Name: exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv
Uploaded: 2022-03-05T13:00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (31003A_166412 보조금 및 314730_188877)에 의해 지원되었다.

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바이러스 감염에 있는 RNA 수정의 역할은 아직도 크게 알려지지 않습니다. 바이러스 감염의 맥락에서 epitranscriptomic 수정의 역할의 더 나은 이해는 새로운 항 바이러스 치료 목표에 대 한 탐구에 기여할 수 있습니다.
이 작품에서는 감염된 세포의 m6A 및 m5C 에피레모니오크를 조사할 수 있는 완벽한 워크플로우를 제공합니다. 생물학적 질문에 따라 폴리A 선택 RNA를 시동 재료로 사용하는 것이 좋습니다. 비록 선택적이지만, 파이프라인은 총 RNA와 함께 사용될 수 있기 때문에 rRNA뿐만 아니라 작은 RNA가 고도로 수정되고 메틸화 잔류물의 중요한 수를 포함하는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 이로 인해 의미 있는 시퀀싱 데이터의 품질과 수량이 감소할 수 있습니다.
그러나, 연구의 초점이 비다성 RNA인 경우, RNA 추출 단계는 작은 RNA(컬럼 계 RNA 추출의 경우)를 폐기하지 않도록 하고, 파이프라인에 진입하기 위해 다중A 선택보다는 리보솜 고갈 기술을 특권하기 위해 적응되어야 한다.
고품질 RNA, 올바른 단편화 및 적절한 m6A 농축 및 BS 변환 RNA 품질을 보장하기 위해 라이브러리 준비를 위해 RNA 품질을 변환하여 단편 분석기 또는 생체 분석기를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 이 장비가 항상 사용할 수 있는 것은 아닙니다. 대안으로, RNA의 품질, mRNA 및 단편화된 RNA의 크기는 또한 아가로즈 젤에 시각화에 의해 평가될 수 있었습니다. 대안적으로, 라이브러리 제제는 RNA 수량에 대한 이전의 평가 없이 수행될 수 있다.
우리는 m6A 에피레마레토믹 풍경을 탐구하기 위해 항체 기반의 MeRIP-Seq16 기술을 사용했습니다. 이 기술은 RNA 면역 침전을 기반으로 하고 성공적입니다; 그러나 일부 단계는 신중한 최적화가 필요하며 중요할 수 있습니다. m6A 메틸화는 주로 합의 서열 RRA*CH 내에서 발생하도록 기술되었지만, 이 모티프는 mRNA 분자를 따라 매우 빈번하며 메틸화 부위의 정확한 식별을 허용하지 않는다. 따라서 RIP 기반 해상도를 개선하기 위해, 작은 RNA 단편을 생성, 재현 가능하고 일관된 RNA 단편화를 달성하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서는 최적화된 절차를 권장하며 실험 환경에서 재현 가능하고 일관된 결과를 제공하는 것이 좋습니다. 그러나 이러한 조각화 단계는 특정 샘플 피쳐에 따라 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.
최근에는 m6A 직접 시퀀싱을 허용하는 새로운 기술이 설명되었다. 그것은 m6A RNA 수정을 접는 것에 대한 응답으로 독특한 RT 서명을 나타내는 특정 역 전사 변이체의 사용을 기반으로합니다24. 이 기술은 신중한 최적화시 MeRIP-Seq(초기 재료의 양을 줄이고 더 높은 해상도를 허용)에 직면한 주요 한계를 우회할 수 있습니다. m5C 수정을 탐구하기 위해 우리는 뉴클레오티드 해상도에서 수정된 C 잔류물을 검출하기 위해 비설피테 변환 기술을 사용하기로 결정했습니다. RNA 이차 구조의 존재로 인한 거짓 양성률을 줄이기 위해 ERCC 스파이크인 컨트롤의 사용으로 인해 3주기의 내성/양성환 변환을 수행하고 양성환 전환율 성능을 더욱 조절했습니다. 이 기술에 연결된 한계 의 한개는 bisulfite 변환이 아주 가혹하고 데니션/bisulfite 변환의 3 주기는 몇몇 RNA를 저하시키고 그러므로 해결책을 감소시킬 수 있었다는 것입니다. 그러나 설정에서 데이터 집합의 품질을 높이기 위해 잠재적으로 약간 낮은 해상도에 정착하기로 결정했습니다.
이러한 최적화 및 제어 덕분에 바이러스 감염, 숙주 병원체 상호 작용 또는 특정 치료에 대한 노출의 맥락에서 상피 지형 및 변경 사항을 조사하기 위해 악용 할 수있는 신뢰할 수있는 사운드 워크플로우를 제공 할 수있었습니다.

RNA 분자가 변형될 수 있고, 150개 이상의 전사 후 수정이 현재까지 기술되었다는 것은 오래 알려져 있다1. 그(것)들은 RNA 분자2의 pyrimidine 및 purine 고리의 거의 모든 위치에 화학 단, 주로 메틸 단의 추가로 이루어져 있습니다. 이러한 전사 후 수정은 이미 전사 RNA (tRNA) 및 리보소말 RNA (rRNA)에서 고도로 농축되는 것으로 나타났으며 최근에는 mRNA 분자에도 설명되어 있다.
차세대 시퀀싱(NGS)과 같은 신기술의 부상과 명확한 화학적 수정을 인식하는 특정 항체의 생산은 처음으로 전사 적 수준에서 특정 화학 적 수정의 위치 및 주파수에 대한 조사가 허용되었다. 이러한 발전은 RNA 수정의 더 나은 이해와 mRNA 분자3,4에 대한 여러 수정의 매핑으로 이어졌습니다.
후성 유전학은 전사 성 규제에서 DNA와 히스톤 변형의 역할을 조사하는 동안, 유사한 방식으로 epitranscriptomics는 RNA 수정및 그들의 역할에 초점을 맞추고 있습니다. epitranscriptomic 수정의 조사는 다양한 세포 프로세스 (즉, RNA 접합, 수출, 안정성 및 번역)5를 조정할 수있는 새로운 규칙 메커니즘을 강조 할 수있는 새로운 기회를 제공합니다. 최근 연구에서 세포와 바이러스 성 RNAs6 모두에서 바이러스 감염에 많은 상피 수정을 발견 했다 따라서 큰 놀라운 일이 아니었다. 지금까지 조사된 바이러스에는 DNA와 RNA 바이러스가 모두 포함됩니다. 그 중에서도 HIV는 선구적인 예로 간주될 수 있습니다. 전부, 바이러스 감염의 맥락에서 RNA 메틸화의 발견은 바이러스성 발현 또는 복제의 아직 설명되지 않은 기계장치의 조사를 허용할 수 있습니다, 따라서 그(것)들을 통제하는 새로운 공구 및 표적을 제공7.
HIV 에피레미토믹스 분야에서 바이러스 성 성적 증명서의 수정은 널리 조사되었으며이 수정의 존재가 바이러스 복제8,9,10,11,12,13에 도움이되었음을 보여주었습니다. 현재까지 다양한 기술을 사용하여 전사 적 수준에서 에피레미토믹 마크를 검출할 수 있다. m6A 식별에 가장 많이 사용되는 기술은 MeRIP-Seq 및 miCLIP과 같은 면역 강수 기술에 의존합니다. MeRIP-Seq는 RNA 단편화에 의존하여 메틸화 잔류물을 포함하는 단편을 포착하는 반면, miCLIP은 RNA-항체 UV 교차 링크시 α-m6A 항체 특이적 시그니처 돌연변이의 생성을 기반으로 하므로 보다 정밀한 매핑을 허용합니다.
m5C 변형의 검출은 m6A 검출(m5C RIP)과 유사한 항체 기반 기술, 또는 비설피트 변환 또는 AZA-IP 또는 miCLIP에 의해 달성될 수 있다. Aza-IP와 m5C miCLIP 은 RNA 메틸화를 거치면서 RNA를 표적으로 하는 미끼로서 특정 메틸 트랜스퍼라아제를 사용한다. Aza-IP에서, 표적 세포는 5-azacytidine에 노출되어, 초기 RNA로 cytidine 아날로그 5-azacytidine 사이트의 임의로 소개의 결과로. miCLIP에서, NSun2 메틸 트랜스퍼라제는 C271A 돌연변이14,15를 항구하기 위하여 유전자 변형됩니다.
이 작품에서는 HIV를 모델로 사용하여 감염된 세포의 m6A 및 m5C 변형의 이중 특성화에 중점을 둡니다. 방법론적 최적화시, 우리는 세포 및 바이러스 성 맥락에서 전사적 수준에서 m6A 및 m5C 상피 마크의 동시 탐사를 허용하는 메틸화 RNA 면역 침전(MeRIP)과 RNA 편황피화 변환(BS)을 결합한 워크플로우를 개발했습니다. 이 워크플로우는 바이러스 성 입자로부터 분리된 RNA뿐만 아니라 세포 RNA 추출물에 구현될 수 있다.
메틸화 RNA 면역전수량(MeRIP)16 접근법은 전사-전체 수준에서 m6A의 조사를 허용하는 것이 잘 확립되고 m6A 특이적 항체의 배열이 현재까지 상용화되어 있다17. 이러한 방법은 m6A 특이적 항체를 이용한 m6A 함유 RNA 조각을 선택적으로 포획하는 것으로 구성된다. 이 기술의 2개의 주요 단점은 (i) RNA 단편의 크기에 크게 의존하고 따라서 메틸화 잔류물을 포함하는 대략적인 위치 및 영역을 제공하고, (ii) 분석을 수행하는 데 필요한 다량의 물질을 제공한다. 다음 최적화 된 프로토콜에서, 우리는 약 150 nt로 단편 크기를 표준화하고 폴리 A 선택 RNA의 10 μg에서 시작 물질의 양을 감소, 이는 현재 시작 물질의 권고 된 양, 폴리 A 선택 RNA의 단지 1 μg. 또한 페놀계 기술 또는 단백질아제 K를 이용한 보다 종래의 덜 특이적 용용 방법 대신 m6A 펩타이드와의 경쟁 접근법에 의한 경쟁 접근법에 의한 용출을 이용하여 특정 항체에 결합된 m6A RNA 단편의 회수 효율을 극대화했다. 그러나 이 RIP 기반 분석의 주요 제한은 정밀하게 변형된 A 뉴클레오티드의 식별을 허용하지 않는 최적이 아닌 해상도로 남아 있다.
m5C 마크의 분석은 현재 두 가지 다른 접근법을 사용하여 수행될 수 있다: m5C 특이적 항체 및 RNA bisulfite 변환을 이용한 RIP 기반 방법. RIP는 메틸화 잔류물의 식별에 대한 제한된 해상도만 제공하므로 단일 뉴클레오티드 분해능을 제공할 수 있는 양성환 변환을 사용했습니다. 비설핏(BS)에 대한 RNA 노출은 시토신 탈약으로 이어져 사이토신 잔류물을 우라실로 변환한다. 따라서, RNA bisulfite 변환 반응 도중, 모든 비메틸화 된 사이토신은 탈액및 우라실로 변환되고, 사이토신의 위치 5에 메틸 군의 존재는 BS 유도 된 탈충을 방지하고 사이토신 잔류물을 보존하는 보호 효과가 있다. BS 기반 접근법은 단일 염기 해상도에서 m5C 변형 뉴클레오티드를 검출하고 각 성적증명서의 메틸화 주파수를 평가하여 m5C 수정 역학18에 대한 통찰력을 제공합니다. 그러나이 기술의 주요 제한은 메틸화 잔류물의 거짓 긍정 비율에 의존한다. 실제로, BS 변환은 접근 가능한 C 잔류물을 가진 단 하나 좌초 RNA에 효과적입니다. 그러나, 단단한 RNA 이차 구조의 존재는 N5C 위치를 가리고 BS 변환을 방해할 수 있고, U 잔류물으로 변환되지 않는 비메틸화 C 잔류물의 결과로, 따라서 거짓 긍정. 이 문제를 회피하고 거짓 긍정 률을 최소화하기 위해 3 차례의 디마튜션 및 비황피전환 주기19를 적용했습니다. 또한 비설피테 변환 효율의 추정을 가능하게 하는 2개의 컨트롤을 시료에 도입했습니다: 우리는 ERCC 시퀀싱 제어(비메틸화 표준화 및 시판 시퀀스)20뿐만 아니라 폴리 A-A 고갈된 RNA를 한 손에 는 양황피전환율을 평가하고 RT-PCR에 의해 잘 알려진 것으로 알려진 C4의 존재를 검증하고, 잘 알려진 C4의 존재를 검증하기 위해 에 28S 리보소말 RNA 다른 한편으로는21.
바이러스학 분야에서, 차세대 시퀀싱과 정확한 생물 정보 분석과 이 두 가지 epitranscriptomic 조사 방법을 결합하면 m6A 및 m5C 역학의 심층 연구를 가능하게 합니다 (즉, 바이러스 감염 시 발생할 수 있는 RNA 수정 측두경 변경및 임상 사용에 대한 새로운 치료 관련 표적의 배열을 발견할 수 있음).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrime Pfx SuperMix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12344-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ RNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>EZR5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-472-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-471-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina TruSeq Stranded mRNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Beads A/G Blend</td>
			<td>Merck</td>
			<td>16-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-Methyladenosine, 5&#8242;-monophosphate sodium salt (m6A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2780-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse IgG</td>
			<td>Merk</td>
			<td>12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo(dT)25</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61005,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRapace</td>
			<td>Stratec</td>
			<td>1020220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick RNA Viral Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Fragmentation Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv

생물학적 과정에 있는 RNA 수정의 역할은 지난 몇 년 동안 연구 결과의 증가 수의 초점이 되고 고 epitranscriptomics로 요즘 알려져 있습니다. 그 중에서도, N6-메틸라데로신(m6A) 및 5-메틸시토신(m5C) RNA 수정은 mRNA 분자에 기술되어 있고 세포 프로세스를 조절하는 역할을 할 수 있다. Epitranscriptomics는 따라서 바이러스 감염을 포함하여 어떤 화학 또는 생물학 에이전트에 노출에 의해 변경되거나 변조될 수 있기 때문에, 전사 분석 이외에 고려되어야 하는 규정의 새로운 층입니다.
여기서, 우리는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)로 감염되었거나 하지 않는 세포에서 m6A 및 m5C 마크의 관절 세포 및 바이러스 상피 적 경관의 분석을 동시에 할 수있는 워크플로우를 제시한다. HIV-감염 및 비감염 세포로부터의 mRNA 격리 및 단편화시, 우리는 RNA 면역 침전 기반 기술인 MeRIP-Seq, rna 면역 침전 기반 기술, m6A 마크및 BS-Seq, 양성환전환 기반 기술을 포함하는 RNA 단편을 농축하여 단일 핵티드 분해능에서 m5C 마크를 식별하는 두 가지 다른 절차를 사용했습니다. 메틸화 별 포획시, RNA 라이브러리는 고처리량 시퀀싱을 위해 준비됩니다. 또한 기초 발현 프로파일과 는 별개로 차별화된 메틸화(DM) 성적증명서를 식별하기 위해 전용 생물정보학 파이프라인을 개발했습니다.
전반적으로, 방법론은 동시에 다중 epitranscriptomic 마크의 탐구를 허용하고 바이러스 감염 또는 그밖 세포 동요에 DM 전사의 아틀라스를 제공합니다. 이 접근은 바이러스성 복제를 승진하거나 제한하는 세포 요인과 같은 새로운 플레이어 및 세포 반응의 새로운 기계장치를 식별할 수 있는 새로운 기회를 제공합니다.

이 워크플로우는 HIV 감염의 맥락에서 m6A 및 m5C 메틸화의 역할을 조사하는 데 유용합니다. 이를 위해, 우리는 우리가 HIV에 감염하거나 치료되지 않은 떠나는 CD4+ T 세포주 모형 (SupT1)를 사용했습니다. 우리는 조건당 5천만 개의 세포로 워크플로우를 시작하고 RNA 질 수가 10 (그림 1A-B)로 총 RNA의 평균 500 μg를 얻었습니다. 폴리-A 선택에 따라 조건당 mRNA의 10 에서 12 μg 사이를 검색합니다 (총 RNA의 약 2 %를 나타냅니다)(그림 1B). 이 시점에서, 우리는 MeRIP-Seq 파이프라인에 대한 폴리 A 선택 RNA 5 μg와 BS-Seq 파이프라인에 대한 1 μg를 사용했습니다. HIV RNA는 폴리-아덴레이트되기 때문에 추가 조치가 필요하지 않으며 MeRIP-Seq 및 BS-Seq 절차를 직접 적용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig01.jpg"> 그림 1: 다운스트림 응용 을 위한 RNA 준비. A) 동시 MeRIP-Seq 및 BS-Seq 파이프라인에 대한 RNA 준비 및 분포를 묘사하는 워크플로우. 채워진 모든 육각형 형상은 m6A(녹색) 또는 m5C(분홍색)와 같은 RNA 변형 유형을 나타낸다. 실험을 수행하는 데 필요한 RNA 물질의 양이 표시됩니다. B) 총 RNA 추출(상부 패널) 및 다중A 선택(하부 패널)에 대한 예상 RNA 분포 프로파일(크기 및 양)을 기재하는 대표적인 결과. 샘플은 특정 MeRIP-Seq 및 BS-Seq 절차를 입력하기 전에 RNA 품질을 평가하기 위해 표준 감도 키트를 사용하여 단편 분석기에 로드되었습니다. RQN: RNA 품질 번호; nt: 뉴클레오티드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
MeRIP-Seq 파이프라인은 RNA 분자를 따라 m6A 변형을 조사할 수 있는 RNA 면역 침전 기반 기술입니다. 이를 위해, RNA는 면역 침전 및 포획을 위해 자기 구슬에 결합된 m6A 특이적 항체로 먼저 단편화되고 그 후 배양된다. MeRIP 농축 RNA 단편및 손길이 닿지 않은 (입력) 분획은 m6A 변형 RNA 영역과 따라서 m6A 메틸화 된 전사체를 식별하기 위해 시퀀스되고 비교된다 (도 2A). 기술의 해상도는 RNA 단편화의 효율성에 의존한다. 실제로, 짧은 조각은 m6A 잔류물의 보다 정확한 국소화를 가능하게 합니다. 여기서, 세포 다중-A 선택 된 RNA 및 바이러스 RNA는 100-150 nt의 RNA 단편을 얻기 위해 20 μL 최종 부피에서 15 분 동안 RNA 단편화 버퍼로 이온 기반 단편화를 실시하였다. mRNA의 5 μg로 시작하여, 우리는 90 %의 회복 속도에 해당하는 단편화된 RNA의 4.5 μg를 회수했습니다 (그림 2B). 우리는 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 직접 실시입력 제어로 단편화, 정제 된 RNA의 100 ng를 사용했다. 나머지 RNA(~4.4 μg)는 MeRIP-Seq 파이프라인에 따라 처리되었으며, 이는 항체가 있는 단편화된 RNA의 배양으로 시작하여 항m6A 특이적 항체또는 반대로 IgG 항체를 대조군으로 결합하였다. m6A 특이적 RIP(MeRIP)의 단편화된 RNA의 2.5 μg는 라이브러리 준비 및 시퀀싱(도 2B)을 받은 m6A 농축 물질의 약 15ng을 회수할 수 있었습니다. 예상대로 안티-IgG 제어를 가진 RIP는 추가 분석을 허용할 충분한 RNA를 산출하지 못했습니다(도 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig02.jpg"> 그림 2: MeRIP-Seq 파이프라인. A) MeRIP-Seq 워크플로우 및 입력 제어의 회로도 표현. 폴리-A 선택에 따라 시료는 120-150nt 조각으로 단편화되었고, 시퀀싱(100 ng, 입력 제어)을 직접 실시하거나, 항체 를 이용한 RNA 면역침전(2.5 μg, RIP)에 사용되는 경우, 시퀀싱 전에 음의 대조군으로 사용하였다. B) 단편화(상부 패널) 및 RIP(하부 패널, MeRIP: 왼쪽, IgG 제어: 오른쪽)에 기대되는 RNA 분포 프로파일(크기 및 양)을 나타내는 대표적인 결과. 샘플은 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 추가 처리하기 전에 RNA 품질과 농도를 평가하기 위해 단편 분석기에 로드되었습니다. 단편화된 RNA 분석은 RNA 표준 감도 키트를 사용하여 수행되었으며 면역 침전 RNA는 고감도 키트를 사용했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
BS-Seq 파이프라인은 뉴클레오티드 해상도에서 m5C RNA 변형을 탐색할 수 있으며 m5C-메틸화 된 성적 증명서의 식별으로 이어집니다. 비황피티 전환시 메틸화된 사이토신은 우라실로 변환되고 메틸화된 사이토신은 변하지 않습니다(그림 3A). 비설피테 변환 절차 (예: 고온 및 낮은 pH)의 열악한 조건으로 인해 변환된 mRNA는 고도로 저하(그림 3B)이지만, 이는 도서관 준비 및 시퀀싱을 방해하지 않습니다. Bisulfite 변환은 단 하나 좌초 RNA에 만 효율적이므로 잠재적으로 이차 이중 좌초 RNA 구조물에 의해 방해될 수 있습니다. C-U 변환의 효율성을 평가하기 위해 두 개의 컨트롤을 도입했습니다. 긍정적인 대조군으로서, 우리는 28S rRNA23의 위치 C4447에서 고도로 메틸화 된 사이토신의 이전에 설명 된 존재를 이용했다. RT-PCR 증폭 및 메틸화 부위를 둘러싼 200 bp 단편의 시퀀싱에 따라 우리는 모든 사이토신이 우라실로 성공적으로 변환되어 DNA 서열에서 티미딘으로 나타나는 것을 관찰할 수 있었으며, 그 결과, 위치 4447의 시토신을 제외하고는 DNA 서열에서 티미딘으로 나타났다. 비설피테 전환율에 대한 대조군으로서, 우리는 시판되는 합성 ERCC RNA 서열을 사용했습니다. 이 혼합물은 알려진, 비 메틸화 및 다중 아데니레이션 RNA 서열의 풀로 구성되며, 다양한 이차 구조 및 길이를 가진다. 라이브러리 준비 및 시퀀싱시, 우리는 모든 ERCC 서열 및 각 샘플에서 총 C 잔류물 중 변환 된 C의 수를 계산하여 수행 할 수있는 전환율을 계산하기 위해 이러한 ERCC 서열에 초점을 맞추었다. 전환율은 99.5%로 비설피트 전환 반응의 효율과 성공을 확인하였다(그림 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig03.jpg"> 그림 3: BS-Seq 파이프라인. A) BS-Seq 워크플로우의 회로도 표현. 폴리A 선택에 따라 샘플은 비황핏에 노출되어, 비메틸화 C 잔류물의 C변환(탈약으로 인한)이 발생합니다. 대조적으로, 메틸화 된 C 잔류물 (m5C)는 양성환 처리에 의해 영향을 받지 않으며 변경되지 않습니다. B) 표준 감도 키트를 가진 단편 분석기에 대한 분석 시 비설피테 변환 RNA 분포 프로파일(크기 및 양)의 대표적인 결과. C) 28S rRNA에서 위치 4447에서 100% 메틸화 C를 둘러싼 지역의 RT-PCR 앰플리콘의 대표적인 시퀀싱 결과를 나타내는 일렉트로페로그램(파란색으로 강조). 대조적으로, 기준 서열의 C 잔류물은 양성환 변환 성공으로 인한 앰플리콘 서열에서 T 잔류물으로 확인되었다. D) HIV 감염 및 비감염 된 세포에서 ERCC 스파이크 인 서열의 분석에 의한 C-U 전환율의 평가. 평균 전환율은 99.5%입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
M6A 농축 시료, 비설피테 변환된 샘플 및 입력 제어는 라이브러리 준비, 시퀀싱 및 생물정보 분석(그림 4)을 위해 추가로 처리됩니다. 실험 설계 및 생물학적 질문에 따르면 다중 생체 정보 분석을 적용할 수 있습니다. 원칙의 증거로, 우리는 HIV 감염에 유도 된 차별화 메틸화 성적 증명서의 식별에 초점을 맞춘 하나의 잠재적 인 응용 프로그램 (즉, 차동 메틸화 분석)에서 대표적인 결과를 보여줍니다. 간단히, 우리는 바이러스 성 수명 주기 동안 RNA 메틸화의 역할을 더 이해하기 위해 유전자 발현 수준과 독립적으로 유전자 발현 수준과 독립적으로 m6A 또는 m5C 메틸화 수준을 조사했습니다. 유전자 발현 정상화시, 우리는 ZNF469 전사체가 감염 상태에 따라 m6A-메틸화되었다는 것을 확인했으며, 실제로 이 성적증명서는 HIV 감염 시 여러 메틸화 피크를 표시하는 동안 비감염된 세포에서 메틸화되지 않았다는 것을 확인했습니다(그림 5A). m5C에 유사한 차동 메틸화 분석은 PHLPP1 성적 증명서가 HIV 상태에서 더 자주 메틸화되는 경향이 있는 몇몇 메틸화 된 잔류물을 포함하는 것으로 나타났습니다 (도 5B). 이 맥락에서, 두 분석은 HIV 감염이 세포 에피레마에 영향을 미친다는 것을 건의합니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig04.jpg"> 그림 4: m6A 및 m5C 데이터 분석을 위한 생물학적 워크플로우의 회로도 표현. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig04large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig05.jpg"> 그림 5: 감염 시 차분하게 메틸화된 성적증명서의 예. A) HIV 감염(green) 및 비감염(grey) 세포에서 ZNF459 전사체의 m6A 메틸화를 보여주는 대표적인 결과. 피크 강도(입력 식 빼기 시)는 x축을 따라 염색체의 y축 및 위치에 표시됩니다. 차동 메틸화 분석은 ZFN469 성적 증명서가 HIV 감염시 과구화된다는 것을 보여줍니다. B) HIV 감염(상부 차선) 및 비감염(하부 차선) 세포에서 m5C 메틸화 유전자의 대표적인 결과. 각 막대의 높이는 뉴클레오티드당 읽기 수를 나타내며 커버리지 평가를 허용합니다. 각 C 잔류물은 빨간색으로 표시되고 메틸화 된 C의 비율이 파란색으로 표시됩니다. 정확한 메틸화 율(%)은 각 C 잔류물 위에 보고됩니다. 화살표는 IGV 뷰어를 사용하여 통계적으로 유의한 분화 된 C. 샘플을 강조합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

바이러스 감염에 있는 RNA 수정의 역할은 탐구하기 시작하고 새로운 바이러스성 호스트 상호 작용 기계장치를 강조할 수 있었습니다. 이 작업에서는 바이러스 감염의 맥락에서 m6A 및 m5C RNA 수정을 조사하는 파이프 라인을 제공합니다.

바이러스 감염시 m6A 및 m5C 에피레미테롬 탐험: HIV를 가진 예

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

안녕하세요,이 비디오에서 우리는 바이러스 성 감염에 m6A와 m5C 에픽스테마테스를 탐구하는 방법을 보여줍니다. 실험을 시작하려면 감염되지 않은 상태에 대해 5천만 개의 세포와 감염된 상태를 위해 5천만 개의 세포가 필요합니다. 분석 시 고품질 데이터 집합을 얻으려면 범용 감염을 달성해야 합니다.여기서 우리는 HIV 기지를 둔 벡터로 이 세포를 감염시키고 FACS에 의해 바이러스성으로 인코딩된 GFP를 측정합니다. 이 경우, 감염된 세포의 80%를 가지고 있었고 총 RNA 추출부터 워크플로우를 진행했습니다. 그래서 우리는 각각 1,000만 개의 알리쿼트에 세포를 나누고 트리졸의 1mL에 감아 놓았습니다.그런 다음 200 마이크로리터의 클로로폼을 세포 리세이트에 추가하고 반전으로 혼합했습니다. 이 시점에서, 우리는 lysate실온에서 3 분 동안 앉아 다음 원심 분리 모든 샘플을 4도에서 15 분 동안 고속으로 합니다. 여기에 표시된 것처럼 세 가지 단계에서 위상 분리가 있을 것으로 예상됩니다.RNA는 상층에 앉기 때문에 유기층을 옮기지 않도록 주의를 기울여 수성상을 신선한 튜브로 조심스럽게 전달한다. 이 시점에서, 수성 상에 이소프로판올의 0.5 mL을 추가하고 반전에 의해 신중하게 혼합. 샘플은 RNA 강수량을 보장하기 위해 80도에서 1 시간 배양 될 수 있습니다.고속으로 원심분리시, 여기에 표시된 바와 같이 좋은 RNA 펠릿을 볼 수 있어야 합니다. 조심스럽게 반전이나 파이프팅에 의해 상체를 폐기, 펠릿을 방해하지에주의를 지불. 그런 다음 RNA 펠릿을 75%의 분자 등급 에탄올1mL로 세척합니다.그리고 샘플을 간략하게 소용돌이. 원심 분리시, 좋은 흰색 RNA 펠릿을 검색해야 합니다. 상체를 버리고 RNA 펠릿이 실온에서 15 분 동안 건조하게하십시오.물과 함께 동일한 조건에서 모든 샘플을 풀 의 20 마이크로 리터에서 각 펠릿을 다시 중단합니다. 총 RNA는 이제 폴리-A 선택에 의한 mRNA 절연을 위한 준비가 되어 있습니다. RNA 75 마이크로그램의 각 샘플에 대해, 올리고-DT 자기 구슬의 200 마이크로리터를 준비하고 결합 완충제의 1mL에서 세척하십시오.튜브를 자기 스탠드에 놓고 구슬이 한 믹스 중에 자석에 결합되도록 합니다. 상체를 버리고 두 번째 세척 절차를 반복하십시오. 그런 다음 자기 스탠드에서 구슬을 제거하고 100 마이크로리터의 결합 버퍼로 조심스럽게 다시 중단합니다.이 시점에서, 100 마이크로리터의 물에서 재중단된 알리쿼트 당 RNA의 75 마이크로그램으로 나누어 RNA 샘플을 준비한다. 결합 버퍼 100 마이크로리터를 추가하고 65도에서 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 회전하고 얼음에 배양합니다.그런 다음 각 RNA 샘플에 세척 된 자기 구슬 100 마이크로 리터를 추가하고 실온에서 15 분 동안 회전 바퀴에 바인딩을 허용합니다. 인큐베이션 시 튜브를 다시 마그네틱 랙에 넣고 1분 동안 배양하게 하십시오. 그런 다음 상체를 신선한 튜브로 복구하고 두 번째 격리를 위해 옆으로 유지하십시오.200 마이크로리터의 세척 완충제로 구슬을 두 번 씻은 다음 용출을 진행합니다. 마그네틱 비드에서 폴리-A선택 RNA를 elute하기 위해 각 시료와 파이펫에 20 마이크로리터의 얼음 냉은 TRIS HCl을 신중하게 추가합니다. 그런 다음 2 분 동안 80도에서 샘플을 배양하여 구슬에서 RNA를 방출하십시오.폴리-A선택 RNA를 함유한 상체를 신선한 튜브로 옮기고, 비드 이월을 피하는 데 주의한다. 용출 단계뿐만 아니라 절연 단계는 mRNA 수율을 높이기 위해 두 번 반복되어야한다. mRNA는 이제 단편화 단계에서 meRIP-Seq 파이프라인에 진입하거나 비설피트 변환으로 직접 전환할 준비가 되었습니다.meRIP-Seq 파이프라인을 입력하는 첫 번째 단계는 mRNA 단편화로 구성됩니다. 이를 위해 0.2 mL 튜브에서 18 마이크로 리터의 알리쿼트로 나누어 진 5 마이크로 그램의 mRNA가 필요합니다. 일관된 데이터를 보장하기 위해서는 당시 샘플이 거의 없는 신속하게 신속하게 작업하는 것이 중요합니다.이 실험을 위해, 단편화는 115와 200 뉴클레오티드 사이의 크기의 단편을 얻기 위하여 최적화되었습니다. 그런 다음 각 튜브에 18 마이크로리터를 함유한 단편화 시약 2개를 튜브 벽에 증착하는 데 주의하십시오. 시약과 RNA 사이의 접촉을 동시에 허용하고 15 분 동안 70도에서 배양하기 위해 모든 샘플을 스핀 다운합니다.잠복기가 끝나면 0.5 M EDTA의 두 개의 마이크로리터를 추가하여 반응을 중지하십시오. 이 시점에서, 당신은 선택의 방법으로 단편화 된 mRNA를 정화하고 단편 분석기에 의해 RNA 품질 관리를 진행할 수 있습니다. 이 단계는 선택 사항이지만 RNA 강수량을 참여시키기 전에 조각의 크기를 평가할 수 있습니다.네 번째 차선에서 볼 수 있듯이, 우리는 각각 약 150 뉴클레오티드의 샘플 단편을 모두 얻습니다. 그런 다음 메립-세크를 진행했습니다. 첫 번째 단계는 항m6A 항체 또는 IgG 컨트롤을 가진 커플 A/G 자기 구슬로 구성됩니다.각 반응 계획에 대해, 신선한 튜브로 자기 구슬의 25 마이크로 리터를 전송합니다. 최소 한 개의 m6A 전용 상태와 하나의 제어 조건이 필요합니다. 250 마이크로리터의 IP 버퍼로 구슬 25마이크로리터를 세척합니다.구슬을 위아래로 파이프로 부드럽게 재차질하고 튜브를 자기 랙에 1분 동안 놓아 비드 분리를 허용합니다. 자석 구슬을 흡입하지 않고 한 번 세척 단계를 반복하여 주의를 기울이십시오. 그런 다음 구슬의 원래 부피의 각각 25 마이크로 리터 당 IP 버퍼의 100 마이크로 리터에서 자기 구슬을 다시 일시 중지합니다.각 조건당 하나의 튜브를 준비하고 라벨을 부착합니다. 우리의 경우, 우리는 감염된 상태에 대한 두 개의 튜브, m6A에 대한 하나, IgG 제어를위한 하나, 감염되지 않은 상태에 대한 두 개의 튜브를 해야합니다. 그런 다음 각 튜브에 세척 된 구슬 100 마이크로 리터를 추가합니다.구슬은 이제 특정 항체 또는 IgG 제어와 결합될 준비가 되어 있습니다. 세척된 자기 구슬 100 마이크로리터를 포함하는 각 튜브에 특정 항m6A 항체 또는 안티 IgG 대조군 항체의 5마이크로그램을 추가합니다. 회전 휠에서 튜브를 30분 배양하여 항체 비드 의 연상을 허용합니다.한편, 샘플 준비를 진행한다. 각 계획된 조건에 대해, m6A 특이적 또는 IgG 제어, 당신의 시작 재료는 100 마이크로 리터의 물 재중단 단편화된 mRNA의 2.5 마이크로그램이 될 것입니다. 500 마이크로리터의 최종 반응 부피를 갖도록 각 샘플에 295 마이크로리터의 물을 추가하십시오.그런 다음 샘플 당 총 200 단위의 양에 대한 마이크로 리터 당 40 단위에 농축 RNAase 억제제의 다섯 마이크로 리터를 추가하고 부드럽게 혼합. 마지막으로 각 튜브에 5X 농축 IP 버퍼100 마이크로리터를 추가합니다. 견본은 지금 면역 강수반응에 대한 준비가 되었습니다.회전 휠에서 항체와 결합 된 자기 구슬을 검색하고 아래로 회전합니다. 특정 항체와 결합된 구슬의 각 100 마이크로리터에 이전에 준비된 샘플의 500 마이크로리터를 추가합니다. 구슬을 완전히 재페수 리펜션하기 위해 여러 번 위아래로 파이프를 사용하여 부드럽게 섞습니다.2시간 동안 회전 휠에 해당 또는 meRIP 반응을 4도인 배양합니다. 잠복기가 끝나면 각 튜브를 회전시키고 1분 동안 자기 랙에 놓아 비드 분리를 허용합니다. 그런 다음 언바운드 분획을 제거하고 신선한 튜브에 놓고 필요한 경우 추가 분석을 위해 보관하십시오.랙에서 자석을 제거하고 IP 버퍼의 500 마이크로 리터로 모든 샘플을 다시 일시 중지합니다. 위아래로 파이프를 사용하여 각 샘플을 신중하게 다시 중단합니다. 랙에 자석을 삽입하고 1분 동안 배양한 다음 상체를 조심스럽게 제거합니다.세척을 두 번 반복한 다음 용해로 진행합니다. 샘플의 각 몇 대 한, m6A 특정 및 제어, 정제 된 m6A의 20 밀리머를 포함 하는 용출 버퍼의 225 마이크로 리터를 준비. 그런 다음 샘플당 용출 버퍼 100 마이크로리터를 추가합니다.로커의 4도에서 모든 샘플을 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 모든 m6A 농축 RNA 샘플을 신선한 튜브에 수집하고 두 번째 용출을 진행한다. 선택의 방법으로 m6A 농축 RNA를 정화하고이 시점에서 샘플은 라이브러리 준비 및 시퀀싱을위한 준비가되어 있습니다.m5C 수정을 조사하기 위해 비설피트 변환을 사용합니다. 폴리 아데니어RNA 500 나노그램으로 실험을 시작합니다. 선택 사항이지만, 리보소말 표현을 보장하기 위해 다A 고갈 된 RNA의 샘플 500 피코그램과 시퀀싱 시동 시 비황산염 전환율을 평가할 수 있습니다.시료를 20마이크로리터의 최종 부피로 조정한 다음 각 샘플에 RNA 변환 시약 130마이크로리터를 추가합니다. 위아래로 파이프를 사용하여 조심스럽게 섞어서 모든 샘플을 회전시켜 튜브 측면에 물방울이 남아 있지 않은지 확인합니다. PCR 기계에 모든 샘플을 5분 동안 70도, 45분 동안 54도에서 비황피트 변환을 3사이클동안 배양합니다.빈 컬럼, RNA 결합 버퍼 250 마이크로리터, 비설피테 변환 시료의 150 마이크로리터에 직접 추가하여 열 내 분해를 수행합니다. 시료를 위아래로 피펫팅하여 혼합하지만 컬럼 필터를 건드리지 않음으로써 주의를 기울입니다. 샘플 RNA 결합 완충 혼합물에 95-100%에탄올의 400 마이크로리터를 컬럼에 직접 첨가한다.캡을 닫고 반전으로 즉시 섞습니다. 샘플을 30초 동안 회전하고 흐름을 폐기합니다. 세탁 버퍼로 컬럼을 씻은 다음 각 열의 중앙에 200 마이크로리터의 황량 솔루션을 추가합니다.모든 샘플을 실온에서 30분 동안 배양하십시오. 30초 동안 샘플을 회전한 다음 두 번의 세척을 진행합니다. 각 시료에 400 마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고, 원심분리기는 최대 속도로 30초 동안 추가하고 흐름을 폐기합니다.컬럼을 새로운 빈 튜브에 넣고 비설피테 변환된 RNA를 20 마이크로리터의 물로 엘로트합니다. RT-qPCR에 의한 비설피테 변환 효율을 제어한 다음 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 진행합니다. 생체 정보 분석 시 이 워크플로우를 통해 얻을 수 있는 몇 가지 결과의 예가 있습니다.여기서 우리는 HIV 감염 된 세포의 epitranscriptome 대 비 감염 된 세포를 비교합니다. 24 시간 감염 후. A 패널에서 m6A 에피레마메를 탐색하는 결과를 볼 수 있습니다.이 그래프에서는 meRIP-Seq 분석에 m6A가 농축된 판독을 플롯합니다. 우리는 아연 손가락이 감염 후 24 시간 과다 하게 되어 있는 것을 잘 볼 수 있습니다. 패널에서 m5C 에피레메르아메 조사에 대해 동일한 유형의 분석을 수행 B.In 이 그래프, 모든 비메틸화 시토신은 빨간색으로 표시되고, m5C 메틸화된 사이토신의 비율은 파란색으로 나타났다.당신이 볼 수 있듯이, PHLPP1, 하이퍼 메틸화 된 세 가지 사이토신 모두 24 시간 후 HIV 감염. 전반적으로, 이 워크플로우는 감염된 세포의 M6A 와 m5C epitranscriptome를 모두 조사할 수 있고 바이러스 성 입자에도 적용될 수 있습니다. 바이러스 감염의 이해는 호스트 epitranscriptomic 풍경을 수정할 수 있습니다 우리에게 규제의 새로운 층에 대한 액세스를 줄 것이다.바이러스 감염에 대한 차동 메틸화 된 성적 증명서의 조사는 물론 새로운 치료 개입을위한 귀중한 자원을 제공 할 것입니다. 아래 링크에서 시간이 지남에 따라 HIV 감염시 차동 메틸화 된 성적 증명서의 조사를위한 오픈 액세스 리소스를 찾을 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

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연구

생물학

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