Name: exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv
Uploaded: 2022-03-05T13:00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Swiss National Science Foundation (tilskudd 31003A_166412 og 314730_188877).

<ol>
	<li>Machnicka, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways--2013+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways--2013 update.</a> Nucleic Acids Research. 41, 262-267 (2013).</li><li>Zaccara, S., Ries, R. J., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading,+writing+and+erasing+mRNA+methylation.">Reading, writing and erasing mRNA methylation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 608-624 (2019).</li><li>Davalos, V., Blanco, S., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Messenger+RNA+Modifications.">SnapShot: Messenger RNA Modifications.</a> Cell. 174 (2), 498 (2018).</li><li>Saletore, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+birth+of+the+Epitranscriptome:+deciphering+the+function+of+RNA+modifications.">The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).</li><li>Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications.">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2017).</li><li>Netzband, R., Pager, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+marks:+Emerging+modulators+of+RNA+virus+gene+expression.">Epitranscriptomic marks: Emerging modulators of RNA virus gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (3), 1576 (2020).</li><li>Pereira-Montecinos, C., Valiente-Echeverria, F., Soto-Rifo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+regulation+of+viral+replication.">Epitranscriptomic regulation of viral replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (4), 460-471 (2017).</li><li>Lichinchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+human+and+viral+m(6)A+RNA+methylomes+during+HIV-1+infection+of+T+cells.">Dynamics of the human and viral m(6)A RNA methylomes during HIV-1 infection of T cells.</a> Nature Microbiology. 1, 16011 (2016).</li><li>Courtney, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+Addition+of+m(5)C+to+HIV-1+Transcripts+Regulates+Viral+Gene+Expression.">Epitranscriptomic Addition of m(5)C to HIV-1 Transcripts Regulates Viral Gene Expression.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).</li><li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+m(6)A+Editing+of+HIV-1+mRNAs+Enhances+Viral+Gene+Expression.">Posttranscriptional m(6)A Editing of HIV-1 mRNAs Enhances Viral Gene Expression.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 675-685 (2016).</li><li>Tirumuru, N., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+envelope+proteins+up-regulate+N+(6)-methyladenosine+levels+of+cellular+RNA+independently+of+viral+replication.">HIV-1 envelope proteins up-regulate N (6)-methyladenosine levels of cellular RNA independently of viral replication.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3249-3260 (2019).</li><li>Tirumuru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+of+HIV-1+RNA+regulates+viral+infection+and+HIV-1+Gag+protein+expression.">N(6)-methyladenosine of HIV-1 RNA regulates viral infection and HIV-1 Gag protein expression.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell.">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> Frontiers in Virology. 1 (11), (2021).</li><li>Khoddami, V., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+target+profiling+of+RNA+cytosine+methyltransferases+using+the+mechanism-based+enrichment+procedure+Aza-IP.">Transcriptome-wide target profiling of RNA cytosine methyltransferases using the mechanism-based enrichment procedure Aza-IP.</a> Nature Protocols. 9 (2), 337-361 (2014).</li><li>Hussain, S., Aleksic, J., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (11), 215 (2013).</li><li>Dominissini, D., Moshitch-Moshkovitz, S., Salmon-Divon, M., Amariglio, N., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+mapping+of+N6-methyladenosine+by+m6A-seq+based+on+immunocapturing+and+massively+parallel+sequencing.">Transcriptome-wide mapping of N6-methyladenosine by m6A-seq based on immunocapturing and massively parallel sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (1), 176-189 (2013).</li><li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq.">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li><li>Shobbir Hussain, J. A., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (215), (2013).</li><li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+5-methylcytosine+profiles+in+poly(A)+RNA+from+mouse+embryonic+stem+cells+and+brain.">Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain.</a> Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).</li><li>Endrullat, C., Gl&#246;kler, J., Franke, P., Frohme, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+and+quality+management+in+next-generation+sequencing.">Standardization and quality management in next-generation sequencing.</a> Applied &amp; Translational Genomics. 10, 2-9 (2016).</li><li>Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+cytosine+methylation+analysis+by+bisulfite+sequencing.">RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 12 (2009).</li><li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell.">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> biorxiv. 1 (11), (2021).</li><li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+noncoding+RNA.">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and noncoding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li><li>Aschenbrenner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+DNA+Polymerase+for+Direct+m(6)+A+Sequencing.">Engineering of a DNA Polymerase for Direct m(6) A Sequencing.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 57 (2), 417-421 (2018).</li><li>Didion, J. P., Martin, M., Collins, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atropos:+specific,+sensitive,+and+speedy+trimming+of+sequencing+reads.">Atropos: specific, sensitive, and speedy trimming of sequencing reads.</a> PeerJ. 5, 3720 (2017).</li><li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISAT:+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements.">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Okonechnikov, K., Conesa, A., Garc&#237;a-Alcalde, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualimap+2:+advanced+multi-sample+quality+control+for+high-throughput+sequencing+data.">Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., K&#228;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet Journal. 17 (1), (2011).</li><li>Shen, W., Le, S., Li, Y., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeqKit:+A+Cross-Platform+and+Ultrafast+Toolkit+for+FASTA/Q+File+Manipulation.">SeqKit: A Cross-Platform and Ultrafast Toolkit for FASTA/Q File Manipulation.</a> PLOS ONE. 11 (10), 0163962 (2016).</li><li>Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=meRanTK:+methylated+RNA+analysis+ToolKit.">meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit.</a> Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Rollen til RNA-modifikasjoner i virusinfeksjon er fortsatt stort sett ukjent. En bedre forståelse av epitranskriptomiske modifikasjoners rolle i sammenheng med virusinfeksjon kan bidra til å søke nye antivirale behandlingsmål.
I dette arbeidet tilbyr vi en komplett arbeidsflyt som tillater undersøkelse av m6A og m5C epitranscriptomes av infiserte celler. Avhengig av det biologiske spørsmålet anbefaler vi å bruke poly-A-valgt RNA som startmateriale. Selv om det er valgfritt, da rørledningen kan brukes med total RNA, er det viktig å huske på at rRNAer så vel som små RNAer er høyt modifisert og inneholder et viktig antall metylerte rester. Dette kan føre til redusert kvalitet og mengde meningsfulle sekvenseringsdata.
Men hvis fokuset i studien er ikke-poly-adenylert RNA, bør RNA-ekstraksjonstrinnet tilpasses for å unngå å kaste bort små RNA (i tilfelle kolonnebasert RNA-ekstraksjon) og til privilegier ribosom-uttømmingsteknikker i stedet for poly-A-valg for å komme inn i rørledningen.
For å sikre høy kvalitet RNA, riktig fragmentering og egnet m6A-beriket og BS konvertert RNA kvalitet for bibliotek forberedelse anbefaler vi sterkt å bruke en fragmentanasator eller en bioanalyse. Dette utstyret er imidlertid ikke alltid tilgjengelig. Som et alternativ kan kvaliteten på RNA, mRNA og størrelsen på fragmentert RNA også vurderes ved visualisering på agarose gel. Alternativt kan bibliotekforberedelse utføres uten tidligere vurdering av RNA-mengde.
Vi brukte den antistoffbaserte MeRIP-Seq16-teknikken til å utforske det epitranskriptomiske landskapet m6A. Denne teknikken er basert på RNA immunoprecipitation og er vellykket; Noen trinn trenger imidlertid nøye optimalisering og kan være kritisk. Selv om m6A metylering har blitt beskrevet å forekomme hovedsakelig innenfor konsensussekvensen RRA * CH, er dette motivet svært hyppig langs mRNA-molekyler og tillater ikke presis identifisering av det metylerte stedet. Det er derfor viktig å oppnå en reproduserbar og konsistent RNA-fragmentering, som genererer små RNA-fragmenter, for å forbedre den RIP-baserte oppløsningen. I denne protokollen anbefaler vi en optimalisert prosedyre som gir reproduserbare og konsistente resultater i vår eksperimentelle setting; Dette fragmenteringstrinnet kan imidlertid trenge ytterligere optimalisering i henhold til bestemte eksempelfunksjoner.
Nylig ble en ny teknikk som tillater m6A direkte sekvensering beskrevet. Den er basert på bruk av spesifikke omvendte transkripsjonsvarianter som viser unike RT-signaturer som svar på å møte m6A RNA-modifikasjon24. Denne teknologien, ved nøye optimalisering, kan omgå den største begrensningen som MeRIP-Seq står overfor (redusere mengden innledende materiale og tillate en høyere oppløsning). For å utforske m5C modifikasjonen bestemte vi oss for å bruke bisulfittkonverteringsteknikken for å oppdage ved nukleotidoppløsning de modifiserte C-rester. For å redusere den falske positive frekvensen på grunn av tilstedeværelsen av RNA sekundære strukturer, utførte vi 3 sykluser med denaturering / bisulfittkonvertering og ytterligere kontroll bisulfitt konverteringsfrekvensytelse takket være bruk av ERCC-spike-in-kontroller. En av begrensningene knyttet til denne teknikken er at bisulfittkonvertering er veldig hard og tre sykluser med denaturering / bisulfittkonvertering kan forringe noe RNA og dermed redusere oppløsningen. I vår setting valgte vi imidlertid å nøye oss med en potensielt litt lavere oppløsning for å øke kvaliteten på datasettet.
Takket være disse optimaliseringene og kontrollene kunne vi tilby en pålitelig og god arbeidsflyt som kan utnyttes til å undersøke det epitranskriptomiske landskapet og dets endring i sammenheng med virusinfeksjoner, vertspatogeninteraksjoner eller eksponering for spesifikke behandlinger.

Det er lenge kjent at RNA-molekyler kan modifiseres, og mer enn 150 posttranskripsjonelle modifikasjoner har blitt beskrevet til dags dato1. De består i tillegg av kjemiske grupper, hovedsakelig metylgrupper, til praktisk talt enhver posisjon av pyrimidin- og purinringene til RNA-molekyler2. Slike posttranskripsjonelle modifikasjoner har allerede vist seg å være svært beriket i overføring RNA (tRNA) og ribosomal RNA (rRNA) og har nylig blitt beskrevet på mRNA molekyler også.
Fremveksten av nye teknologier, som Next Generation Sequencing (NGS), og produksjon av spesifikke antistoffer som gjenkjenner bestemte kjemiske modifikasjoner tillatt, for første gang, undersøkelsen av plasseringen og frekvensen av spesifikke kjemiske modifikasjoner på et transkripsjonsnivå. Disse fremskrittene har ført til en bedre forståelse av RNA modifikasjoner og til kartlegging av flere modifikasjoner på mRNA molekyler3,4.
Mens epigenetikk undersøker rollen som DNA- og histonemodifikasjoner i transkripsjonsregulering, fokuserer epitranskriptomikk på en lignende måte på RNA-modifikasjoner og deres rolle. Undersøkelsen av epitranskriptomiske modifikasjoner gir nye muligheter til å fremheve nye reguleringsmekanismer som kan stille inn en rekke cellulære prosesser (dvs. RNA-skjøting, eksport, stabilitet og oversettelse)5. Det var derfor ingen stor overraskelse at nyere studier avdekket mange epitranskriptomiske modifikasjoner ved virusinfeksjon i både cellulære og virale RNAer6. Virus undersøkt så langt inkluderer både DNA og RNA virus; blant dem kan HIV betraktes som et banebrytende eksempel. Til sammen kan oppdagelsen av RNA-metylering i sammenheng med virusinfeksjoner tillate undersøkelse av ennå ikke-innskrevne mekanismer for viralt uttrykk eller replikering, og dermed gi nye verktøy og mål for å kontrollere dem7.
Innen HIV-epitranskriptomikk har modifikasjoner av virale transkripsjoner blitt mye undersøkt og har vist at tilstedeværelsen av denne modifikasjonen var gunstig for viral replikasjon8,9,10,11,12,13. Til dags dato kan ulike teknikker brukes til å oppdage epitranscriptomiske merker på transkripsjonsnivå. De mest brukte teknikkene for m6A-identifisering er avhengige av immunutfellingsteknikker som MeRIP-Seq og miCLIP. Mens MeRIP-Seq er avhengig av RNA-fragmentering for å fange fragmenter som inneholder metylerte rester, er miCLIP basert på genereringen av α-m6A antistoffspesifikke signaturmutasjoner ved RNA-antistoff UV-krysskobling, og tillater dermed en mer presis kartlegging.
Påvisning av m5C-modifikasjon kan oppnås enten ved antistoffbaserte teknologier som ligner på m6A-deteksjon (m5C RIP), eller ved bisulfittkonvertering eller av AZA-IP eller miCLIP. Både Aza-IP og m5C miCLIP bruker en spesifikk metyltransferase som agn for å målrette RNA mens du går gjennom RNA-metylering. I Aza-IP blir målceller eksponert for 5-azacytidin, noe som resulterer i tilfeldig innføring av cytidin analoge 5-azacytidinsteder i nascent RNA. I miCLIP er NSun2 metyltransferase genetisk modifisert for å huse C271A-mutasjonen14,15.
I dette arbeidet fokuserer vi på dobbel karakterisering av m6A- og m5C-modifikasjoner i infiserte celler, ved hjelp av HIV som modell. Ved metologisk optimalisering har vi utviklet en arbeidsflyt som kombinerer metylert RNA-immunoprecipitation (MeRIP) og RNA bisulfittkonvertering (BS), slik at samtidig utforskning av m6A og m5C epitranscriptomiske merker på et transkripsjonsmessig bredt nivå, i både cellulære og virale sammenhenger. Denne arbeidsflyten kan implementeres på cellulære RNA-ekstrakter så vel som på RNA isolert fra viruspartikler.
Metylert RNA ImmunoPrecipitation (MeRIP)16 tilnærming som tillater undersøkelse av m6A på transkripsjonsnivå er godt etablert og en rekke m6A-spesifikke antistoffer er kommersielt tilgjengelige til dags dato17. Denne metoden består i selektiv fangst av m6A-inneholdende RNA-stykker ved hjelp av et m6A-spesifikt antistoff. De to store ulempene ved denne teknikken er (i) den begrensede oppløsningen, som er svært avhengig av størrelsen på RNA-fragmenter og dermed gir en omtrentlig plassering og region som inneholder metylerte rester, og (ii) den store mengden materiale som trengs for å utføre analysen. I den følgende optimaliserte protokollen standardiserte vi fragmentstørrelsen til ca. 150 nt og reduserte mengden startmateriale fra 10 μg poly-A-valgt RNA, som for tiden er anbefalt mengde startmateriale, til bare 1 μg poly-A-valgt RNA. Vi maksimerte også utvinningseffektiviteten til m6A RNA-fragmenter bundet til spesifikke antistoffer ved hjelp av en elution ved en konkurransetilnærming med et m6A-peptid i stedet for mer konvensjonelle og mindre spesifikke elutionmetoder ved hjelp av fenolbaserte teknikker eller proteinase K. Hovedbegrensningen i denne RIP-baserte analysen forblir imidlertid den suboptimale oppløsningen som ikke tillater identifisering av det presise modifiserte A-nukleotidet.
Analyse av m5C-merket kan for tiden utføres ved hjelp av to forskjellige tilnærminger: en RIP-basert metode med m5C-spesifikke antistoffer og RNA bisulfittkonvertering. Siden RIP bare tilbyr begrenset oppløsning på identifisering av metylerte rester, brukte vi bisulfittkonvertering som kan tilby enkel nukleotidoppløsning. RNA-eksponering for bisulfitt (BS) fører til cytosindeaminering, og konverterer dermed cytosinrester til uracil. Således, under RNA bisulfitt konvertering reaksjon, hver ikke-metylert cytosin er deaminert og konvertert til uracil, mens tilstedeværelsen av en metyl gruppe i posisjon 5 av cytosin har en beskyttende effekt, forhindrer BS-indusert deaminering og bevaring av cytosinrester rester. Den BS-baserte tilnærmingen gjør det mulig å oppdage et m5C modifisert nukleotid ved enkel basisoppløsning og for vurdering av metyleringsfrekvensen for hver transkripsjon, og gir innsikt i m5C modifikasjonsdynamikk18. Hovedbegrensningen av denne teknikken er imidlertid avhengig av den falske positive frekvensen av metylerte rester. Faktisk er BS-konvertering effektiv på enkeltstrengede RNA med tilgjengelige C-rester. Tilstedeværelsen av en stram RNA sekundærstruktur kan imidlertid maskere N5C-posisjonen og hemme BS-konvertering, noe som resulterer i ikke-metylerte C-rester som ikke konverteres til U-rester, og dermed falske positiver. For å omgå dette problemet og minimere den falske positive frekvensen, brukte vi 3 runder med denaturering og bisulfittkonverteringssykluser19. Vi introduserte også 2 kontroller i prøvene for å muliggjøre estimering av bisulfittkonverteringseffektivitet: vi spike-in ERCC-sekvenseringskontroller (ikke-metylerte standardiserte og kommersielt tilgjengelige sekvenser)20 samt poly-A-utarmede RNAer for å vurdere bisulfittkonverteringsfrekvens på den ene siden, og for å verifisere av RT-PCR tilstedeværelsen av et kjent og godt bevart metylert sted, C4447, på 28S ribosomal RNA derimot21.
Innen virologi muliggjør kobling av disse to epitranskriptomiske undersøkelsesmetodene med neste generasjons sekvensering og nøyaktige bioinformatiske analyser den grundige studien av m6A- og m5C-dynamikken (dvs. RNA-modifikasjon temporale endringer som kan oppstå ved virusinfeksjon og kan avdekke en rekke nye terapeutisk relevante mål for klinisk bruk).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrime Pfx SuperMix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12344-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ RNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>EZR5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-472-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-471-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina TruSeq Stranded mRNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Beads A/G Blend</td>
			<td>Merck</td>
			<td>16-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-Methyladenosine, 5&#8242;-monophosphate sodium salt (m6A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2780-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse IgG</td>
			<td>Merk</td>
			<td>12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo(dT)25</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61005,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRapace</td>
			<td>Stratec</td>
			<td>1020220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick RNA Viral Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Fragmentation Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv

Rollen til RNA-modifikasjoner i biologiske prosesser har vært fokus for et økende antall studier de siste årene og er i dag kjent som epitranscriptomics. Blant annet er N6-metyladenosin (m6A) og 5-metylcytosin (m5C) RNA-modifikasjoner beskrevet på mRNA-molekyler og kan ha en rolle i modulering av cellulære prosesser. Epitranscriptomics er dermed et nytt lag av regulering som må vurderes i tillegg til transkripsjonsanalyser, da det også kan endres eller moduleres ved eksponering for kjemiske eller biologiske midler, inkludert virusinfeksjoner.
Her presenterer vi en arbeidsflyt som tillater analyse av det felles cellulære og virale epitranskriptomiske landskapet på m6A- og m5C-merkene samtidig, i celler som er infisert eller ikke med det menneskelige immunsviktviruset (HIV). Ved mRNA-isolasjon og fragmentering fra HIV-infiserte og ikke-infiserte celler brukte vi to forskjellige prosedyrer: MeRIP-Seq, en RNA-immunoprecipitation-basert teknikk, for å berike for RNA-fragmenter som inneholder m6A-merket og BS-Seq, en bisulfittkonverteringsbasert teknikk, for å identifisere m5C-merket med en enkelt nukleotidoppløsning. Ved metyleringsspesifikk fangst er RNA-biblioteker forberedt for sekvensering med høy gjennomstrømning. Vi utviklet også en dedikert bioinformatikkpipeline for å identifisere differensialt metylerte (DM) transkripsjoner uavhengig av deres basale uttrykksprofil.
Totalt sett tillater metodikken utforskning av flere epitranskriptomiske merker samtidig og gir et atlas av DM-transkripsjoner ved virusinfeksjon eller annen celleperturbasjon. Denne tilnærmingen gir nye muligheter til å identifisere nye spillere og nye mekanismer for cellerespons, for eksempel cellulære faktorer som fremmer eller begrenser viral replikering.

Denne arbeidsflyten har vist seg nyttig for å undersøke rollen som m6A- og m5C-metylering i sammenheng med HIV-infeksjon. For dette brukte vi en CD4 + T cellelinjemodell (SupT1) som vi enten infiserer med HIV eller forlot ubehandlet. Vi startet arbeidsflyten med 50 millioner celler per tilstand og oppnådde i gjennomsnitt 500 μg totalt RNA med et RNA-kvalitetsnummer på 10 (figur 1A-B). Ved valg av poly-A hentet vi mellom 10 og 12 μg mRNA per tilstand (som representerer ca. 2 % av total RNA) (figur 1B). På dette tidspunktet brukte vi 5 μg poly-A-valgt RNA for MeRIP-Seq-rørledningen og 1 μg for BS-Seq-rørledningen. Siden HIV RNA er poly-adenylert, er det ikke nødvendig med ytterligere tiltak, og MeRIP-Seq- og BS-Seq-prosedyrer kan brukes direkte.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig01.jpg"> Figur 1: RNA-forberedelse for nedstrømsapplikasjoner. A) Arbeidsflyt som viser RNA-forberedelse og distribusjon for samtidige MeRIP-Seq- og BS-Seq-rørledninger. Hver fylte sekskantede figur representerer en RNA-endringstype, for eksempel m6A (grønn) eller m5C (rosa). Mengder RNA-materiale som trengs for å utføre eksperimentet er indikert. B) Representative resultater som viser forventede RNA-distribusjonsprofiler (størrelse og mengde) ved total RNA-ekstraksjon (øvre panel) og poly-A-valg (nedre panel). Prøver ble lastet på fragmentanalysatoren med standard følsomhetssett for å vurdere RNA-kvalitet før de gikk inn i spesifikke MeRIP-Seq- og BS-Seq-prosedyrer. RQN: RNA kvalitetsnummer; nt: nukleotider. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
MeRIP-Seq rørledning er en RNA immunoprecipitation-basert teknikk som tillater undersøkelse av m6A modifikasjon langs RNA molekyler. For dette blir RNA først fragmentert og deretter inkubert med m6A-spesifikke antistoffer koblet til magnetiske perler for immunoprecipitation og fangst. MeRIP-berikede RNA-fragmenter og den uberørte (inngangsfraksjonen) blir deretter sekvensert og sammenlignet med å identifisere m6A-modifiserte RNA-regioner og dermed m6A-metylerte transkripsjoner (figur 2A). Oppløsningen av teknikken er avhengig av effektiviteten til RNA-fragmentering. Faktisk gir kortere fragmenter en mer presis lokalisering av m6A-rester. Her ble cellulære poly-A-utvalgte RNAer og virale RNAer utsatt for ionbasert fragmentering med RNA-fragmenteringsbuffer i løpet av 15 minutter i et 20 μL sluttvolum for å oppnå RNA-fragmenter på 100-150 nt. Fra og med 5 μg mRNA gjenvunnet vi 4,5 μg fragmentert RNA, tilsvarende en utvinningsgrad på 90% (figur 2B). Vi brukte 100 ng fragmentert, renset RNA som inngangskontroll, utsatt direkte for bibliotekforberedelse og sekvensering. Den resterende RNA (~ 4,4 μg) ble behandlet i henhold til MeRIP-Seq-rørledningen, som starter med inkubasjon av fragmentert RNA med perler bundet enten til anti-m6A-spesifikke antistoffer eller anti-IgG-antistoffer som kontroll. m6A-spesifikk RIP (MeRIP) på 2,5 μg fragmentert RNA tillot henting rundt 15 ng m6A-beriket materiale som gjennomgikk bibliotekforberedelse og sekvensering (figur 2B). RIP med anti-IgG-kontroll ga som forventet ikke nok RNA til å tillate videre analyse (figur 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig02.jpg"> Figur 2: MeRIP-Seq pipeline. A) Skjematisk representasjon av MeRIP-Seq arbeidsflyt og inndatakontroll. Ved valg av poly-A ble prøver fragmentert i 120-150 nt stykker og, enten direkte utsatt for sekvensering (100 ng, inngangskontroll), eller brukt til RNA-immunoprecipitation (2,5 μg, RIP) med anti-m6A spesifikt antistoff eller anti-IgG-antistoff som negativ kontroll før sekvensering. B) Representative resultater som viser forventede RNA-distribusjonsprofiler (størrelse og mengde) ved fragmentering (øvre panel) og RIP (nedre paneler, MeRIP: venstre, IgG-kontroll: høyre). Prøver ble lastet på fragmentanalysator for å evaluere RNA-kvalitet og konsentrasjon før videre behandling til bibliotekforberedelse og sekvensering. Fragmentert RNA-analyse ble utført ved hjelp av RNA standard følsomhetssett mens immunoprecipitated RNA brukte høysensitivitetssettet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
BS-Seq rørledning tillater utforskning av m5C RNA modifikasjon ved nukleotidoppløsning og fører til identifisering av m5C-metylerte transkripsjoner. Ved bisulfittkonvertering omdannes ikke-metylerte cytosiner til uracil, mens metylerte cytosiner forblir uendret (figur 3A). På grunn av de tøffe forholdene for bisulfittkonverteringsprosedyren (dvs. høy temperatur og lav pH), blir konverterte mRNAer sterkt degradert (figur 3B), men dette forstyrrer ikke bibliotekforberedelsene og sekvenseringen. Bisulfittkonvertering er bare effektiv på enkeltstrenget RNA og kan dermed potensielt hindres av sekundære dobbeltstrengede RNA-strukturer. For å evaluere effektiviteten av C-U-konvertering introduserte vi to kontroller. Som en positiv kontroll benyttet vi oss av den tidligere beskrevne tilstedeværelsen av en svært metylert cytosin i posisjon C4447 av 28S rRNA23. Ved RT-PCR-forsterkning og sekvensering av et fragment på 200 bp rundt det metylerte stedet kunne vi observere at alle cytosiner ble konvertert til uracils, og dermed vises som tymidiner i DNA-sekvensen, bortsett fra cytosinet i posisjon 4447 som forble uendret. Som en kontroll for bisulfittkonverteringsfrekvensen brukte vi kommersielt tilgjengelige syntetiske ERCC RNA-sekvenser. Denne blandingen består i et basseng med kjente, ikke-metylerte og poly-adenylerte RNA-sekvenser, med en rekke sekundære strukturer og lengder. Etter bibliotekforberedelse og sekvensering fokuserte vi på disse ERCC-sekvensene for å beregne konverteringsfrekvensen, som kan utføres ved å telle antall konverterte C blant de totale C-rester i alle ERCC-sekvensene og i hvert utvalg. Vi oppnådde en konverteringsfrekvens på 99,5%, noe som bekrefter effektiviteten og suksessen til bisulfittkonverteringsreaksjonen (figur 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig03.jpg"> Figur 3: BS-Seq rørledning. A) Skjematisk representasjon av BS-Seq arbeidsflyt. Ved poly-A-utvalg blir prøver eksponert for bisulfitt, noe som resulterer i C til U-konvertering (på grunn av deaminering) for ikke-metylerte C-rester. Metylerte C-rester (m5C) påvirkes derimot ikke av bisulfittbehandling og forblir uendret. B) Representativt resultat av bisulfitt konvertert RNA-distribusjonsprofil (størrelse og mengde) ved analyse på fragmentanalysator med et standard følsomhetssett. C) Elektroferogram som viser representativ sekvenseringsresultat av RT-PCR-amplikon i regionen rundt den 100% metylerte C i posisjon 4447 i 28S rRNA (uthevet i blått). Til sammenligning ble C-rester av referansesekvensen identifisert som T-rester i amlikonsekvensen på grunn av bisulfittkonverteringssuksess. D) Evaluering av C-U konverteringsfrekvens ved analyse av ERCC-spike-in sekvenser i HIV-infiserte og ikke-infiserte celler. Den gjennomsnittlige konverteringsfrekvensen er på 99,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
M6A-berikede prøver, bisulfittkonledede prøver og inngangskontroller behandles videre for biblioteksforberedelse, sekvensering og bioinformatisk analyse (figur 4). I henhold til eksperimentell design og biologiske spørsmål som er adressert, kan flere bioinformatiske analyser brukes. Som prinsippbevis her viser vi representative resultater fra en potensiell anvendelse (dvs. differensialmetyleringsanalyse), som fokuserer på identifisering av differensialt metylerte transkripsjoner indusert ved HIV-infeksjon. Kort fortalt undersøkte vi m6A- eller m5C-metyleringsnivået av transkripsjoner, uavhengig av genuttrykksnivå, i både ikke-infiserte og HIV-infiserte celler, for å forstå rollen til RNA-metyleringer i løpet av viral livssyklus. Ved normalisering av genuttrykk identifiserte vi at ZNF469-transkripsjonen var differensialt m6A-metylert i henhold til infeksjonsstatusen, faktisk ble denne transkripsjonen ikke metylert i ikke-infiserte celler mens den viste flere metylerte topper ved HIV-infeksjon (figur 5A). En lignende differensialmetyleringsanalyse på m5C viste at PHLPP1-transkripsjonen inneholdt flere metylerte rester, som har en tendens til å bli oftere metylert i HIV-tilstanden (figur 5B). I denne sammenhengen tyder begge analysene på at HIV-infeksjon påvirker cellulær epitranskriptom.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig04.jpg"> Figur 4: Skjematisk representasjon av den bioinformatiske arbeidsflyten for analyse av m6A- og m5C-data <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig04large.jpg" target="_blank">. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig05.jpg"> Figur 5: Eksempel på differensialt metylerte transkripsjoner ved infeksjon. A) Representativt resultat som viser m6A-metylering av ZNF459-transkripsjon i HIV-infiserte (grønne) og ikke-infiserte (grå) celler. Toppintensitet (ved subtraksjon av inndatauttrykk) vises på y-aksen og posisjonen i kromosomet langs x-aksen. Differensial metyleringsanalyse viser at ZFN469-transkripsjon er hypermetylert ved HIV-infeksjon. B) Representativt resultat av m5C metylert gen i HIV-infiserte (øvre kjørefelt) og ikke-infiserte (nedre kjørefelt) celler. Høyden på hver stolpe representerer antall lesninger per nukleotid og tillater dekningsvurdering. Hver C rester i representert i rødt, og andelen metylert C er representert i blått. Den nøyaktige metyleringshastigheten (%) rapporteres over hver C-rest. Piler fremhever statistisk signifikant differensialt metylerte C. Prøver ble visualisert ved hjelp av IGV-visningsprogram. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Rollen til RNA-modifikasjoner i virusinfeksjoner begynner å bli utforsket og kan markere nye viral-vert interaksjonsmekanismer. I dette arbeidet gir vi en rørledning for å undersøke m6A- og m5C RNA-modifikasjoner i sammenheng med virusinfeksjoner.

Utforske m6A og m5C Epitranscriptomes ved virusinfeksjon: et eksempel med HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

Hei, i denne videoen vil vi vise deg hvordan du utforsker m6A og m5C epitranscriptomes ved virusinfeksjon. For å starte eksperimentet trenger du 50 millioner celler for de ikke-infiserte og 50 millioner for den infiserte tilstanden. For å få et datasett av høy kvalitet ved analyse, må du oppnå en universell infeksjon.Her smitter vi disse cellene med en HIV-basert vektor og måler den viralt kodede GFP av FACS. I dette tilfellet hadde vi 80% av infiserte celler og fortsatte med arbeidsflyten som startet med total RNA-utvinning. Så vi delte cellene i aliquots på 10 millioner hver og lyse dem i 1 ml Trizol.Deretter la vi til 200 mikroliter kloroform i cellelyset og blandet ved inversjon. På dette tidspunktet lar vi lysate sitte i tre minutter ved romtemperatur og deretter sentrifugere alle prøver med høy hastighet i 15 minutter ved fire grader. Du forventer å se en faseseparasjon i tre forskjellige faser, som vist her.RNA sitter i den øvre fasen, så overfør forsiktig den vandige fasen til et friskt rør ved å være oppmerksom på ikke å overføre det organiske laget. På dette tidspunktet legger du til 0,5 ml isopropanol i den vandige fasen og blander forsiktig ved inversjon. Prøver kan deretter inkuberes en time ved 80 grader for å sikre RNA-nedbør.Ved sentrifugering i høy hastighet, bør du kunne se en fin RNA pellet som vist her. Kast forsiktig supernatanten enten ved inversjon eller ved pipettering, vær oppmerksom på ikke å forstyrre pelletsen. Vask deretter RNA-pelletsen med en ml 75% molekylært etanol.Og virvel prøven kort. Ved sentrifugering, sørg for at du henter en fin hvit RNA pellets. Kast supernatanten og la RNA-pelletsen tørke i 15 minutter ved romtemperatur.Resuspend hver pellets i 20 mikroliter vann og basseng alle prøve fra samme tilstand sammen. Total RNA er nå klar for mRNA-isolasjon ved hjelp av poly-A-utvalg. For hver prøve på 75 mikrogram RNA, lag 200 mikroliter oligo-DT magnetiske perler og vask dem i en ml bindingsbuffer.Plasser røret på et magnetisk stativ og la perlene binde seg til magneten under en blanding. Kast supernatanten og gjenta prosedyren for en ny vask. Fjern deretter perlene fra de magnetiske stativene og resuspender dem forsiktig i 100 mikroliter bindingsbuffer.På dette tidspunktet forbereder du RNA-prøven ved å dele dem i 75 mikrogram RNA per aliquot resuspendert i 100 mikroliter vann. Tilsett 100 mikroliter bindingsbuffer og inkuber i to minutter ved 65 grader. Deretter snurrer du ned prøvene og inkuberer på is.Tilsett deretter 100 mikroliter vaskede magnetiske perler til hver RNA-prøve og la innbinding på et roterende hjul i 15 minutter ved romtemperatur. Ved inkubasjon, plasser røret tilbake i et magnetisk stativ og la dem inkubere i ett minutt. Deretter gjenoppretter du supernatanten i et friskt rør og holder det til side for en andre runde isolasjon.Vask perlene to ganger med 200 mikroliter vaskebuffer og fortsett deretter til elution. For å unngå poly-A valgt RNA fra de magnetiske perlene, tilsett 20 mikroliter iskald TRIS HCl til hver prøve og pipette nøye. Deretter inkuberer du prøvene dine ved 80 grader i to minutter for å frigjøre RNA fra perlene.Overfør supernatanten som inneholder poly-A valgt RNA til et friskt rør, og vær forsiktig med å unngå perleroverbæring. Elution trinnet samt isolasjon trinn bør gjentas to ganger for å øke mRNA utbytte. mRNA er nå klar enten til å gå inn i meRIP-Seq-rørledningen på fragmenteringstrinnet eller gå direkte til bisulfittkonvertering.Det første trinnet for å gå inn i meRIP-Seq-rørledningen består i mRNA-fragmentering. For dette trenger du fem mikrogram mRNA delt inn i aliquots på 18 mikroliter i 0,2 ml rør. For å sikre konsistente data er det viktig å arbeide raskt og med bare få utvalg på det tidspunktet.For dette eksperimentet er fragmentering optimalisert for å oppnå fragment av en størrelse mellom 115 og 200 nukleotider. Tilsett deretter to mikroliter fragmenteringsreagens til hvert rør som inneholder 18 mikroliter mRNA, og vær forsiktig med å deponere dråpen på rørveggen. Spinn ned alle prøver for å tillate kontakt mellom reagenset og RNA samtidig og inkubere ved 70 grader i 15 minutter.Når inkubasjonen er over, stopp reaksjonen ved å legge til to mikroliter på 0,5 M EDTA. På dette tidspunktet kan du rense din fragmenterte mRNA med din valgte metode og fortsette til en RNA-kvalitetskontroll av fragmentanalysator. Dette trinnet er valgfritt, men det vil tillate å vurdere størrelsen på fragmentet før du engasjerer RNA-nedbør.Som du kan se her i fjerde kjørefelt, får vi for både prøvefragmentet vårt på rundt 150 nukleotid hver. Vi fortsatte deretter med meRIP-Seq. Det første trinnet består i par A / G magnetiske perler med enten anti-m6A antistoffer eller IgG-kontroller.For hver reaksjonsplan, overfør 25 mikroliter magnetiske perler til et friskt rør. Vær oppmerksom på at du trenger minst en m6A-spesifikk tilstand og en kontrollbetingelse. Vask hver 25 mikroliter perler med 250 mikroliter IP-buffer.Resuspend beads forsiktig ved å pipettere opp og ned og plassere røret på magnetstativet i ett minutt for å tillate perle separasjon. Fjern og kast supernatanten, vær oppmerksom på ikke å aspirere de magnetiske perlene og gjenta vasketrinnet en gang. Deretter resuspenderer de magnetiske perlene i 100 mikroliter IP-buffer per hver 25 mikroliter av originalt volum perler.Forbered og merk ett rør per hver tilstand. I vårt tilfelle vil vi ha to rør for den infiserte tilstanden, En for m6A og en for IgG-kontroll, og to rør for den ikke-infiserte tilstanden. Tilsett deretter 100 mikroliter vaskede perler i hvert rør.Perler er nå klare til å bli kombinert med spesifikke antistoffer eller IgG-kontroller. Tilsett fem mikrogram enten spesifikt anti-m6A antistoff eller anti-IgG kontroll antistoff til hvert rør som inneholder 100 mikroliter vaskede magnetiske perler. Tillat antistoffperler ved å inkubere røret 30 minutter på et roterende hjul.I mellomtiden fortsetter du med prøveforberedelse. For hver planlagte tilstand, enten m6A-spesifikk eller IgG-kontroll, vil startmaterialet ditt være 2,5 mikrogram fragmentert mRNA resuspendert 100 mikroliter vann. For å ha et endelig reaksjonsvolum på 500 mikroliter, tilsett 295 mikroliter vann til hver prøve.Tilsett deretter fem mikroliter RNAasehemmer konsentrert ved 40 enhet per mikroliter for en total mengde 200 enheter per prøve og bland forsiktig. Til slutt tilsett 100 mikroliter 5X konsentrert IP-buffer til hvert rør. Prøver er nå klare for immunutfellingsreaksjonen.Hent de magnetiske perlene kombinert med antistoff fra det roterende hjulet og spinn dem ned. Tilsett deretter 500 mikroliter av de tidligere forberedte prøvene til hver 100 mikroliter perler kombinert med de spesifikke antistoffene. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned flere ganger for å resuspendere perlene helt.Inkuber dem eller din meRIP-reaksjon på et roterende hjul ved fire grader i løpet av to timer. Når inkubasjonen er over, snurr du ned hvert rør og plasserer dem på et magnetisk stativ i ett minutt for å tillate perleseparasjon. Fjern deretter den ubundne brøkdelen og legg den på et friskt rør og hold den for videre analyse, om nødvendig.Fjern magneten fra stativet og bruk alle prøver på nytt i 500 mikroliter IP-buffer. Resuspend hver prøve forsiktig ved pipettering opp og ned. Sett magneten på stativet, inkuber i ett minutt, og fjern deretter forsiktig supernatanten.Gjenta vasken to ganger, og fortsett deretter med elution. For hvert par prøver, m6A-spesifikke og kontroll, lag 225 mikroliter elutionbuffer som inneholder 20 millimolar renset m6A. Tilsett deretter 100 mikroliter elutionbuffer per prøve.Inkuber alle prøve en time ved fire grader på en rocker. Samle deretter alle m6A beriket RNA-prøve i et friskt rør og fortsett med en andre runde med elution. Rens m6A beriket RNA med din valgte metode Og så er prøvene på dette tidspunktet klare for bibliotekforberedelse og sekvensering.For å undersøke m5C-modifikasjonen bruker vi bisulfittkonvertering. Start eksperimentet med 500 nanogram poly-adenylert RNA. Selv om det er valgfritt å legge til prøven din 500 picogram av poly-A utarmet RNA for å sikre ribosomal representasjon og 0,5 mikroliter kommersielt tilgjengelig syntetisk sekvens vil tillate deg å vurdere bisulfitt konverteringsfrekvens ved sekvensering.Juster prøven til et endelig volum på 20 mikroliter i vann, og tilsett deretter 130 mikroliter RNA-reagens til hver prøve. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned og spinn ned alle prøver for å sikre at det ikke er noen dråper igjen på siden av rørene. Inkuber alle prøver i en PCR-maskin i tre sykluser med denaturering 70 grader i fem minutter og bisulfittkonvertering ved 54 grader i løpet av 45 minutter.Utfør deaminering i kolonne ved å legge direkte på en tom kolonne, 250 mikroliter RNA bindingsbuffer, 150 mikroliter av bisulfittkonbuert prøve. Bland prøven ved å pipettere opp og ned, men vær oppmerksom på at du ikke berører kolonnefiltrene. Tilsett 400 mikroliter 95-100% etanol i prøven RNA bindingsbufferblanding direkte i kolonnen.Lukk hetten og bland umiddelbart ved inversjon. Snurr ned prøven i 30 sekunder og kast gjennomstrømningen. Vask kolonnen med vaskebuffer og tilsett deretter 200 mikroliter desulfonasjonsløsning i midten av hver kolonne.Inkuber alle prøvene dine i 30 minutter ved romtemperatur. Snurr ned prøven i 30 sekunder og fortsett deretter med to runder med vask. Tilsett 400 mikroliter vaskebuffer i hver prøve, sentrifuger i 30 sekunder med full hastighet og kast gjennomstrømningen.Plasser kolonnen i et nytt tomt rør og elute bisulfitten omdannet RNA til 20 mikroliter vann. Kontroller bisulfittkonverteringseffektivitet med RT-qPCR og fortsett deretter til bibliotekforberedelse og sekvensering. Ved bioinformatikkanalyse er her et eksempel på resultater du kan få med denne arbeidsflyten.Her sammenligner vi epitranskriptomet av HIV-infiserte celler kontra ikke-infiserte celler. 24 timer etter infeksjon. I A-panelet kan du se resultatene vi får for å utforske m6A epitranscriptome.I denne grafen plotter vi m6A beriket leser på meRIP-Seq analyse. Vi kan pent se en sinkfinger er hypermetylert 24 timer etter infeksjon. Vi utførte samme type analyse for m5C epitranscriptome-undersøkelsen i panel B.In denne grafen, hver ikke-metylert cytosin vises i rødt, mens andelen cytosin som har blitt m5C metylert, vises i blått.Som du kan se, PHLPP1, alle tre cytosiner som er hyper-metylert 24 timers post-HIV-infeksjon. Totalt sett tillater denne arbeidsflyten å undersøke både M6A og m5C epitranscriptome av infiserte celler og kan også brukes som sådan på virale partikler. Forståelse av virusinfeksjon er i stand til å modifisere vertsepileskriptomisk landskap vil gi oss tilgang til et nytt lag av regulering.Utredning av differensialmetylerte transkripsjoner ved virusinfeksjon vil selvfølgelig gi en verdifull ressurs for ny terapeutisk intervensjon. På lenken her nedenfor finner du vår åpne tilgangsressurs for undersøkelse av differensialmetylert transkripsjon ved HIV-infeksjon over tid.

Research

JoVE Journal

Biology

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Måling av osmosevann permeabilitetskoeffisient (P<sub&gt; F</sub&gt;) Av sfæriske Cells: Isolerte Plant Protoplaster som et eksempel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

Den Infiltrasjon-sentrifuge Teknikk for Utvinning av Apoplastic Fluid fra anlegget blader hjelp<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Som et eksempel

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

RAW264.7 transfektere celler med en luciferasereportergenet

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Vurdering av mineraltilgjengelighet i fiskefôr ved hjelp av komplementære metoder demonstrert med eksempel på sink i atlantisk laks

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Single Cell Micro-aspirasjon som en alternativ strategi for å fluorescens-aktivert Cell sortering for Giant virus blanding separasjon

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Isolering, proliferasjon og differensiering av Rhesus Macaque fettavledede stamceller

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...