Name: exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv
Uploaded: 2022-03-05T13:00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero (sovvenzioni 31003A_166412 e 314730_188877).

<ol>
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A., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (215), (2013).</li><li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+5-methylcytosine+profiles+in+poly(A)+RNA+from+mouse+embryonic+stem+cells+and+brain.">Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain.</a> Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).</li><li>Endrullat, C., Gl&#246;kler, J., Franke, P., Frohme, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+and+quality+management+in+next-generation+sequencing.">Standardization and quality management in next-generation sequencing.</a> Applied &amp; Translational Genomics. 10, 2-9 (2016).</li><li>Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+cytosine+methylation+analysis+by+bisulfite+sequencing.">RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 12 (2009).</li><li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell.">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> biorxiv. 1 (11), (2021).</li><li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+noncoding+RNA.">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and noncoding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li><li>Aschenbrenner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+DNA+Polymerase+for+Direct+m(6)+A+Sequencing.">Engineering of a DNA Polymerase for Direct m(6) A Sequencing.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 57 (2), 417-421 (2018).</li><li>Didion, J. P., Martin, M., Collins, F. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il ruolo delle modificazioni dell'RNA nell'infezione virale è ancora in gran parte sconosciuto. Una migliore comprensione del ruolo delle modificazioni epitrascrittomiche nel contesto dell'infezione virale potrebbe contribuire alla ricerca di nuovi bersagli terapeutici antivirali.
In questo lavoro, forniamo un flusso di lavoro completo che consente di indagare gli epitrascrittomi m6A e m5C delle cellule infette. A seconda della domanda biologica, consigliamo di utilizzare l'RNA selezionato poli-A come materiale di partenza. Sebbene facoltativo, poiché la pipeline potrebbe essere utilizzata con l'RNA totale, è importante tenere presente che gli rRNA e i piccoli RNA sono altamente modificati e contengono un numero importante di residui metilati. Ciò potrebbe comportare una diminuzione della qualità e della quantità di dati di sequenziamento significativi.
Tuttavia, se il focus dello studio è l'RNA non poli-adenilato, la fase di estrazione dell'RNA dovrebbe essere adattata per evitare di scartare l'RNA piccolo (in caso di estrazione dell'RNA basata su colonna) e per privilegiare le tecniche di deplezione dei ribosomi piuttosto che la selezione poli-A per entrare nella pipeline.
Al fine di garantire RNA di alta qualità, corretta frammentazione e un'adeguata qualità di RNA arricchito con m6A e BS convertito per la preparazione della libreria, consigliamo vivamente di utilizzare un analizzatore di frammenti o un bioanalizzatore. Tuttavia, questa apparecchiatura non è sempre disponibile. In alternativa, la qualità dell'RNA, dell'mRNA e la dimensione dell'RNA frammentato potrebbero anche essere valutate mediante la visualizzazione su gel di agarosio. In alternativa, la preparazione della libreria può essere eseguita senza previa valutazione della quantità di RNA.
Abbiamo usato la tecnica MeRIP-Seq16 basata su anticorpi per esplorare il panorama epitrascrittomico m6A. Questa tecnica si basa sull'immunoprecipitazione dell'RNA e ha successo; tuttavia, alcuni passaggi richiedono un'attenta ottimizzazione e possono essere critici. Sebbene sia stato descritto che la metilazione m6A avviene principalmente all'interno della sequenza di consenso RRA*CH, questo motivo è molto frequente lungo le molecole di mRNA e non consente l'identificazione precisa del sito metilato. È quindi fondamentale ottenere una frammentazione dell'RNA riproducibile e coerente, generando piccoli frammenti di RNA, per migliorare la risoluzione basata su RIP. In questo protocollo, raccomandiamo una procedura ottimizzata, fornendo risultati riproducibili e coerenti nel nostro ambiente sperimentale; tuttavia, questo passaggio di frammentazione potrebbe richiedere un'ulteriore ottimizzazione in base a specifiche funzionalità di esempio.
Recentemente è stata descritta una nuova tecnica che consente il sequenziamento diretto m6A. Si basa sull'uso di specifiche varianti della trascrittasi inversa che presentano firme RT uniche come risposta all'incontro con la modifica dell'RNA m6A24. Questa tecnologia, dopo un'attenta ottimizzazione, potrebbe aggirare la principale limitazione affrontata da MeRIP-Seq (diminuendo la quantità di materiale iniziale e consentendo una risoluzione più elevata). Per esplorare la modifica m5C abbiamo deciso di utilizzare la tecnica di conversione del bisolfito al fine di rilevare a risoluzione nucleotidica i residui C modificati. Al fine di ridurre il tasso di falsi positivi dovuto alla presenza di strutture secondarie di RNA, abbiamo eseguito 3 cicli di conversione di denaturazione / bisolfito e ulteriormente controllato le prestazioni del tasso di conversione del bisolfito grazie all'uso di controlli spike-in ERCC. Una delle limitazioni legate a questa tecnica è che la conversione del bisolfito è molto dura e tre cicli di conversione di denaturazione/bisolfito potrebbero degradare parte dell'RNA e quindi ridurre la risoluzione. Tuttavia, nella nostra impostazione, abbiamo scelto di accontentarci di una risoluzione potenzialmente leggermente inferiore al fine di aumentare la qualità del set di dati.
Grazie a queste ottimizzazioni e controlli, siamo stati in grado di fornire un flusso di lavoro affidabile e solido che può essere sfruttato per indagare il panorama epitrascrittomico e la sua alterazione nel contesto di infezioni virali, interazioni ospite-patogeno o qualsiasi esposizione a trattamenti specifici.

È noto da tempo che le molecole di RNA possono essere modificate e fino ad oggi sono state descritte più di 150 modifiche post-trascrizionali1. Consistono nell'aggiunta di gruppi chimici, principalmente gruppi metilici, praticamente in qualsiasi posizione degli anelli pirimidina e purina delle molecole di RNA2. Tali modificazioni post-trascrizionali hanno già dimostrato di essere altamente arricchite nell'RNA di trasferimento (tRNA) e nell'RNA ribosomiale (rRNA) e sono state recentemente descritte anche su molecole di mRNA.
L'ascesa di nuove tecnologie, come il Next Generation Sequencing (NGS), e la produzione di anticorpi specifici che riconoscono determinate modificazioni chimiche hanno permesso, per la prima volta, di indagare la posizione e la frequenza di specifiche modificazioni chimiche a livello di trascrittoma. Questi progressi hanno portato ad una migliore comprensione delle modificazioni dell'RNA e alla mappatura di diverse modifiche sulle molecole di mRNA3,4.
Mentre l'epigenetica indaga il ruolo delle modifiche del DNA e degli istoni nella regolazione del trascrittoma, l'epitrascrittomica in modo simile si concentra sulle modifiche dell'RNA e sul loro ruolo. Lo studio delle modificazioni epitrascrittomiche offre nuove opportunità per evidenziare nuovi meccanismi di regolazione che possono sintonizzare una varietà di processi cellulari (ad esempio, splicing dell'RNA, esportazione, stabilità e traduzione)5. Non è stata quindi una grande sorpresa che studi recenti abbiano scoperto molte modifiche epitrascrittomiche sull'infezione virale negli RNA sia cellulari che virali6. I virus studiati finora includono sia virus a DNA che a RNA; tra questi, l'HIV può essere considerato un esempio pionieristico. Complessivamente, la scoperta della metilazione dell'RNA nel contesto delle infezioni virali può consentire lo studio di meccanismi ancora non descritti di espressione o replicazione virale, fornendo così nuovi strumenti e bersagli per controllarli7.
Nel campo dell'epitrascrittomica dell'HIV, le modifiche dei trascritti virali sono state ampiamente studiate e hanno dimostrato che la presenza di questa modifica era benefica per la replicazione virale8,9,10,11,12,13. Ad oggi varie tecniche possono essere utilizzate per rilevare segni epitrascrittomici a livello di trascrittoma. Le tecniche più utilizzate per l'identificazione di m6A si basano su tecniche di precipitazione immunitaria come MeRIP-Seq e miCLIP. Mentre MeRIP-Seq si basa sulla frammentazione dell'RNA per catturare frammenti contenenti residui metilati, miCLIP si basa sulla generazione di mutazioni specifiche della firma anticorpale α-m6A sulla reticolazione UV RNA-anticorpo, consentendo così una mappatura più precisa.
Il rilevamento della modifica di m5C può essere ottenuto sia con tecnologie basate su anticorpi simili al rilevamento di m6A (m5C RIP), sia con la conversione del bisolfito o con AZA-IP o con miCLIP. Sia Aza-IP che m5C miCLIP utilizzano una metiltransferasi specifica come esca per colpire l'RNA durante la metilazione dell'RNA. In Aza-IP, le cellule bersaglio sono esposte alla 5-azacitidina, con conseguente introduzione casuale di siti di 5-azacitidina analoga alla citidina nell'RNA nascente. In miCLIP, la NSun2 metiltransferasi è geneticamente modificata per ospitare la mutazione C271A14,15.
In questo lavoro, ci concentriamo sulla doppia caratterizzazione delle modifiche m6A e m5C nelle cellule infette, utilizzando l'HIV come modello. Dopo l'ottimizzazione metodologica, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro che combina l'immunoprecipitazione dell'RNA metilato (MeRIP) e la conversione del bisolfito dell'RNA (BS), consentendo l'esplorazione simultanea dei segni epitrascrittomici m6A e m5C a livello di trascrittoma, sia in contesti cellulari che virali. Questo flusso di lavoro può essere implementato su estratti di RNA cellulare e su RNA isolato da particelle virali.
L'approccio MeRIP)16 dell'RNA metilato immunoprecipitazione (MeRIP)16 che consente di studiare m6A a livello di trascrittoma è ben consolidato e una serie di anticorpi specifici per m6A sono disponibili in commercio fino ad oggi17. Questo metodo consiste nella cattura selettiva di pezzi di RNA contenenti m6A utilizzando un anticorpo specifico di m6A. I due principali svantaggi di questa tecnica sono (i) la risoluzione limitata, che dipende fortemente dalle dimensioni dei frammenti di RNA e quindi fornisce una posizione e una regione approssimate contenenti il residuo metilato, e (ii) la grande quantità di materiale necessaria per eseguire l'analisi. Nel seguente protocollo ottimizzato, abbiamo standardizzato la dimensione del frammento a circa 150 nt e ridotto la quantità di materiale di partenza da 10 μg di RNA poli-A-selezionato, che è attualmente la quantità consigliata di materiale di partenza, a solo 1 μg di RNA poli-A-selezionato. Abbiamo anche massimizzato l'efficienza di recupero dei frammenti di RNA m6A legati a anticorpi specifici utilizzando un approccio di eluizione mediante competizione con un peptide m6A invece di metodi di eluizione più convenzionali e meno specifici utilizzando tecniche a base di fenolo o proteinasi K. Il principale limite di questo test basato su RIP, tuttavia, rimane la risoluzione non ottimale che non consente l'identificazione del nucleotide A modificato preciso.
L'analisi del marchio m5C può essere attualmente eseguita utilizzando due diversi approcci: un metodo basato su RIP con anticorpi specifici per m5C e la conversione del bisolfito di RNA. Poiché il RIP offre solo una risoluzione limitata sull'identificazione del residuo metilato, abbiamo utilizzato la conversione del bisolfito che può offrire una risoluzione a singolo nucleotide. L'esposizione dell'RNA al bisolfito (BS) porta alla deaminazione della citosina, convertendo così il residuo di citosina in uracile. Così, durante la reazione di conversione del bisolfito dell'RNA, ogni citosina non metilata viene deaminata e convertita in uracile, mentre la presenza di un gruppo metilico in posizione 5 della citosina ha un effetto protettivo, prevenendo la deaminazione indotta da BS e preservando il residuo di citosina. L'approccio basato su BS consente il rilevamento di un nucleotide modificato m5C a risoluzione a base singola e la valutazione della frequenza di metilazione di ciascun trascritto, fornendo approfondimenti sulla dinamica di modifica di m5C18. Il limite principale di questa tecnica si basa tuttavia sul tasso di falsi positivi dei residui metilati. Infatti, la conversione BS è efficace sull'RNA a singolo filamento con residui di C accessibili. Tuttavia, la presenza di una struttura secondaria di RNA stretta potrebbe mascherare la posizione N5C e ostacolare la conversione BS, con conseguente residuo C non metilato che non viene convertito in residui U, e quindi falsi positivi. Per aggirare questo problema e ridurre al minimo il tasso di falsi positivi, abbiamo applicato 3 cicli di denaturazione e conversione del bisolfito19. Abbiamo inoltre introdotto 2 controlli nei campioni per consentire la stima dell'efficienza di conversione del bisolfito: abbiamo inserito controlli di sequenziamento ERCC (sequenze standardizzate non metilate e disponibili in commercio)20 e RNA impoveriti di poli-A per valutare il tasso di conversione del bisolfito da un lato e per verificare mediante RT-PCR la presenza di un sito metilato noto e ben conservato, C4447, sull'RNA ribosomiale 28S invece21.
Nel campo della virologia, l'accoppiamento di questi due metodi di indagine epitrascrittomica con il sequenziamento di nuova generazione e un'accurata analisi bioinformatica consente lo studio approfondito delle dinamiche m6A e m5C (cioè i cambiamenti temporali di modifica dell'RNA che potrebbero verificarsi in seguito all'infezione virale e potrebbero scoprire una serie di nuovi bersagli terapeuticamente rilevanti per uso clinico).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrime Pfx SuperMix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12344-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ RNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>EZR5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-472-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-471-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina TruSeq Stranded mRNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Beads A/G Blend</td>
			<td>Merck</td>
			<td>16-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-Methyladenosine, 5&#8242;-monophosphate sodium salt (m6A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2780-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse IgG</td>
			<td>Merk</td>
			<td>12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo(dT)25</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61005,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRapace</td>
			<td>Stratec</td>
			<td>1020220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick RNA Viral Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Fragmentation Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv

Il ruolo delle modificazioni dell'RNA nei processi biologici è stato al centro di un numero crescente di studi negli ultimi anni ed è oggi noto come epitrascrittomica. Tra gli altri, le modificazioni dell'RNA N6-metiladenosina (m6A) e 5-metilcitosina (m5C) sono state descritte su molecole di mRNA e possono avere un ruolo nella modulazione dei processi cellulari. L'epitrascrittomica è quindi un nuovo livello di regolazione che deve essere considerato in aggiunta alle analisi trascrittomiche, in quanto può anche essere alterato o modulato dall'esposizione a qualsiasi agente chimico o biologico, comprese le infezioni virali.
Qui, presentiamo un flusso di lavoro che consente l'analisi del paesaggio epitrascrittomico cellulare e virale congiunto dei segni m6A e m5C contemporaneamente, in cellule infette o meno con il virus dell'immunodeficienza umana (HIV). Dopo l'isolamento e la frammentazione dell'mRNA da cellule infette da HIV e non infette, abbiamo utilizzato due diverse procedure: MeRIP-Seq, una tecnica basata sull'immunoprecipitazione dell'RNA, per arricchire i frammenti di RNA contenenti il marchio m6A e BS-Seq, una tecnica basata sulla conversione del bisolfito, per identificare il marchio m5C a una singola risoluzione nucleotidica. Dopo l'acquisizione specifica per metilazione, le librerie di RNA vengono preparate per il sequenziamento ad alto rendimento. Abbiamo anche sviluppato una pipeline bioinformatica dedicata per identificare i trascritti differenzialmente metilati (DM) indipendentemente dal loro profilo di espressione basale.
Nel complesso, la metodologia consente l'esplorazione di più segni epitrascrittomici contemporaneamente e fornisce un atlante dei trascritti DM su infezione virale o qualsiasi altra perturbazione cellulare. Questo approccio offre nuove opportunità per identificare nuovi attori e nuovi meccanismi di risposta cellulare, come i fattori cellulari che promuovono o limitano la replicazione virale.

Questo flusso di lavoro si è dimostrato utile per studiare il ruolo della metilazione di m6A e m5C nel contesto dell'infezione da HIV. Per questo, abbiamo usato un modello di linea cellulare T CD4 + (SupT1) che abbiamo infettato con l'HIV o lasciato non trattato. Abbiamo iniziato il flusso di lavoro con 50 milioni di cellule per condizione e ottenuto una media di 500 μg di RNA totale con un numero di qualità dell'RNA di 10 (Figura 1A-B). Dopo la selezione poly-A abbiamo recuperato tra 10 e 12 μg di mRNA per condizione (che rappresenta circa il 2% dell'RNA totale) (Figura 1B). A questo punto, abbiamo utilizzato 5 μg di RNA poli-A-selezionato per la pipeline MeRIP-Seq e 1 μg per la pipeline BS-Seq. Poiché l'HIV RNA è poli-adenilato, non sono necessarie ulteriori azioni e le procedure MeRIP-Seq e BS-Seq possono essere applicate direttamente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig01.jpg"> Figura 1: Preparazione dell'RNA per applicazioni a valle. A) Flusso di lavoro raffigurante la preparazione e la distribuzione dell'RNA per pipeline simultanee MeRIP-Seq e BS-Seq. Ogni forma esagonale riempita rappresenta un tipo di modifica dell'RNA, come m6A (verde) o m5C (rosa). Sono indicate le quantità di materiale RNA necessarie per effettuare l'esperimento. B) Risultati rappresentativi che descrivono i profili di distribuzione dell'RNA attesi (dimensioni e quantità) all'estrazione totale dell'RNA (pannello superiore) e la selezione poly-A (pannello inferiore). I campioni sono stati caricati sull'analizzatore di frammenti con kit di sensibilità standard al fine di valutare la qualità dell'RNA prima di entrare in specifiche procedure MeRIP-Seq e BS-Seq. RQN: numero di qualità dell'RNA; nt: nucleotidi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La pipeline MeRIP-Seq è una tecnica basata sull'immunoprecipitazione dell'RNA che consente di studiare la modifica di m6A lungo le molecole di RNA. Per questo, l'RNA viene prima frammentato e poi incubato con anticorpi specifici di m6A accoppiati a perline magnetiche per immunoprecipitazione e cattura. I frammenti di RNA arricchiti con MeRIP e la frazione non toccata (input) vengono quindi sequenziati e confrontati per identificare le regioni di RNA modificate da m6A e quindi i trascritti metilati m6A (Figura 2A). La risoluzione della tecnica si basa sull'efficienza della frammentazione dell'RNA. Infatti, frammenti più corti consentono una localizzazione più precisa del residuo m6A. Qui, gli RNA poli-A-selezionati cellulari e gli RNA virali sono stati sottoposti a frammentazione basata su ioni con tampone di frammentazione dell'RNA durante 15 minuti in un volume finale di 20 μL per ottenere frammenti di RNA di 100-150 nt. Partendo da 5 μg di mRNA, abbiamo recuperato 4,5 μg di RNA frammentato, corrispondenti a un tasso di recupero del 90% (Figura 2B). Abbiamo usato 100 ng di RNA frammentato e purificato come controllo di input, sottoposto direttamente alla preparazione e al sequenziamento della libreria. L'RNA rimanente (~4,4 μg) è stato elaborato secondo la pipeline MeRIP-Seq, che inizia con l'incubazione di RNA frammentato con perline legate ad anticorpi specifici anti-m6A o ad anticorpi anti-IgG come controllo. Il RIP specifico per m6A (MeRIP) di 2,5 μg di RNA frammentato ha permesso di recuperare circa 15 ng di materiale arricchito con m6A sottoposto a preparazione e sequenziamento della libreria (Figura 2B). Il RIP con controllo anti-IgG, come previsto, non ha prodotto abbastanza RNA per consentire ulteriori analisi (Figura 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig02.jpg"> Figura 2: Pipeline MeRIP-Seq. A) Rappresentazione schematica del flusso di lavoro MeRIP-Seq e del controllo dell'input. Dopo la selezione poly-A, i campioni sono stati frammentati in pezzi da 120-150 nt e, direttamente sottoposti a sequenziamento (100 ng, controllo di ingresso), o utilizzati per l'immunoprecipitazione dell'RNA (2,5 μg, RIP) con anticorpo specifico anti-m6A o anticorpo anti-IgG come controllo negativo prima del sequenziamento. B) Risultati rappresentativi che mostrano i profili di distribuzione dell'RNA attesi (dimensioni e quantità) alla frammentazione (pannello superiore) e RIP (pannelli inferiori, MeRIP: sinistra, controllo IgG: destra). I campioni sono stati caricati sull'analizzatore di frammenti per valutare la qualità e la concentrazione dell'RNA prima di un'ulteriore elaborazione per la preparazione e il sequenziamento della libreria. L'analisi dell'RNA frammentato è stata eseguita utilizzando il kit di sensibilità standard dell'RNA mentre l'RNA immunoprecipitato ha utilizzato il kit ad alta sensibilità. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La pipeline BS-Seq consente l'esplorazione della modifica dell'RNA m5C alla risoluzione nucleotidica e porta all'identificazione di trascritti m5C-metilati. Dopo la conversione del bisolfito, le citosine non metilate vengono convertite in uracile, mentre le citosine metilate rimangono invariate (Figura 3A). A causa delle dure condizioni della procedura di conversione del bisolfito (cioè alta temperatura e basso pH), gli mRNA convertiti sono altamente degradati (Figura 3B), tuttavia ciò non interferisce con la preparazione e il sequenziamento della libreria. La conversione del bisolfito è efficiente solo sull'RNA a singolo filamento e può quindi essere potenzialmente ostacolata da strutture secondarie di RNA a doppio filamento. Per valutare l'efficienza della conversione C-U abbiamo introdotto due controlli. Come controllo positivo, abbiamo sfruttato la presenza precedentemente descritta di una citosina altamente metilata in posizione C4447 dell'rRNA 28S23. Dopo l'amplificazione RT-PCR e il sequenziamento di un frammento di 200 bp che circonda il sito metilato abbiamo potuto osservare che tutte le citosine sono state convertite con successo in uracili, apparendo così come timidine nella sequenza del DNA, ad eccezione della citosina in posizione 4447 che è rimasta invariata. Come controllo per il tasso di conversione del bisolfito, abbiamo utilizzato sequenze di RNA ERCC sintetico disponibili in commercio. Questa miscela consiste in un pool di sequenze di RNA note, non metilate e poli-adenilate, con una varietà di strutture e lunghezze secondarie. Dopo la preparazione e il sequenziamento della libreria, ci siamo concentrati su queste sequenze ERCC per calcolare il tasso di conversione, che può essere eseguito contando il numero di C convertiti tra i residui C totali in tutte le sequenze ERCC e in ciascun campione. Abbiamo ottenuto un tasso di conversione del 99,5%, confermando l'efficienza e il successo della reazione di conversione del bisolfito (Figura 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig03.jpg"> Figura 3: Pipeline BS-Seq. A) Rappresentazione schematica del flusso di lavoro BS-Seq. Dopo la selezione del poli-A, i campioni vengono esposti al bisolfito, con conseguente conversione da C a U (a causa della deaminazione) per i residui C non metilati. Al contrario, i residui C metilati (m5C) non sono influenzati dal trattamento con bisolfito e rimangono invariati. B) Risultato rappresentativo del profilo di distribuzione dell'RNA convertito in bisolfito (dimensioni e quantità) dopo l'analisi su analizzatore di frammenti con un kit di sensibilità standard. C) Elettroferogramma che mostra il risultato rappresentativo del sequenziamento dell'amplicone RT-PCR della regione che circonda il C metilato al 100% in posizione 4447 in rRNA 28S (evidenziato in blu). Al contrario, i residui C della sequenza di riferimento sono stati identificati come residui T nella sequenza amplicon a causa del successo della conversione del bisolfito. D) Valutazione del tasso di conversione C-U mediante analisi di sequenze di spike-in ERCC in cellule infette da HIV e non infette. Il tasso di conversione medio è del 99,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
I campioni arricchiti con M6A, i campioni convertiti in bisolfito e i controlli di input vengono ulteriormente elaborati per la preparazione della libreria, il sequenziamento e l'analisi bioinformatica (Figura 4). In base al disegno sperimentale e alle domande biologiche affrontate, possono essere applicate più analisi bioinformatiche. Come prova di principio qui, mostriamo risultati rappresentativi da una potenziale applicazione (cioè l'analisi di metilazione differenziale), che si concentra sull'identificazione di trascrizioni differenzialmente metilate indotte dall'infezione da HIV. In breve, abbiamo studiato il livello di metilazione m6A o m5C dei trascritti, indipendentemente dal loro livello di espressione genica, sia in cellule non infette che infette da HIV, al fine di comprendere ulteriormente il ruolo delle metilazioni dell'RNA durante il ciclo di vita virale. Dopo la normalizzazione dell'espressione genica, abbiamo identificato che il trascritto ZNF469 era differenzialmente m6A-metilato in base allo stato dell'infezione, infatti questo trascritto non era metilato nelle cellule non infette mentre mostrava diversi picchi metilati sull'infezione da HIV (Figura 5A). Un'analisi di metilazione differenziale simile su m5C ha rivelato che il trascritto PHLPP1 conteneva diversi residui metilati, che tendono ad essere più frequentemente metilati nella condizione di HIV (Figura 5B). In questo contesto, entrambe le analisi suggeriscono che l'infezione da HIV influisce sull'epitrastoma cellulare.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig04.jpg"> Figura 4: Rappresentazione schematica del flusso di lavoro bioinformatico per l'analisi dei dati m6A e m5C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig05.jpg"> Figura 5: Esempio di trascrizioni differenzialmente metilate in caso di infezione. A) Risultato rappresentativo che mostra la metilazione m6A del trascritto ZNF459 in cellule infette da HIV (verdi) e non infette (grigie). L'intensità di picco (alla sottrazione dell'espressione di input) è mostrata sull'asse y e sulla posizione nel cromosoma lungo l'asse x. L'analisi di metilazione differenziale rivela che il trascritto ZFN469 è ipermetilato dopo l'infezione da HIV. B) Risultato rappresentativo del gene metilato m5C in cellule infette da HIV (corsia superiore) e non infette (corsia inferiore). L'altezza di ogni barra rappresenta il numero di letture per nucleotide e consente la valutazione della copertura. Ogni residuo C è rappresentato in rosso e la proporzione di C metilato è rappresentata in blu. L'esatto tasso di metilazione (%) è riportato al di sopra di ciascun residuo C. Le frecce evidenziano C. I campioni sono stati visualizzati utilizzando il visualizzatore IGV statisticamente significativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Il ruolo delle modificazioni dell'RNA nelle infezioni virali sta appena iniziando ad essere esplorato e potrebbe evidenziare nuovi meccanismi di interazione virale-ospite. In questo lavoro, forniamo una pipeline per studiare le modifiche dell'RNA m6A e m5C nel contesto delle infezioni virali.

Esplorare gli epitrascrittomi m6A e m5C sull'infezione virale: un esempio di HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

Ciao, in questo video ti mostreremo come esplorare gli epitrascrittomi m6A e m5C sull'infezione virale. Per iniziare l'esperimento, avrai bisogno di 50 milioni di cellule per i non infetti e 50 milioni per la condizione infetta. Per ottenere un set di dati di alta qualità al momento dell'analisi, è necessario ottenere un'infezione universale.Qui infettiamo queste cellule con un vettore basato sull'HIV e misuriamo la GFP codificata viralmente da FACS. In questo caso, abbiamo avuto l'80% delle cellule infette e abbiamo proceduto con il flusso di lavoro iniziando con l'estrazione totale dell'RNA. Quindi abbiamo diviso le cellule in aliquote di 10 milioni ciascuna e le abbiamo lisate in 1 ml di Trizol.Abbiamo quindi aggiunto 200 microlitro di cloroformio al lisato cellulare e miscelato per inversione. A questo punto, lasciamo riposare il lisato per tre minuti a temperatura ambiente e poi centrifughiamo tutti i campioni ad alta velocità per 15 minuti a quattro gradi. Ti aspetteresti di vedere una separazione di fase in tre diverse fasi, come mostrato qui.L'RNA è seduto nella fase superiore, quindi trasferisci con cura la fase acquosa in un tubo fresco prestando attenzione a non trasferire lo strato organico. A questo punto, aggiungere 0,5 ml di isopropanolo alla fase acquosa e mescolare accuratamente per inversione. I campioni possono quindi essere incubati un'ora a 80 gradi per garantire la precipitazione dell'RNA.Dopo la centrifugazione ad alta velocità, dovresti essere in grado di vedere un bel pellet di RNA come mostrato qui. Scartare con attenzione il surnatante per inversione o per pipettaggio, prestando attenzione a non interrompere il pellet. Quindi lavare il pellet di RNA con un mL di etanolo di grado molecolare al 75%.E vortice il campione brevemente. Dopo la centrifugazione, assicurati di recuperare un bel pellet di RNA bianco. Scartare il surnatante e lasciare asciugare il pellet di RNA per 15 minuti a temperatura ambiente.Risospesare ogni pellet in 20 microlitri d'acqua e raggruppare tutti i campioni della stessa condizione insieme. L'RNA totale è ora pronto per l'isolamento dell'mRNA mediante selezione poly-A. Per ogni campione di 75 microgrammi di RNA, preparare 200 microlitri di perle magnetiche oligo-DT e lavarle in un mL di tampone legante.Posizionare il tubo su un supporto magnetico e lasciare che le perline si leghino al magnete durante una miscela. Scartare il surnatante e ripetere la procedura per un secondo lavaggio. Quindi rimuovere le perline dai supporti magnetici e risospenderle con cura in 100 microlitro di tampone legante.A questo punto, preparare il campione di RNA dividendoli in 75 microgrammi di RNA per aliquota risospesa in 100 microlitro di acqua. Aggiungere 100 microlitro di tampone legante e incubare per due minuti a 65 gradi. Quindi girare verso il basso i campioni e incubare sul ghiaccio.Aggiungere quindi 100 microlitro di perline magnetiche lavate a ciascun campione di RNA e lasciare legare su una ruota rotante per 15 minuti a temperatura ambiente. Al momento dell'incubazione, riposizionare il tubo in un rack magnetico e lasciarli incubare per un minuto. Quindi recuperare il surnatante in un tubo fresco e tenerlo da parte per un secondo ciclo di isolamento.Lavare le perline due volte con 200 microlitri di tampone di lavaggio e quindi procedere all'eluizione. Per eluire l'RNA selezionato poli-A dalle perle magnetiche, aggiungere con attenzione 20 microlitro di TRIS HCl ghiacciato a ciascun campione e pipetta. Quindi incubare i campioni a 80 gradi per due minuti per rilasciare l'RNA dalle perline.Trasferire il surnatante contenente RNA selezionato poli-A in un tubo fresco, facendo attenzione ad evitare il riporto di perline. La fase di eluizione e la fase di isolamento devono essere ripetute due volte per aumentare la resa dell'mRNA. L'mRNA è ora pronto per entrare nella pipeline meRIP-Seq nella fase di frammentazione o per passare direttamente alla conversione del bisolfito.Il primo passo per entrare nella pipeline meRIP-Seq consiste nella frammentazione dell'mRNA. Per questo, sono necessari cinque microgrammi di mRNA divisi in aliquote di 18 microlitri in tubi da 0,2 ml. Al fine di garantire dati coerenti, è fondamentale lavorare rapidamente e con solo pochi campioni al momento.Per questo esperimento, la frammentazione è stata ottimizzata al fine di ottenere frammenti di dimensioni comprese tra 115 e 200 nucleotidi. Quindi aggiungere due microlitri di reagente di frammentazione a ciascun tubo contenente 18 microlitri di mRNA facendo attenzione a depositare la goccia sulla parete del tubo. Ruotare tutti i campioni per consentire il contatto tra il reagente e l'RNA allo stesso tempo e incubare a 70 gradi per 15 minuti.Una volta terminata l'incubazione, interrompere la reazione aggiungendo due microlitri di 0,5 M EDTA. A questo punto, è possibile purificare l'mRNA frammentato con il metodo scelto e procedere a un controllo di qualità dell'RNA tramite analizzatore di frammenti. Questo passaggio è facoltativo, ma consentirà di valutare la dimensione del frammento prima di coinvolgere la precipitazione dell'RNA.Come potete vedere qui nella quarta corsia, otteniamo per entrambi i nostri frammenti campione di circa 150 nucleotidi ciascuno. Abbiamo quindi proceduto con meRIP-Seq. Il primo passo consiste nella coppia di perline magnetiche A / G con anticorpi anti-m6A o controlli IgG.Per ogni piano di reazione, trasferire 25 microlitri di perline magnetiche in un tubo fresco. Si prega di notare che è necessaria almeno una condizione specifica per m6A e una condizione di controllo. Lavare ogni 25 microlitro di perline con 250 microlitri di buffer IP.Risospesciare delicatamente le perline tubando su e giù e posizionare il tubo sul rack magnetico per un minuto per consentire la separazione delle perline. Rimuovere e scartare il surnatante, facendo attenzione a non aspirare le perle magnetiche e ripetere la fase di lavaggio una volta. Quindi risospendere le perle magnetiche in 100 microlitro di buffer IP per ogni 25 microlitro di volume originale di perline.Preparare ed etichettare un tubo per ogni condizione. Nel nostro caso, avremo due tubi per la condizione infetta, uno per m6A e uno per il controllo IgG e due tubi per la condizione non infetta. Quindi aggiungere 100 microlitro di perline lavate in ciascun tubo.Le perline sono ora pronte per essere accoppiate con anticorpi specifici o controlli IgG. Aggiungere cinque microgrammi di anticorpo specifico anti-m6A o anticorpo anti-IgG a ciascun tubo contenente 100 microlitro di perline magnetiche lavate. Consentire la coniugazione anticorpo-perline incubando il tubo per 30 minuti su una ruota rotante.Nel frattempo, procedere con la preparazione del campione. Per ogni condizione pianificata, specifica per m6A o controllo IgG, il materiale di partenza sarà di 2,5 microgrammi di mRNA frammentato 100 microlitri di acqua. Per avere un volume di reazione finale di 500 microlitro, aggiungere 295 microlitri di acqua a ciascun campione.Aggiungere quindi cinque microlitri di inibitore della RNAasi concentrati a 40 unità per microlitro per una quantità totale di 200 unità per campione e mescolare delicatamente. Infine aggiungere 100 microlitro di buffer IP concentrato 5X a ciascun tubo. I campioni sono ora pronti per la reazione di precipitazione immunitaria.Recupera le perle magnetiche accoppiate con gli anticorpi dalla ruota rotante e spinale verso il basso. Aggiungere quindi 500 microlitro dei campioni precedentemente preparati a ciascun 100 microlitro di perline accoppiati con gli anticorpi specifici. Mescolare delicatamente pipettando su e giù più volte per risospese completamente le perline.Incubarli o la tua reazione meRIP su una ruota rotante a quattro gradi durante due ore. Una volta terminata l'incubazione, ruotare verso il basso ogni tubo e posizionarli su un rack magnetico per un minuto per consentire la separazione delle perline. Quindi rimuovere la frazione non legata e posizionarla su un tubo fresco e conservarla per ulteriori analisi, se necessario.Rimuovere il magnete dal rack e risospescere tutti i campioni in 500 microlitri di buffer IP. Risospendare accuratamente ogni campione pipettando su e giù. Inserire il magnete sul rack, incubare per un minuto, quindi rimuovere con cura il surnatante.Ripetere il lavaggio due volte, quindi procedere con l'eluizione. Per ogni coppia di campioni, specifici m6A e di controllo, preparare 225 microlitri di tampone di eluizione contenente 20 millimolari di m6A purificato. Quindi aggiungere 100 microlitro di tampone di eluizione per campione.Incubare tutti i campioni un'ora a quattro gradi su un bilanciere. Quindi raccogliere tutto il campione di RNA arricchito con m6A in un tubo fresco e procedere con un secondo ciclo di eluizione. Purifica l'RNA arricchito con m6A con il tuo metodo di scelta E poi a questo punto i campioni sono pronti per la preparazione e il sequenziamento della libreria.Per indagare sulla modifica m5C, utilizziamo la conversione del bisolfito. Inizia l'esperimento con 500 nanogrammi di RNA poli-adenilato. Sebbene facoltativo, l'aggiunta al campione di 500 picogrammi di RNA impoverito di poli-A per garantire la rappresentazione ribosomiale e 0,5 microlitro di sequenza sintetica disponibile in commercio consentirà di valutare il tasso di conversione del bisolfito al momento del sequenziamento.Regolare il campione su un volume finale di 20 microlitri in acqua, quindi aggiungere 130 microlitro di reagente di conversione dell'RNA a ciascun campione. Mescolare con cura pipettando su e giù e far girare tutto il campione per assicurarsi che non rimangano goccioline sul lato dei tubi. Incubare tutto il campione in una macchina PCR per tre cicli di denaturazione a 70 gradi per cinque minuti e conversione del bisolfito a 54 gradi per 45 minuti.Eseguire la deaminazione in colonna aggiungendo direttamente su una colonna vuota, 250 microlitri di buffer di legame dell'RNA, 150 microlitro del campione convertito di bisolfito. Mescolare il campione tubando su e giù, ma prestando attenzione a non toccare i filtri a colonna. Aggiungere 400 microlitri di etanolo al 95-100% alla miscela tampone legante l'RNA del campione direttamente nella colonna.Chiudere il tappo e mescolare immediatamente per inversione. Girare verso il basso il campione per 30 secondi ed eliminare il flusso. Lavare la colonna con tampone di lavaggio e quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione di desolfonazione al centro di ogni colonna.Incubare tutto il campione per 30 minuti a temperatura ambiente. Girare verso il basso il campione per 30 secondi e poi procedere con due cicli di lavaggio. Aggiungere 400 microlitri di tampone di lavaggio a ciascun campione, centrifugare per 30 secondi a piena velocità ed eliminare il flusso attraverso.Posizionare la colonna in un nuovo tubo vuoto ed eluire l'RNA convertito in bisolfito in 20 microlitri di acqua. Controllare l'efficienza di conversione del bisolfito mediante RT-qPCR e quindi procedere alla preparazione e al sequenziamento della libreria. Dopo l'analisi bioinformatica, ecco alcuni esempi di risultati che è possibile ottenere con questo flusso di lavoro.Qui confrontiamo l'epitrascrittoma delle cellule infette da HIV rispetto alle cellule non infette. a 24 ore dopo l'infezione. Nel pannello A, puoi vedere i risultati che otteniamo esplorando l'epitrastoma m6A.In questo grafico, tracciamo le letture arricchite m6A sull'analisi meRIP-Seq. Possiamo vedere bene che un dito di zinco è ipermetilato 24 ore dopo l'infezione. Abbiamo eseguito lo stesso tipo di analisi per l'indagine sull'epitrastoma m5C nel pannello B.In questo grafico, ogni citosina non metilata viene visualizzata in rosso, mentre la proporzione di citosina che è stata metilata m5C è mostrata in blu.Come puoi vedere, PHLPP1, tutte e tre le citosine che sono iper-metilate 24 ore dopo l'infezione da HIV. Nel complesso, questo flusso di lavoro consente di indagare sia l'epitrastoma M6A che m5C delle cellule infette e può essere applicato come tale anche su particelle virali. La comprensione dell'infezione virale è in grado di modificare il panorama epitrascrittomico dell'ospite ci darà accesso a un nuovo livello di regolazione.Lo studio dei trascritti metilati differenziali sull'infezione virale fornirà naturalmente una risorsa preziosa per un nuovo intervento terapeutico. Al link qui sotto puoi trovare la nostra risorsa ad accesso aperto per l'indagine della trascrizione metilata differenziale sull'infezione da HIV nel tempo.

Research

JoVE Journal

Biology

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

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Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Valutazione della disponibilità di minerali nei mangimi per pesci utilizzando metodi complementari dimostrati con l'esempio di zinco nel salmone atlantico

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Micro-aspirazione a cella singola come strategia alternativa per lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per la separazione delle miscele di virus giganti

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Isolamento, proliferazione e differenziamento di cellule staminali derivate dall'adiposio del macaco rhesus

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...