר ופחות ספציפיות באמצעות טכניקות מבוססות פנול או פרוטאינאז K. המגבלה העיקרית של עשייה מבוססת RIP זו, עם זאת, נשארת הרזולוציה התת-אופטימלית שאינה מאפשרת זיהוי של נוקלאוטיד A שונה מדויק.
ניתוח של סימן m5C יכול להתבצע כעת באמצעות שתי גישות שונות: שיטה מבוססת RIP עם נוגדנים ספציפיים m5C והמרת RNA ביסולפיט. כמו RIP מציע רק רזולוציה מוגבלת על זיהוי של שאריות מתילציה, השתמשנו המרה bisulfite שיכול להציע רזולוציה נוקלאוטיד יחיד. חשיפה ל-RNA לביסולפיט (BS) מובילה לדיהון ציטוסין, ובכך ממירה את שאריות הציטוסין לאורסיל. לכן, במהלך תגובת ההמרה RNA bisulfite, כל ציטוסין שאינו מתילציה הוא deaminated וומר uracil, בעוד נוכחות של קבוצת מתיל בעמדה 5 של ציטוסין יש השפעה מגנה, מניעת deamination הנגרמת על ידי BS ושמירה על שאריות ציטוסין. הגישה המבוססת על BS מאפשרת זיהוי של נוקלאוטיד שונה m5C ברזולוציית בסיס יחיד ולהערכת תדירות המתילציה של כל תעתיק, ומספקת תובנות על דינמיקת שינוי m5C18. המגבלה העיקרית של טכניקה זו עם זאת מסתמכת על שיעור חיובי שווא של שאריות מתיל. ואכן, המרת BS יעילה ברנ"א חד-גדילי עם שאריות C נגישות. עם זאת, נוכחות של מבנה משני RNA הדוק יכול להסוות את המיקום N5C ולעכב המרת BS, וכתוצאה מכך שאריות C שאינן מתילות שאינן מומרות לשאריות U, ובכך חיוביות שגויות. כדי לעקוף בעיה זו ולמזער את שיעור החיובי השגוי, החלנו 3 סיבובים של דנטורציה ומחזורי המרה bisulfite19. הצגנו גם 2 פקדים בדגימות כדי לאפשר הערכה של יעילות ההמרה של ביסולפיט: אנו ספייק-בבקרות רצף ERCC (רצפים מתוקננים ללא מתילציה וזמינים מסחרית)20, כמו גם RNAs פולי-A-מרוקן כדי להעריך את שיעור ההמרה bisulfite מצד אחד, וכדי לוודא על ידי RT-PCR נוכחות של אתר מתיל ידוע ושמורה היטב, C4447, על RNA ריבוזומלי 28S מצד שני21.
בתחום הוירולוגיה, צימוד שתי שיטות חקירה אפיטרנראולוגיות אלה עם הדור הבא רצף וניתוח ביואינפורמטי מדויק מאפשר מחקר מעמיק של דינמיקה m6A ו- m5C (כלומר, שינוי RNA שינויים זמניים שעלולים להתרחש עם זיהום ויראלי ויכול לחשוף מערך של מטרות חדשות רלוונטיות מבחינה טיפולית לשימוש קליני).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrime Pfx SuperMix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12344-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ RNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>EZR5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-472-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-471-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina TruSeq Stranded mRNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Beads A/G Blend</td>
			<td>Merck</td>
			<td>16-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-Methyladenosine, 5&#8242;-monophosphate sodium salt (m6A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2780-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse IgG</td>
			<td>Merk</td>
			<td>12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo(dT)25</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61005,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRapace</td>
			<td>Stratec</td>
			<td>1020220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick RNA Viral Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Fragmentation Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv

תפקידם של שינויים ברנ"א בתהליכים ביולוגיים היה במוקד של מספר גדל והולך של מחקרים בשנים האחרונות וידוע כיום כאפיטרנכתובת. בין היתר, N6-מתילדנוסין (m6A) ו 5-מתילציטוסין (m5C) שינויים RNA תוארו על מולקולות mRNA, עשוי להיות תפקיד באפנון תהליכים תאיים. Epitranscriptomics הוא אפוא שכבה חדשה של רגולציה שיש לשקול בנוסף ניתוחים transcriptomic, כפי שהוא יכול גם להיות שונה או מווסת על ידי חשיפה לכל חומר כימי או ביולוגי, כולל זיהומים ויראליים.
כאן, אנו מציגים זרימת עבודה המאפשרת ניתוח של הנוף האפיטרנולוגי התאי והוויראלי המשותף של סימני m6A ו- m5C בו זמנית, בתאים נגועים או לא בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV). לאחר בידוד mRNA ופיצול מתאים נגועים ב- HIV ולא נגועים, השתמשנו בשני הליכים שונים: MeRIP-Seq, טכניקה מבוססת אימונופרציפיטציה של RNA, כדי להעשיר עבור שברי RNA המכילים את סימן m6A ו- BS-Seq, טכניקה מבוססת המרה ביסולפיט, כדי לזהות את סימן m5C ברזולוציה נוקלאוטיד אחת. עם לכידת מתילציה ספציפית, ספריות RNA מוכנות לרצף בעל תפוקה גבוהה. פיתחנו גם צינור ביואינפורמטיקה ייעודי לזיהוי תמלילים מתילאטים (DM) באופן דיפרנציאלי ללא תלות מפרופיל הביטוי הבזלי שלהם.
בסך הכל, המתודולוגיה מאפשרת לחקור סימנים אפיטרנראציים מרובים בו זמנית ומספקת אטלס של תמלילי DM על זיהום ויראלי או כל שיבוש תאים אחר. גישה זו מציעה הזדמנויות חדשות לזהות שחקנים חדשים ומנגנונים חדשניים של תגובת תאים, כגון גורמים תאיים המקדמים או מגבילים שכפול ויראלי.

זרימת עבודה זו הוכיחה שימושי לחקור את התפקיד של m6A ו m5C מתילציה בהקשר של זיהום HIV. בשביל זה, השתמשנו במודל קו תאים CD4+ T (SupT1) שאנחנו גם להדביק עם HIV או לא מטופל. התחלנו את זרימת העבודה עם 50 מיליון תאים לכל תנאי וקיבלנו בממוצע 500 מיקרוגרם של RNA כולל עם מספר איכות RNA של 10 (איור 1A-B). בבחירת פולי-A חזרנו בין 10 ל-12 מיקרוגרם של mRNA לכל תנאי (המייצגים כ-2% מסך הרנ"א) (איור 1B). בשלב זה, השתמשנו 5 מיקרוגרם של פולי-A-נבחר RNA עבור צינור MeRIP-Seq ו 1 מיקרוגרם עבור צינור BS-Seq. מאז HIV RNA הוא poly-adenylated, אין צורך בפעולה נוספת וניתן ליישם ישירות הליכי MeRIP-Seq ו- BS-Seq.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig01.jpg"> איור 1: הכנת RNA ליישומים במורד הזרם. A) זרימת עבודה המתארת הכנה והפצה של RNA עבור צינורות MeRIP-Seq ו- BS-Seq בו-זמניים. כל צורת משושה ממולאת מייצגת סוג שינוי RNA, כגון m6A (ירוק) או m5C (ורוד). כמויות של חומר RNA הדרושים לביצוע הניסוי מסומנים. B) תוצאות מייצגות המתארות פרופילי הפצת RNA צפויים (גודל וכמות) על חילוץ RNA כולל (פאנל עליון) ובחירת פולי-A (החלונית התחתונה). דגימות נטענו על מנתח הקטעים עם ערכת רגישות סטנדרטית על מנת להעריך את איכות ה- RNA לפני הזנת הליכי MeRIP-Seq ו- BS-Seq ספציפיים. RQN: מספר איכות RNA; nt: נוקלאוטידים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
צינור MeRIP-Seq הוא טכניקה מבוססת אימונופרציפיטציה של RNA המאפשרת חקירה של שינוי m6A לאורך מולקולות RNA. בשביל זה, RNA הוא תחילה מקוטע ולאחר מכן דגירה עם נוגדנים ספציפיים m6A בשילוב חרוזים מגנטיים עבור immunoprecipitation ולכידה. שברי RNA מועשרים ב-MeRIP והשבר שלא נגעו בהם (קלט) רצפים ומושווים לזיהוי אזורי RNA שעברו שינוי m6A וכך תעתיקים מתילציה m6A(איור 2A). הרזולוציה של הטכניקה מסתמכת על היעילות של פיצול RNA. ואכן, שברים קצרים יותר מאפשרים לוקליזציה מדויקת יותר של שאריות m6A. כאן, RNAs הסלולר שנבחר על-ידי פולי-A ו- RNAs ויראליים היו נתונים לפיצול מבוסס יונים עם מאגר פיצול RNA במהלך 15 דקות בנפח סופי של 20 μL כדי להשיג שברי RNA של 100-150 nt. החל מ-5 מיקרוגרם של mRNA, התאוששנו מ-4.5 מיקרוגרם של רנ"א מקוטע, המקביל לשיעור התאוששות של 90% (איור 2B). השתמשנו ב-100 ננוגרם של רנ"א מקוטע ומטוהר כבקרת קלט, הכפופה ישירות להכנת הספרייה ולרצף. הרנ"א הנותר (~4.4 מיקרוגרם) עובד על פי צינור MeRIP-Seq, שמתחיל בדגורה של RNA מקוטע עם חרוזים הקשורים לנוגדנים ספציפיים נגד m6A או לנוגדנים אנטי-IgG כשליטה. RIP (MeRIP) ספציפי ל-m6A של 2.5 מיקרוגרם של רנ"א מקוטע אפשר לאחזר כ-15 ננוגרם של חומר מועשר ב-m6A, שעבר הכנה ורצף בספרייה (איור 2B). RIP עם בקרת אנטי-IgG, כצפוי, לא הניב מספיק RNA כדי לאפשר ניתוח נוסף (איור 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig02.jpg"> איור 2: צינור MeRIP-Seq. א) ייצוג סכמטי של זרימת עבודה של MeRIP-Seq ובקרת קלט. עם בחירת פולי-A, דגימות היו מקוטעות לחתיכות 120-150 nt, או ישירות נתון רצף (100 ננוגרם, בקרת קלט), או משמש עבור אימונופרציפיטציה RNA (2.5 מיקרוגרם, RIP) עם נוגדן ספציפי נגד m6A או נוגדן IgG כשליטה שלילית לפני הרצף. B) תוצאות מייצגות המציגות פרופילי הפצת RNA צפויים (גודל וכמות) בעת פיצול (החלונית העליונה) ו- RIP (חלוניות תחתונות, MeRIP: שמאל, פקד IgG: מימין). דגימות נטענו על מנתח קטעים כדי להעריך את איכות RNA וריכוז לפני עיבוד נוסף להכנת הספרייה ורצף. ניתוח RNA מקוטע בוצע באמצעות ערכת הרגישות הסטנדרטית של RNA בעוד ש-RNA ללא חיסון השתמש בערכת הרגישות הגבוהה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
צינור BS-Seq מאפשר חקר של שינוי RNA m5C ברזולוציית נוקלאוטיד ומוביל לזיהוי של תמלילים m5C-מתילציה. עם המרת ביסולפיט, ציטוצינים שאינם מתילאטים מומרים לאורסיל, בעוד ציטוצינים מתילאט נשארים ללא שינוי (איור 3A). בשל התנאים הקשים של הליך המרת ביסולפיט (כלומר, טמפרטורה גבוהה ו- pH נמוך), mRNAs שהומרו מושפלים מאוד (איור 3B), אולם זה לא מפריע להכנת הספרייה ורצף. המרת ביסולפיט יעילה רק ברנ"א חד-גדילי, ולכן עלולה להיות מעוכבת על ידי מבני RNA דו-גדיליים משניים. כדי להעריך את היעילות של המרת C-U הצגנו שני פקדים. כשליטה חיובית, ניצלנו את הנוכחות שתוארה בעבר של ציטוסין מתילציה מאוד בעמדה C4447 של 28S rRNA23. עם הגברה RT-PCR ורצף של שבר 200 bp המקיף את האתר מתילציה אנו יכולים לראות כי כל ציטוזינים הוסבו בהצלחה uracils, ובכך הופיע כמו thymidines ברצף ה- DNA, למעט ציטוסין במיקום 4447 שנותר ללא שינוי. כפקד על קצב ההמרה של ביסולפיט, השתמשנו ברצפי RNA סינתטיים זמינים מסחרית של ERCC. תערובת זו מורכבת ממאגר של רצפי RNA ידועים, לא מתילציה ופולי-אדנילציה, עם מגוון מבנים ואורכי משניים. עם הכנת הספרייה ורצף, התמקדנו אלה רצפי ERCC כדי לחשב את שיעור ההמרה, אשר ניתן לבצע על ידי ספירת מספר C המרה בין שאריות C הכולל בכל רצפי ERCC ובכל מדגם. השגנו שיעור המרה של 99.5%, המאשר את היעילות וההצלחה של תגובת ההמרה של ביסולפיט (איור 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig03.jpg"> איור 3: צינור ב.ס.ס.ס.ק. א) ייצוג סכמטי של זרימת עבודה של BS-Seq. עם בחירת פולי-A, דגימות חשופות ביסולפיט, וכתוצאה מכך המרה C ל- U (עקב deamination) עבור שאריות C שאינן מתיל. לעומת זאת, שאריות C מתילאט (m5C) אינן מושפעות מטיפול ביסולפיט ונשארות ללא שינוי. ב) תוצאה מייצגת של פרופיל הפצת RNA (גודל וכמות) שעבר ביסולפיט בעת ניתוח מנתח קטעים עם ערכת רגישות סטנדרטית. C) אלקטרופרוגרמה המציגה תוצאת רצף מייצגת של אמפליסון RT-PCR של האזור המקיף את 100% מתילציה C במיקום 4447 ב 28S rRNA (מודגש בכחול). לעומת זאת, שאריות C של רצף הייחוס זוהו כשאריות T ברצף האמפליקון עקב הצלחת המרת ביסולפיט. ד) הערכה של שיעור ההמרה C-U על ידי ניתוח של רצפי ספייק-אין ERCC בתאים נגועים ב- HIV ולא נגועים. שיעור ההמרה הממוצע הוא 99.5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
דגימות מועשרות M6A, דגימות מומרים של ביסולפיט ובקרות קלט מעובדות עוד יותר להכנת הספרייה, רצף וניתוח ביואינפורמטי (איור 4). על פי התכנון הניסיוני ושאלות ביולוגיות שנדונו, ניתן ליישם ניתוחים ביואינפורמטיים מרובים. כהוכחה עקרונית כאן, אנו מציגים תוצאות מייצגות מיישום פוטנציאלי אחד (כלומר, ניתוח מתילציה דיפרנציאלי), המתמקד בזיהוי של תמלילים מתילציה דיפרנציאלית המושרה על הידבקות ב- HIV. בקצרה, חקרנו את רמת המתילציה m6A או m5C של תמלילים, ללא תלות ברמת ביטוי הגנים שלהם, הן בתאים שאינם נגועים והן בתאים נגועים ב- HIV, על מנת להבין עוד יותר את תפקידם של מתילציות RNA במהלך מחזור החיים הנגיפי. עם נורמליזציה של ביטוי הגנים, זיהינו כי התמליל ZNF469 היה דיפרנציאלי m6A-מתילציה בהתאם למצב הזיהום, אכן תעתיק זה לא היה מתילציה בתאים שאינם נגועים בזמן שהוא הציג כמה פסגות מתילציה על זיהום HIV (איור 5A). ניתוח מתילציה דיפרנציאלי דומה ב-m5C גילה כי התמליל PHLPP1 הכיל מספר שאריות מתילציה, אשר נוטות להיות מתילציה בתדירות גבוהה יותר במצב HIV (איור 5B). בהקשר זה, שני הניתוחים מראים כי זיהום HIV משפיע על epitranscriptome הסלולר.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig04.jpg"> איור 4: ייצוג סכמטי של זרימת העבודה הביו-אינפורמטית לניתוח נתוני m6A ו- m5C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig05.jpg"> איור 5: דוגמה לתעתיקים מתילים דיפרנציאליים עם זיהום. A) תוצאה מייצגת המציגה m6A מתילציה של ZNF459 תעתיק בתאים נגועים ב- HIV (ירוק) ולא נגועים (אפור). עוצמת שיא (עם חיסור ביטוי קלט) מוצגת בציר ה- y ובמיקום בכרומוזום לאורך ציר ה- x. ניתוח מתילציה דיפרנציאלי מגלה כי ZFN469 תעתיק הוא hypermethylated על זיהום HIV. B) תוצאה מייצגת של גן מתילציה m5C בתאים נגועים ב- HIV (נתיב עליון) ותאים שאינם נגועים (נתיב תחתון). הגובה של כל סרגל מייצג את מספר הקריאות לכל נוקלאוטיד ומאפשר הערכת כיסוי. כל שאריות C ב מיוצג באדום, ואת החלק של C מתילציה מיוצג בכחול. שיעור המתילציה המדויק (%) מדווח מעל כל שאריות C. חצים מדגישים באופן סטטיסטי משמעותי מבחינה דיפרנציאלית C. דוגמאות היו דמיינו באמצעות מציג IGV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

התפקיד של שינויים RNA בזיהומים ויראליים רק מתחיל להיחקר והוא יכול להדגיש מנגנוני אינטראקציה ויראלי מארח חדשים. בעבודה זו, אנו מספקים צינור לחקור m6A ו m5C RNA שינויים בהקשר של זיהומים ויראליים.

לחקור m6A ו- m5C Epitranscriptomes על זיהום ויראלי: דוגמה עם HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

היי, בסרטון הזה נראה לכם איך לחקור את האפילטרנום m6A ו- m5C על זיהום ויראלי. כדי להתחיל את הניסוי, תצטרך 50 מיליון תאים עבור הלא נגועים ו -50 מיליון למצב הנגוע. על מנת לקבל ערכת נתונים באיכות גבוהה בעת הניתוח, תצטרך להשיג זיהום אוניברסלי.כאן אנו מדביקים תאים אלה בווקטור מבוסס HIV ומודדים את GFP המקודד באופן ויראלי על ידי FACS. במקרה זה, היו לנו 80% מהתאים הנגועים והמשכנו בזרימת העבודה החל מיצוי RNA כולל. אז חילקנו את התאים באליקוטים של 10 מיליון כל אחד וחילקו אותם ב-1 מ"ל של טריזול.לאחר מכן הוספנו 200 מיקרוליטר של כלורופורם לתא lysate מעורב על ידי היפוך. בשלב זה, אנו נותנים ליסייט לשבת במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן צנטריפוגה כל הדגימות במהירות גבוהה במשך 15 דקות בארבע מעלות. אתם תצפו לראות הפרדת פאזה בשלושה שלבים שונים, כפי שמוצג כאן.RNA יושב בשלב העליון, אז בזהירות להעביר את השלב מימי לתוך צינור טרי על ידי תשומת לב לא להעביר את השכבה האורגנית. בשלב זה, להוסיף 0.5 מ"ל של איזופרופנול לשלב מימית ולערבב בזהירות על ידי היפוך. לאחר מכן ניתן לדגור דגימות שעה אחת ב-80 מעלות כדי להבטיח משקעים של RNA.עם צנטריפוגה במהירות גבוהה, אתה אמור להיות מסוגל לראות כדור RNA נחמד כפי שמוצג כאן. בזהירות להשליך את supernatant או על ידי היפוך או על ידי pipetting, לשים לב לא לשבש את הכדור. ואז לשטוף את גלולה RNA עם mL אחד של 75% אתנול מולקולרי כיתה.ומערבולת המדגם בקצרה. עם צנטריפוגה, הקפד לאחזר כדורי RNA לבן נחמד. להשליך את supernatant ולתת גלולה RNA יבש במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לשפץ כל גלולה ב 20 מיקרוליטר של מים ובריכה כל מדגם מאותו מצב יחד. סה"כ RNA מוכן כעת לבידוד mRNA על ידי בחירת poly-A. עבור כל מדגם של 75 מיקרוגרם של RNA, להכין 200 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים oligo-DT ולשטוף אותם במ"ל אחד של חיץ מחייב.מניחים את הצינור על מעמד מגנטי ומאפשרים לחרוזים להיקשר למגנט במהלך תערובת אחת. להשליך את supernatant ולחזור על ההליך עבור שטיפה שנייה. לאחר מכן להסיר את החרוזים מן הדוכנים המגנטיים ולהחזיר אותם בזהירות 100 מיקרוליטר של חיץ מחייב.בשלב זה, להכין את מדגם RNA על ידי חלוקתם ב 75 מיקרוגרם של RNA לכל aliquot resuspended ב 100 microliter של מים. מוסיפים 100 מיקרוליטר של חיץ כריכה ודגרה במשך שתי דקות ב 65 מעלות. ואז לסובב את הדגימות ודגרה על קרח.הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים שטופים לכל דגימת RNA ואפשרו כריכה על גלגל מסתובב למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, מניחים את הצינור בחזרה לתוך מתלה מגנטי ולתת להם לדגור במשך דקה אחת. ואז לשחזר את supernatant לתוך צינור טרי ולשמור אותו בצד לסיבוב שני של בידוד.לשטוף את החרוזים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של מאגר כביסה ולאחר מכן להמשיך אל ההמלטה. על מנת לברוח פולי-A נבחר RNA מן החרוזים המגנטיים, להוסיף 20 מיקרוליטר של HCl TRIS קר כקרח לכל מדגם פיפטה בזהירות. ואז לדגור הדגימות שלך ב 80 מעלות במשך שתי דקות כדי לשחרר את RNA מהחרוזים.העבר את supernatant המכיל פולי-A נבחר RNA לצינור טרי, להיות זהיר בהימנעות חרוזים לשאת. יש לחזור על שלב ההתחמקות, כמו גם על צעד הבידוד פעמיים על מנת להגדיל את תפוקת ה-mRNA. mRNA מוכן כעת להיכנס לצינור meRIP-Seq בשלב הפיצול או לעבור ישירות להמרת ביסולפיט.השלב הראשון לכניסה לצינור meRIP-Seq מורכב מפיצול mRNA. בשביל זה, אתה צריך חמישה מיקרוגרם של mRNA מחולק aliquots של 18 microliter בצינורות 0.2 מ"ל. על מנת להבטיח נתונים עקביים, חיוני לעבוד במהירות ועם מדגם מעט בלבד באותו זמן.לניסוי זה, הפיצול עבר אופטימיזציה על מנת להשיג שבר בגודל שבין 115 ל-200 נוקלאוטידים. לאחר מכן להוסיף שני microliter של ריאגנט פיצול לכל צינור המכיל 18 microliter של mRNA להיות זהיר בהפקדת טיפה על קיר הצינור. ספין את כל הדגימות על מנת לאפשר מגע בין ריאגנט ו RNA באותו זמן ודגורה ב 70 מעלות במשך 15 דקות.לאחר שהדגרה מסתיימת, הפסיקו את התגובה על ידי הוספת שני מיקרוליטר של 0.5 M EDTA. בשלב זה, אתה יכול לטהר mRNA מקוטע שלך עם שיטת הבחירה שלך ולהמשיך בקרת איכות RNA על ידי מנתח שברים. שלב זה הוא אופציונלי, אך הוא יאפשר להעריך את גודל הקטע לפני הפעלת משקעי RNA.כפי שניתן לראות כאן בנתיב הרביעי, אנו משיגים עבור שבר הדגימה שלנו של כ -150 נוקלאוטיד כל אחד. לאחר מכן המשכנו עם meRIP-Seq. השלב הראשון מורכב מכמה חרוזים מגנטיים A/G עם נוגדנים אנטי-m6A או פקדי IgG.עבור כל תוכנית תגובה, העבר 25 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים לצינור טרי. אנא שימו לב כי תזדקקו לפחות למצב אחד ספציפי ל-m6A ולתנאי בקרה אחד. לשטוף כל 25 microliter של חרוזים עם 250 microliter של חוצץ IP.יש לתתכנו מחדש בעדינות את החרוזים על ידי צנרת מעלה ומטה ומניחים את הצינור על המדף המגנטי למשך דקה אחת על מנת לאפשר הפרדת חרוזים. הסר והשלך את supernatant, לשים לב לא שאיפה חרוזים מגנטיים ולחזור על שלב לשטוף פעם אחת. לאחר מכן resuspend החרוזים המגנטיים ב 100 microliter של מאגר IP לכל 25 microliter של נפח המקורי של חרוזים.להכין ולתייג צינור אחד לכל תנאי. במקרה שלנו, יהיו לנו שני צינורות למצב הנגוע, אחד עבור m6A ואחד לשליטה IgG, ושני צינורות למצב שאינו נגוע. לאחר מכן להוסיף 100 microliter של חרוזים שטופים בכל צינור.החרוזים מוכנים כעת להיות יחד עם נוגדנים ספציפיים או פקדי IgG. הוסף חמישה מיקרוגרם של נוגדן אנטי-m6A ספציפי או נוגדן בקרה אנטי-IgG לכל צינור המכיל 100 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים שטופים. אפשר הטיות נוגדנים-חרוזי על ידי דגירה הצינור 30 דקות על גלגל מסתובב.בינתיים, להמשיך עם הכנת מדגם. עבור כל תנאי מתוכנן, או m6A ספציפי או בקרת IgG, החומר ההתחלתי שלך יהיה 2.5 מיקרוגרם של mRNA מקוטע resuspended 100 microliter של מים. כדי לקבל נפח תגובה סופי של 500 מיקרוליטר, הוסף 295 מיקרוליטר מים לכל דגימה.מוסיפים אז חמישה מיקרוליטרים של מעכבי RNAase מרוכזים ב-40 יחידות למיקרוליטר לכמות כוללת של 200 יחידות לדגימה ומערבבים בעדינות. לבסוף להוסיף 100 microliter של 5X מרוכז מאגר IP לכל צינור. הדגימות מוכנות כעת לתגובת המשקעים החיסונית.לאחזר את החרוזים המגנטיים יחד עם נוגדן מהגלגל המסתובב ולסובב אותם למטה. הוסף אז 500 מיקרוליטר של הדגימות שהוכנו בעבר לכל 100 מיקרוליטר של חרוזים יחד עם הנוגדנים הספציפיים. מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים כדי resuspend החרוזים לחלוטין.לדגור אותם או תגובת meRIP שלך על גלגל מסתובב בארבע מעלות במהלך שעתיים. לאחר הדגירה נגמרת, לסובב את כל צינור ומניחים אותם על מתלה מגנטי במשך דקה אחת כדי לאפשר הפרדת חרוזים. לאחר מכן להסיר את השבר הלא מאוגד ולהניח אותו על צינור טרי ולשמור אותו לניתוח נוסף, במידת הצורך.הסר את המגנט מן המדף ו resuspend כל הדגימות ב 500 microliter של מאגר IP. יש לבחון מחדש כל דגימה בזהירות על ידי צנרת למעלה ולמטה. הכנס את המגנט על המדף, דגירה במשך דקה אחת ולאחר מכן להסיר בזהירות את supernatant.חזור על הכביסה פעמיים, ולאחר מכן להמשיך עם elution. עבור כל זוג של מדגם, m6A ספציפי ושליטה, להכין 225 microliter של מאגר elution המכיל 20 מילימולר של m6A מטוהר. לאחר מכן להוסיף 100 microliter של חוצץ elution לכל מדגם.לדגור כל מדגם שעה אחת בארבע מעלות על רוקר. לאחר מכן לאסוף את כל דגימת RNA מועשר m6A בצינור טרי ולהמשיך עם סיבוב שני של elution. לטהר את m6A מועשר RNA עם שיטת הבחירה שלך ולאחר מכן בשלב זה דגימות מוכנות להכנת הספרייה ורצף.כדי לחקור את השינוי m5C, אנו משתמשים בהמרת ביסולפיט. התחל את הניסוי עם 500 ננוגרם של RNA פולי-אדנילאט. למרות שזה אופציונלי, הוספה לדגימה שלך 500 פיקוגרמה של RNA מדולדל פולי-A כדי להבטיח ייצוג ריבוזומלי ו- 0.5 מיקרוליטר של רצף סינטטי זמין מסחרית יאפשר לך להעריך את קצב ההמרה של ביסולפיט בעת הרצף.כוונן את הדגימה לנפח סופי של 20 מיקרו-ליטר במים ולאחר מכן הוסף 130 מיקרוליטר של ריאגנט המרת RNA לכל דגימה. מערבבים בזהירות על ידי צנרת למעלה ולמטה ולסובב את כל המדגם כדי לוודא כי לא נותרו טיפות בצד הצינורות. לדגור את כל המדגם במכונת PCR במשך שלושה מחזורים של denaturation 70 מעלות במשך חמש דקות המרת bisulfite ב 54 מעלות במהלך 45 דקות.בצעו דיאציה בעמודה על ידי הוספה ישירה לעמודה ריקה, 250 מיקרוליטר של מאגר איגוד RNA, 150 מיקרוליטר של המדגם המומר ביסולפיט שלך. ערבבו את המדגם על ידי צנרת למעלה ולמטה, אך שימו לב לא לגעת במסנני העמודות. הוסף 400 מיקרוליטר של 95-100% אתנול לתערובת מאגר איגוד RNA מדגם ישירות בעמודה.סגור את המכסה ומערבב מיד על ידי היפוך. סובב את הדגימה שלך למשך 30 שניות ומחק את הזרימה. שטפו את העמוד שלכם עם מאגר כביסה ולאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטר של פתרון desulphonation למרכז כל עמודה.דגרו את כל הדגימה שלכם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. ספין את המדגם במשך 30 שניות ולאחר מכן להמשיך עם שני סיבובים של כביסה. הוסף 400 מיקרוליטר של חוצץ כביסה לכל מדגם, צנטריפוגה במשך 30 שניות במלוא המהירות ולהשליך את הזרימה דרך.מניחים את העמוד לתוך צינור ריק חדש ולחמוק RNA bisulfite המרה לתוך 20 microliter של מים. שלוט ביעילות ההמרה של ביסולפיט על-ידי RT-qPCR ולאחר מכן המשך להכנה ולרצף של הספריה. לאחר ניתוח ביו-אינפורמטי, הנה דוגמה לתוצאות שאתה עשוי להשיג עם זרימת עבודה זו.כאן אנו משווים את epitranscriptome של תאים נגועים ב- HIV לעומת תאים שאינם נגועים. בשעה 24 שעות לאחר ההדבקה. בחלונית A, ניתן לראות את התוצאות שאנו משיגים בחקר האפיטראניום m6A.בגרף זה, אנו מתווים את קריאות מועשר m6A על ניתוח meRIP-Seq. אנחנו יכולים לראות יפה אצבע אבץ הוא hypermethylated 24 שעות לאחר זיהום. ביצענו את אותו סוג של ניתוח עבור חקירת epitranscriptome m5C בפאנל B.In גרף זה, כל ציטוסין ללא מתיל מוצג באדום, בעוד שיעור של ציטוסין כי כבר m5C מתילציה מוצג בכחול.כפי שאתה יכול לראות, PHLPP1, כל שלושת ציטוצינים כי הם היפר-מתילציה 24 שעות ביממה לאחר הידבקות ב- HIV. בסך הכל, זרימת עבודה זו מאפשרת לחקור הן את ה- M6A והן את האפיטרנום m5C של תאים נגועים וניתן ליישם אותה ככזו גם על חלקיקים ויראליים. הבנה של זיהום ויראלי מסוגלים לשנות את הנוף האפיטרנכתובי המארח ייתן לנו גישה לשכבה חדשה של רגולציה.חקירת תמלילים מתילניים דיפרנציאליים על זיהום ויראלי תספק כמובן משאב בעל ערך להתערבות טיפולית חדשה. בקישור כאן להלן תוכלו למצוא את משאב הגישה הפתוחה שלנו לחקירה של תמליל מתילן דיפרנציאלי על הידבקות ב- HIV לאורך זמן.

Research

JoVE Journal

Biology

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

ראיון: HIV-1-DNA כריתה Proviral שימוש recombinase התפתח

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

הפרוטוקולים של זיהום אוראלי של הזחלים Lepidopteran עם Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

היכרות עם תפקודים קוגניטיביים אצל תינוקות, ילדים &amp; מבוגרים עם ספקטרוסקופית אינפרא אדום הקרוב

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

אפיון מנגנוני ההתנגדות אוכלי עשב: Spittlebugs על Brachiaria Spp. כדוגמה

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

מדידת אוסמוטי המים החדירות מקדם (P<sub&gt; F</sub&gt;) של תאים כדוריים: Protoplasts צמח מבודד כדוגמה

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

טכניקת ההסתננות-צנטריפוגה להפקת Apoplastic נוזלים מצמח עלים שימוש<em&gt; Vulgaris Phaseolus</em&gt; כדוגמה

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfecting תאי RAW264.7 עם לוציפראז כתב ג&#39;ין

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

הערכת זמינות המינרלים בהזנות דגים בשיטות משלימות המודגמת עם הדוגמה של אבץ בסלמון אטלנטי

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

תא בודד מיקרו-שאיפה כאסטרטגיה חלופית מיון תאים פלואורסצנטית מופעל עבור הפרדה וירוס ענק תערובת

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

בידוד, שגשוג והתמיינות של תאי גזע שמקורם בשומן מקוק רזוס

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...