Name: exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv
Uploaded: 2022-03-05T13:00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

この研究は、スイス国立科学財団(助成金31003A_166412と314730_188877)によって支援されました。

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+Addition+of+m(5)C+to+HIV-1+Transcripts+Regulates+Viral+Gene+Expression.">Epitranscriptomic Addition of m(5)C to HIV-1 Transcripts Regulates Viral Gene Expression.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).</li><li>Kennedy, E. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+target+profiling+of+RNA+cytosine+methyltransferases+using+the+mechanism-based+enrichment+procedure+Aza-IP.">Transcriptome-wide target profiling of RNA cytosine methyltransferases using the mechanism-based enrichment procedure Aza-IP.</a> Nature Protocols. 9 (2), 337-361 (2014).</li><li>Hussain, S., Aleksic, J., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (11), 215 (2013).</li><li>Dominissini, D., Moshitch-Moshkovitz, S., Salmon-Divon, M., Amariglio, N., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+mapping+of+N6-methyladenosine+by+m6A-seq+based+on+immunocapturing+and+massively+parallel+sequencing.">Transcriptome-wide mapping of N6-methyladenosine by m6A-seq based on immunocapturing and massively parallel sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (1), 176-189 (2013).</li><li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq.">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li><li>Shobbir Hussain, J. A., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (215), (2013).</li><li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+5-methylcytosine+profiles+in+poly(A)+RNA+from+mouse+embryonic+stem+cells+and+brain.">Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain.</a> Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).</li><li>Endrullat, C., Gl&#246;kler, J., Franke, P., Frohme, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+and+quality+management+in+next-generation+sequencing.">Standardization and quality management in next-generation sequencing.</a> Applied &amp; Translational Genomics. 10, 2-9 (2016).</li><li>Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+cytosine+methylation+analysis+by+bisulfite+sequencing.">RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 12 (2009).</li><li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell.">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> biorxiv. 1 (11), (2021).</li><li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+noncoding+RNA.">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and noncoding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li><li>Aschenbrenner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+DNA+Polymerase+for+Direct+m(6)+A+Sequencing.">Engineering of a DNA Polymerase for Direct m(6) A Sequencing.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 57 (2), 417-421 (2018).</li><li>Didion, J. P., Martin, M., Collins, F. 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著者らは開示するものは何もない。

ウイルス感染におけるRNA修飾の役割は、まだほとんど知られていない。ウイルス感染の文脈におけるエピトランストランスクリプト修飾の役割をよりよく理解することは、新しい抗ウイルス治療標的の探求に寄与する可能性がある。
この研究では、感染細胞のm6Aおよびm5Cエピトランスクリプションの調査を可能にする完全なワークフローを提供する。生物学的な問題に応じて、ポリA選択RNAを出発物質として使用することをお勧めします。パイプラインは全RNAと併用できますが、rRNAと小さなRNAは高度に修飾されており、重要な数のメチル化残基が含まれていることを覚えておいてください。これにより、意味のあるシーケンス データの質と量が減少する可能性があります。
しかし、研究の焦点が非ポリアデニル化RNAである場合、RNA抽出ステップは、小さなRNA(カラムベースのRNA抽出の場合)を廃棄することを避け、パイプラインに入るためのポリボソーム枯渇技術ではなく特権リボソーム枯渇技術に適応する必要があります。
高品質のRNA、正しい断片化、適切なm6A濃縮およびBS変換されたRNA品質をライブラリ調製に確実に行うために、フラグメントアナライザまたはバイオアナライザを使用することを強くお勧めします。ただし、この装置は常に使用できるとは限りません。別の方法として、RNAの品質、mRNAおよび断片化されたRNAのサイズはまたアガロースゲルの視覚化によって評価することができる。あるいは、ライブラリーの調製は、RNA量の以前の評価なしで行うことができる。
抗体ベースのMeRIP-Seq16技術を用いて、m6Aエピトランスクリプトの風景を探索しました。この技術はRNA免疫沈降に基づいており、成功しています。ただし、一部の手順では、慎重な最適化が必要であり、重要な場合があります。m6Aメチル化は、主にコンセンサス配列RRA*CH内で起こることが説明されているが、このモチーフはmRNA分子に沿って非常に頻繁に起こるものであり、メチル化部位の正確な同定を可能にしない。したがって、RIPベースの分解能を向上させるためには、再現性と一貫性のあるRNA断片化を達成し、小さなRNA断片を生成することが重要です。このプロトコルでは、実験環境で再現可能で一貫性のある結果を提供する最適化された手順をお勧めします。ただし、この断片化の手順では、特定のサンプル機能に応じて、さらに最適化が必要になる場合があります。
近年、m6A直接シーケンシングを可能にする新しい技術が説明された。m6A RNA修飾24に遭遇した応答としてユニークなRTシグネチャを示す特異的な逆転写酵素変異体の使用に基づいています。この技術は、慎重な最適化の際に、MeRIP-Seqに直面する大きな制限を回避する可能性があります(初期材料の量を減らすと、より高い解像度を可能にします)。m5C修飾を探索するために、修飾されたC残基をヌクレオチド分解能で検出するためにバイサルファイト変換技術を使用することにしました。RNA二次構造の存在による偽陽性率を低減するために、ERCCスパイクインコントロールの使用により、変性/亜硫酸水素変換の3サイクルを行い、バイサルファイト変換速度のパフォーマンスをさらに制御しました。この技術に関連する制限の1つは、亜硫酸水素変換が非常に過酷であり、変性/亜硫酸水素塩変換の3サイクルがRNAを分解し、したがって分解能を低下させる可能性があることです。しかし、この設定では、データセットの品質を向上させるために、わずかに低い解像度に落ち着くことを選択しました。
これらの最適化と制御のおかげで、ウイルス感染、宿主病原体相互作用、または特定の治療への暴露の文脈におけるエピトランストランスクリプトの風景とその変化を調査するために利用できる信頼性の高い健全なワークフローを提供することができました。

RNA分子が改変できることは長い間知られており、150以上の転写後修飾がこれまでに1に記載されている。これらは、主にメチル基である化学基を、RNA分子のピリミジンおよびプリン環の実質的に任意の位置に添加する2を含む。このような転写後修飾は、伝達RNA(tRNA)およびリボソームRNA(rRNA)において高度に富化することが既に示されており、最近ではmRNA分子にも説明されている。
次世代シーケンシング(NGS)などの新技術の台頭と、明確な化学修飾を認識する特定の抗体の産生は、トランスクリプトーム全体のレベルでの特定の化学修飾の場所と頻度の調査を初めて可能にしました。これらの進歩はRNA修飾のよりよい理解とmRNA分子3,4上のいくつかの修飾のマッピングにつながっている。
エピジェネティクスは、トランスクリプトーム調節におけるDNAの役割とヒストン修飾を調査する一方で、同様の方法でエピトランストランスクリプト法はRNA修飾とその役割に焦点を当てています。エピトランスクリプト法修飾の調査は、様々な細胞プロセス(RNAスプライシング、エクスポート、安定性および翻訳)を調整する新しい調節機構を強調する新しい機会を提供する。したがって、最近の研究では、細胞およびウイルスの両方のRNA6におけるウイルス感染時に多くのエピトランストランスプトミック修飾が明らかになったことは大きな驚きではなかった。これまでに調査されたウイルスには、DNA ウイルスと RNA ウイルスの両方が含まれます。その中でも、HIVは先駆的な例と考えることができます。全体として、ウイルス感染の文脈におけるRNAメチル化の発見は、ウイルス発現または複製の未記述的なメカニズムの調査を可能にし、したがってそれらを制御するための新しいツールおよび標的を提供するかもしれない7。
HIVエピトランスクリプノミクスの分野では、ウイルス転写物の改変が広く検討されており、この改変の存在がウイルス複製に有益であった8,9,10,11,12,13であることが示されている。現在までに様々な技術を用いて、トランスクリプトームワイドレベルでエピトランスクリプソメマークを検出することができる。m6A同定に最も使用される技術は、MeRIP-SeqやmiCLIPなどの免疫沈殿技術に依存しています。MeRIP-Seqは、メチル化残基を含む断片を捕捉するためにRNA断片化に依存していますが、miCLIPはRNA抗体UV架橋時のα-m6A抗体特異的シグネチャ突然変異の生成に基づいており、より正確なマッピングを可能にします。
m5C修飾の検出は、m6A検出(m5C RIP)に類似した抗体ベースの技術、バイサルファイト変換、AZA-IPまたはmiCLIPによって達成できます。アザIPとm5C miCLIPの両方がRNAメチル化を経ながらRNAを標的とする餌として特異的なメチルトランスファー酵素を使用します。Aza-IPでは、標的細胞が5-アザシチジンにさらされ、その結果、シチジンアナログ5-アザシチジン部位が新生RNAにランダムに導入される。miCLIPでは、NSun2メチルトランスファー酵素が遺伝子組み換えされ、C271A突然変異14,15を収容する。
本研究では、HIVをモデルとして、感染細胞におけるm6Aとm5C修飾の二重特性化に焦点を当てます。方法論的最適化では、メチル化RNA免疫沈降(MeRIP)とRNAバイサルファイト変換(BS)を組み合わせたワークフローを開発し、細胞およびウイルスの両方のコンテキストで、トランストランスクリプトーム全体のレベルでm6Aとm5Cエピトランスクリプトマークを同時に探査することを可能にしました。このワークフローは、細胞RNA抽出物と、ウイルス粒子から単離されたRNA上で実装することができます。
メチル化RNA免疫沈降(MeRIP)16アプローチにより、転写体全体のレベルでm6Aの調査が十分に確立されており、m6A特異的抗体の配列が、現在までに市販されています。この方法は、m6A特異的抗体を用いたm6A含有RNA片の選択的捕捉に含まれる。この技術の2つの大きな欠点は、(i)RNA断片のサイズに大きく依存し、メチル化残基を含む近似位置および領域を提供する限られた分解能であり、(ii)分析を行うために必要な大量の材料を提供する。以下の最適化されたプロトコルでは、フラグメントサイズを約150ntに標準化し、出発物質の量を、現在推奨される出発物質量であるポリ-A選択RNAの10μgから、ポリA選択RNAのわずか1μgに減らしました。また、フェノールベースの技術やプロテナーゼKを用いた従来の非特異的溶出法の代わりにm6Aペプチドを用いた溶出法を用いて、特定の抗体に結合したm6A RNA断片の回収効率を最大化しました。しかしながら、このRIPベースアッセイの主な制限は、正確な修飾されたAヌクレオチドの同定を可能にしない最適ではない分解能のままである。
m5Cマークの解析は、m5C特異的抗体を用いたRIPベースの方法とRNAバイサルファイト変換の2つの異なるアプローチを使用して現在行うことができます。RIPはメチル化残基の同定に関する解像度が限られているため、一塩基分解能を提供できる亜硫酸水素変換を用いた。バイサルファイト(BS)へのRNA曝露は、シトシン脱アミノ化をもたらし、それによってシトシン残基をウラシルに変換する。したがって、RNAバイサルファイト変換反応の間、すべての非メチル化シトシンは脱アミン化され、ウラシルに変換され、シトシンの位置5にメチル基が存在すると保護効果を有し、BS誘導脱アミノ化を防止し、シトシン残基を保存する。BSベースのアプローチは、単一塩基分解能でm5C修飾ヌクレオチドの検出と、各転写物のメチル化頻度の評価を可能にし、m5C修飾ダイナミクス18に関する洞察を提供します。しかし、この技術の主な制限は、メチル化残基の偽陽性率に依存する。確かに、BS変換は、アクセス可能なC残基を有する一本鎖RNAに有効である。しかし、緊密なRNA二次構造の存在は、N5C位置をマスクし、BS変換を妨げ、U残基に変換されない非メチル化C残基、したがって偽陽性をもたらす可能性があります。この問題を回避し、偽陽性率を最小限に抑えるために、3ラウンドの変性と亜硫酸水素変換サイクル19を適用しました。また、サンプルに2つのコントロールを導入して、バイサルファイト変換効率の推定を可能にしました:ERCCシーケンシングコントロール(非メチル化標準化および市販シーケンス)20とポリA枯渇RNAをスパイクインして、一方でバイサルファイト変換率を評価し、RT-PCRによって既知でよく保存されたメチル化部位の存在を確認します。 28SリボソームRNAに対して他方の21.
ウイルス学の分野では、これら2つのエピトランスクリプト法と次世代シーケンシングと正確なバイオインフォマティクス分析を組み合させることで、m6Aおよびm5Cダイナミクスの詳細な研究が可能になります(すなわち、ウイルス感染時に起こり得るRNA改変一時的な変化は、臨床使用に対する新しい治療関連の標的の配列を明らかにすることができる)。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrime Pfx SuperMix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12344-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ RNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>EZR5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-472-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-471-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina TruSeq Stranded mRNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Beads A/G Blend</td>
			<td>Merck</td>
			<td>16-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-Methyladenosine, 5&#8242;-monophosphate sodium salt (m6A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2780-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse IgG</td>
			<td>Merk</td>
			<td>12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo(dT)25</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61005,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRapace</td>
			<td>Stratec</td>
			<td>1020220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick RNA Viral Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Fragmentation Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv

生物学的プロセスにおけるRNA修飾の役割は、ここ数年で研究の増加の焦点であり、今日ではエピトランスクリプトロミクスとして知られています。とりわけ、N6-メチルデノシン(m6A)および5-メチルシトシン(m5C)RNA修飾はmRNA分子に記載されており、細胞プロセスを調節する役割を有し得る。エピトランスクリプトミクスは、ウイルス感染を含む任意の化学物質または生物学的薬剤への暴露によって改変または変調することもできるので、トランスクリプト分析に加えて考慮されなければならない新しい調節層である。
ここでは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に感染している細胞のm6Aとm5Cマークの関節細胞およびウイルスエピトランストランスクリプトの風景を同時に分析できるワークフローを提示する。HIV感染細胞と非感染細胞からのmRNA単離および断片化に際して、RNA免疫沈降法であるMeRIP-Seqを用いて、m6Aマークを含むRNA断片とバイサルファイト変換ベースの技術であるBS-Seqを濃縮し、一塩基分解能でm5Cマークを同定しました。メチル化特異的なキャプチャの際、RNAライブラリはハイスループットシーケンシング用に用意されています。また、基礎的発現プロファイルとは無関係に微分メチル化(DM)転写物を同定する専用のバイオインフォマティクスパイプラインも開発しました。
全体として、この方法論は複数のエピトランストランスクリプトマークを同時に探索することを可能にし、ウイルス感染または他の細胞摂動時にDM転写物のアトラスを提供する。このアプローチは、ウイルス複製を促進または制限する細胞因子などの新しいプレーヤーと細胞応答の新しいメカニズムを識別する新しい機会を提供します。

このワークフローは、HIV感染のコンテキストでm6Aおよびm5Cメチル化の役割を調査するのに有用であることが証明されています。このために、HIVに感染するか、未治療のまま残したCD4+ T細胞線モデル(SupT1)を使用しました。1条件あたり5,000万個の細胞でワークフローを開始し、RNA品質番号10の平均500μgのRNAを得た(図1A-B)。ポリA選択時に、1つの条件(全RNAの約2%を表す)のmRNAの10〜12μgの間で取り出しました(図1B)。この時点で、MeRIP-Seqパイプラインには5μgのポリA選択RNA、BS-Seqパイプラインには1μgを使用しました。HIV RNAはポリアデニル化されているため、それ以上のアクションは必要なく、MeRIP-SeqおよびBS-Seq手順を直接適用することができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig01.jpg"> 図1:下流用途のRNA調製物。A) 同時MeRIP-SeqおよびBS-SeqパイプラインのためのRNAの準備および分布を描写するワークフロー。塗りつぶされた六角形の形状は、m6A(緑色)やm5C(ピンク)などのRNA修飾タイプを表します。実験を行うために必要なRNA材料の量が示されている。 B) RNAの総抽出(上部パネル)およびポリA選択(下部パネル)で期待されるRNA分布プロファイル(サイズと量)を示す代表的な結果。サンプルは、特定のMeRIP-SeqおよびBS-Seq手順に入る前にRNAの品質を評価するために、標準感度キットを用いてフラグメント分析装置にロードしました。RQN: RNA品質番号;nt: ヌクレオチド。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
MeRIP-Seqパイプラインは、RNA分子に沿ったm6A修飾の調査を可能にするRNA免疫沈降ベースの技術です。このために、RNAはまず断片化され、m6A特異的抗体と結合して免疫沈降および捕獲のために磁気ビーズと結合される。MeRIP濃縮RNA断片と手つかずの(入力)分数を配列決定し、m6A修飾RNA領域を同定し、m6A-メチル化された転写物を同定する(図2A)。この技術の分解能は、RNA断片化の効率に依存します。実際、短い断片はm6A残基のより精密な局在化を可能にする。ここで、細胞ポリA選択RNAおよびウイルスRNAは、20μL最終容積で15分の間にRNA断片化バッファーを有するイオンベースの断片化を行い、100〜150ntのRNA断片を得た。5 μgのmRNAから、90%の回収率に対応した4.5μgの断片化したRNAを回収しました(図2B)。100 ngの断片化した精製RNAを入力制御として使用し、直接ライブラリ調製およびシーケンシングを行った。残りのRNA(約4.4μg)は、抗体特異的抗体または抗IgG抗体に抗IgG抗体を制御するように結合したビーズを有する断片化されたRNAのインキュベーションから始まるMeRIP-Seqパイプラインに従って処理された。2.5 μgの断片化されたRNAのm6A特異的RIP(MeRIP)は、ライブラリー調製およびシーケンシングを行ったm6A濃縮材料の約15ngを取り出すことができます(図2B)。反IgG制御を用いたRIPは、予想通り、さらなる分析を可能にするのに十分なRNAを得られなかった(図2B)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig02.jpg"> 図 2: MeRIP-Seq パイプライン A) MeRIP-Seq ワークフローと入力コントロールの概略図ポリA選択の際、サンプルを120-150 nt部分に断片化し、シーケンシング(100ng、入力制御)を直接行うか、またはシーケンシング前に陰性対照として抗m6A特異的抗体または抗IgG抗体を有するRNA免疫沈降(2.5μg、RIP)に使用した。B)断片化時の期待されるRNA分布プロファイル(サイズおよび量)およびRIP(下部パネル、MeRIP:左、IgG制御:右)を示す代表的な結果。サンプルは、ライブラリー調製およびシーケンシングにさらなる処理を行う前に、RNAの品質と濃度を評価するためにフラグメント分析装置にロードした。断片化したRNA分析は、免疫沈降RNAが高感度キットを使用しながら、RNA標準感度キットを用いて行った。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
BS-Seqパイプラインは、ヌクレオチド分解能でm5C RNA修飾を探索し、m5C-メチル化転写物の同定につながります。バイサルファイト変換時には、非メチル化シトシンはウラシルに変換され、メチル化されたシトシンは変わりません(図3A)。バイサルファイト変換手順 (すなわち、 高温および低pH)の過酷な条件により、変換されたmRNAは高度に分解される(図3B)が、これはライブラリの調製およびシーケンシングに干渉しない。バイサルファイト変換は、一本鎖RNAでのみ効率的であり、二次的な二本鎖RNA構造によって妨げられる可能性があります。C-U変換の効率を評価するために、2つのコントロールを導入しました。陽性対照として、我々は、28S rRNA23の位置C4447における高度にメチル化されたシトシンの前述の存在を利用した。メチル化部位を取り囲む200bp断片のRT-PCR増幅およびシーケンシングの際に、すべてのシトシンがウラシルに正常に変換され、それによって、変化しなかった4447位のシトシンを除くDNA配列中にチミジンとして現れるのを観察することができた。バイサルファイト変換速度の制御として、市販の合成ERCC RNA配列を用いた。この混合物は、既知の非メチル化およびポリアデニル化RNA配列のプールで構成され、様々な二次構造および長さを有する。ライブラリの調製とシーケンスの際に、変換速度を計算するためにこれらのERCC配列に焦点を当て、これはすべてのERCC配列および各サンプルの合計C残基の中で変換されたCの数を数えることによって実行することができる。我々は、99.5%の変換率を得て、バイサルファイト変換反応の効率と成功を確認した(図3D)。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig03.jpg"> 図 3: BS-Seq パイプラインA) BS-Seq ワークフローの概略表現。ポリA選択の際、サンプルはバイサルファイトにさらされ、非メチル化C残基に対してCからUへの変換(脱アミノ化による)が生じます。対照的に、メチル化C残基(m5C)は、亜硫酸水素化処理の影響を受けず、変化しないままである。 B) 標準感度キットを用いてフラグメントアナライザで解析した際のバイサルファイト変換RNA分布プロファイル(サイズと量)の代表的な結果。 C)28S rRNAの位置4447で100%メチル化Cを取り囲む領域のRT-PCRアンプリコンの代表的なシーケンシング結果を示す電解液球図(青色で強調表示)。これに対し、参照配列のC残基は、亜硫酸水素塩変換成功によるアンプリコン配列のT残基として同定された。 D) HIV感染細胞および非感染細胞におけるERCCスパイクイン配列の分析によるC-U変換率の評価平均換算率は99.5%です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
M6A濃縮サンプル、バイサルファイト変換サンプルおよび入力制御は、ライブラリ調製、シーケンシングおよびバイオインフォマティクス分析のためにさらに処理される(図4)。実験計画と生物学的問題に従って、複数のバイオインフォマティクス解析を適用することができる。ここでの原理証明として、HIV感染時に誘導される微分メチル化転写物の同定に焦点を当てた1つの潜在的な応用(すなわち、微分メチル化分析)の代表的な結果を示す。簡単に言えば、ウイルスのライフサイクル中のRNAメチル化の役割をさらに理解するために、非感染細胞とHIV感染細胞の両方で、遺伝子発現レベルとは無関係に、転写産物のm6Aまたはm5Cメチル化レベルを調べた。遺伝子発現正常化の結果、感染状態に応じてZNF469転写物がm6A-メチル化されたのが分化され、実際にこの転写産物は非感染細胞ではメチル化されなかったが、HIV感染時にメチル化されたピークがいくつか示された(図5A)。m5Cに対する同様の微分メチル化分析は、PHLPP1転写物に複数のメチル化残基が含まれていることを明らかにした。この文脈では、両方の分析は、HIV感染が細胞エピトランストランスクリプトームに影響を与ことを示唆している。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig04.jpg"> 図4:m6Aおよびm5Cデータの解析のためのバイオインフォマティクスワークフローの概略表現。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig04large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig05.jpg"> 図5:感染時の微分メチル化転写物の例。A) HIV感染(緑色)および非感染(灰色)細胞におけるZNF459転写産物のm6Aメチル化を示す代表的な結果。ピーク強度(入力式減算時)は、y軸上およびX軸に沿った染色体内の位置に表示されます。微分メチル化分析は、ZFN469転写産物がHIV感染時に過メチル化されることを明らかにする。 B)HIV感染(上レーン)および非感染(下車線)細胞におけるm5Cメチル化遺伝子の代表的な結果。各バーの高さは、ヌクレオチドあたりの読み取りの数を表し、カバレッジ評価を可能にします。各C残基は赤色で表され、メチル化Cの割合は青色で表される。正確なメチル化率(%)は、各C残基より上に報告される。矢印は、IGVビューアを用いて可視化された統計的に有意な微分メチル化C.サンプルを強調した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

ウイルス感染におけるRNA修飾の役割は、検討され始めたばかりで、新しいウイルス宿主相互作用メカニズムを強調する可能性がある。本研究では、ウイルス感染の文脈におけるm6Aおよびm5C RNA修飾を調査するパイプラインを提供する。

ウイルス感染時のm6Aおよびm5Cエピトランスクリプトームの探索:HIVの例

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

こんにちは,このビデオでは、ウイルス感染時のm6Aおよびm5Cエピトランスクリプションを探索する方法を紹介します。実験を開始するには、感染していない細胞に5,000万個、感染した状態に5,000万個の細胞が必要です。分析時に高品質のデータセットを取得するには、ユニバーサル感染を達成する必要があります。ここでは、これらの細胞をHIVベースのベクターで感染させ、FACSによってウイルスにコードされたGFPを測定する。この場合、感染細胞の80%を有し、RNAの総抽出から始まるワークフローを進めた。そこで、細胞をそれぞれ1000万個のアリコートに分け、トリゾールの1mLでライスしました。その後、細胞リセートに200マイクロリットルのクロロホルムを添加し、反転によって混合した。この時点で、lysatsatを室温で3分間座らせ、すべてのサンプルを4度で15分間高速で遠心分離します。次に示すように、3 つの異なるフェーズでフェーズ分離が行われます。RNAは上相に座っているので、有機層を移さないで注意を払って水相を新しいチューブに慎重に移します。この時点で、水相に0.5mLのイソプロパノールを加え、反転によって慎重に混ぜます。サンプルは、RNA沈殿を確実にするために80度で1時間インキュベートすることができます。高速で遠心分離すると、ここに示すように素敵なRNAペレットを見ることができるはずです。慎重に上清を反転またはピペットによって廃棄し、ペレットを破壊しないことに注意を払う。その後、RNAペレットを75%分子グレードエタノールの1mLで洗浄します。そして、サンプルを簡単に渦を出します。遠心分離の際、素敵な白色RNAペレットを必ず取り出してください。上清を捨て、RNAペレットを室温で15分間乾燥させます。20マイクロリットルの水で各ペレットを再懸濁し、同じ条件からすべてのサンプルを一緒にプールします。総RNAは、ポリA選択によるmRNAの単離に対応する準備が整いました。RNAの75マイクログラムの各サンプルに対して、200マイクロリットルのオリゴDT磁気ビーズを調製し、結合緩衝液の1mLで洗浄します。チューブを磁気スタンドに置き、ビーズを1回のミックス中に磁石に結合できるようにします。上清を捨て、2回目の洗浄のために手順を繰り返します。次に、磁気スタンドからビーズを取り出し、100マイクロリットルの結合バッファーで慎重に再懸濁します。この時点で、100マイクロリットルの水に再懸濁されたアリコート当たり75マイクログラムのRNAに分割してRNAサンプルを調製する。100マイクロリットルの結合バッファーを加え、65度で2分間インキュベートします。その後、サンプルをスピンダウンし、氷の上でインキュベートします。次に、洗浄した磁気ビーズを100マイクロリットルずつ各RNAサンプルに加え、室温で15分間回転ホイールに結合します。インキュベーション時に、チューブを磁気ラックに戻し、1分間インキュベートします。その後、新しいチューブに上清を回復し、分離の第二ラウンドのためにそれを脇に保ちます。200マイクロリットルの洗浄バッファーでビーズを2回洗い、溶出に進みます。磁気ビーズから選択したポリARNAを溶出させるために、各サンプルとピペットに20マイクロリットルの氷冷TRIS HClを慎重に加えます。その後、サンプルを80度で2分間インキュベートし、ビーズからRNAを放出します。ポリA選択RNAを含む上清を新鮮なチューブに移し、ビーズの持ち越しを避けるように注意してください。溶出ステップと分離ステップは、mRNA収率を上げるために2回繰り返す必要があります。mRNAは、断片化ステップでmeRIP-Seqパイプラインに入るか、バイサルファイト変換に直接進む準備が整いました。meRIP-Seq パイプラインに入る最初のステップは mRNA 断片化で構成されます。このためには、0.2 mLチューブで18マイクロリットルのアリコートに分けられたmRNAの5マイクログラムが必要です。一貫性のあるデータを確保するには、その時点でサンプルを少なくして迅速に作業することが重要です。この実験では、断片化が最適化され、115~200ヌクレオチドの間のサイズの断片が得られます。次に、18マイクロリットルのmRNAを含む各チューブに2マイクロリットルの断片化試薬を加え、チューブ壁に液滴を堆積させる際に注意を払う。試薬とRNAとの接触を同時に可能にするためにすべてのサンプルをスピンダウンし、70度で15分間インキュベートします。インキュベーションが終わったら、0.5 M EDTAの2マイクロリットルを加えて反応を止める。この時点で、フラグメント化した mRNA を選択した方法で精製し、フラグメントアナライザーによる RNA 品質管理に進むことができます。このステップは任意ですが、RNA沈殿を引き込む前に断片のサイズを評価することができます。4番目のレーンで見ることができるように、我々は、それぞれ約150ヌクレオチドの我々のサンプル断片の両方について得る。その後、私たちはmeRIP-Seqを進めました。最初のステップは抗m6A抗体またはIgG制御を用いた結合A/G磁気ビーズで構成される。各反応計画について、25マイクロリットルの磁性ビーズを新鮮なチューブに移します。少なくとも1つのm6A特有の条件と1つの制御条件が必要です。250マイクロリットルのIPバッファーで各25マイクロリットルのビーズを洗浄します。ビーズの分離を可能にするために、ビーズを上下にピペットしてビーズを静かに再中断し、チューブを磁気ラックに1分間置きます。上清を取り出して捨て、磁気ビーズを吸引しないことに注意を払い、洗浄工程を一度繰り返します。その後、元のビーズの体積の25マイクロリットルごとに100マイクロリットルのIPバッファで磁気ビーズを再懸濁します。各条件ごとに1つのチューブを準備し、ラベルを付けます。我々の場合、感染状態用の2つのチューブ、m6A用とIgGコントロール用のチューブ、および非感染状態用の2つのチューブがあります。次に、各チューブに100マイクロリットルの洗浄ビーズを加えます。ビーズは、特定の抗体またはIgG制御と結合する準備が整いました。洗浄された磁気ビーズの100マイクロリットルを含む各チューブに特異的抗m6A抗体または抗IgG制御抗体の5マイクログラムを加える。回転ホイールでチューブを30分間インキュベートすることで、抗体ビーズの共役を可能にします。その間、サンプル調製を進める。m6A特異的またはIgG制御の各計画条件に対して、出発物質は100マイクロリットルの水を再懸濁した断片化したmRNAの2.5マイクログラムになります。500マイクロリットルの最終的な反応量を持っている場合は、各サンプルに水の295マイクロリットルを追加します。次に、1マイクロリットル当たり40単位で濃縮したRNAase阻害剤を5マイクロリットル加え、サンプルあたり合計200単位で混合し、穏やかに混ぜます。最後に、各チューブに5倍の濃縮IPバッファの100マイクロリットルを加えます。サンプルは免疫沈殿反応の準備が整いました。回転ホイールから抗体と結合した磁気ビーズを取り出し、それらを回転させます。次に、前に調製したサンプルの500マイクロリットルを、特定の抗体と結合したビーズの各100マイクロリットルに加えます。ビーズを完全に再中断するために何度か上下にピペットを入れ、穏やかに混ぜます。2時間の間に4度で回転ホイールにそれらをまたはあなたのmeRIP反応をインキュベートします。インキュベーションが終わったら、各チューブをスピンダウンし、1分間磁気ラックに置いてビーズの分離を可能にします。次に、非結合分数を除去し、新鮮なチューブ上に置き、必要に応じてさらなる分析のためにそれを維持します。マグネットをラックから取り出し、500マイクロリットルのIPバッファですべてのサンプルを再中断します。各サンプルを上下にピペットして慎重に再中断します。磁石をラックに挿入し、1分間インキュベートしてから上清を慎重に取り出します。洗浄を2回繰り返し、溶出を進めます。サンプルの各カップルについて、m6A特異的および対照、精製m6Aの20ミリモルを含む溶出緩衝液225マイクロリットルを調製する。その後、サンプルあたり100マイクロリットルの溶出バッファーを加えます。すべてのサンプルをロッカーに4度で1時間インキュベートします。次に、新鮮なチューブに濃縮されたRNAサンプルをすべて集め、溶出の第2ラウンドを進めます。選択した方法でm6A濃縮RNAを精製し、この時点でサンプルはライブラリの準備とシーケンシングの準備ができています。m5Cの改変を調べるには、バイサルファイト変換を用います。ポリアデニル化RNAの500ナノグラムで実験を開始します。任意ですが、リボソーム表現を確実にするためにポリA枯渇RNAのサンプル500ピコグラムを添加し、商業的に入手可能な合成配列の0.5マイクロリットルは、シーケンス時に亜硫酸塩変換率を評価することができます。サンプルを水中20マイクロリットルの最終体積に調整し、各サンプルに130マイクロリットルのRNA変換試薬を加えます。上下にピペットを入れ、すべてのサンプルを回転して慎重に混ぜて、チューブの側面に液滴が残らないようにします。PCRマシンで全てのサンプルを5分間70度、バイサルファイト変換を55分間54度で3サイクルインキュベートします。空のカラム、250マイクロリットルのRNA結合バッファー、150マイクロリットルのバイサルファイト変換サンプルに直接添加して、カラム内脱アミノ化を行います。上下にピペットを入れてサンプルを混ぜますが、カラムフィルターに触れないように注意してください。サンプルRNA結合バッファー混合物に95~100%エタノールの400マイクロリットルを直接カラムに加えます。キャップを閉じて、反転によってすぐに混ぜます。サンプルを 30 秒間スピンダウンし、フロースルーを破棄します。洗浄バッファーでカラムを洗い、各カラムの中央に200マイクロリットルの脱硫溶液を加えます。すべてのサンプルを室温で30分間インキュベートします。サンプルを30秒間回転させ、2ラウンドの洗浄を進めます。各サンプルに400マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、遠心分離機を全速速で30秒間加え、流量を廃棄します。カラムを新しい空のチューブに入れ、亜硫酸塩変換RNAを20マイクロリットルの水に溶出させます。RT-qPCRによるバイサルファイト変換効率を制御し、ライブラリの調製とシーケンシングに進みます。バイオインフォマティクス解析の際、このワークフローで得られる結果の例を次に示します。ここでは、HIV感染細胞と非感染細胞のエピトランストランスクリプトームを比較します。24時間の感染後に。Aパネルでは、m6Aエピトランストランスクリプトームを探索する結果を見ることができます。このグラフでは、meRIP-Seq分析にm6A濃縮読み込み値をプロットします。感染後24時間でジンクフィンガーが過メチル化されているのがうまくわかります。このグラフのパネル B.In m5Cエピトランスクリプトーム調査に対して同じタイプの分析を行い、非メチル化シトシンは赤で表示され、m5Cメチル化されたシトシンの割合は青色で示されています。ご覧のように、PHLPP1は、24時間のHIV感染後にハイパーメチル化された3つのシトシンすべてである。全体として、このワークフローは、感染した細胞のM6Aとm5Cエピトランスクリプトームの両方を調査することを可能にし、同様にウイルス粒子にそのように適用することができる。ウイルス感染の理解は、宿主エピトランストランスクリプトの風景を変更することができ、私たちは規制の新しい層へのアクセスを与えるだろう。ウイルス感染時の微分メチル化転写物の調査は、もちろん新しい治療介入のための貴重なリソースを提供する。以下のリンクでは、HIV感染時の微分メチル化転写産物の経時調査のためのオープンアクセスリソースを見つけることができます。

Research

JoVE Journal

Biology

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