Name: exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv
Uploaded: 2022-03-05T13:00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência da Suíça (bolsas 31003A_166412 e 314730_188877).

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Os autores não têm nada a revelar.

O papel das modificações do RNA na infecção viral ainda é amplamente desconhecido. Uma melhor compreensão do papel das modificações epitranscriptômicas no contexto da infecção viral poderia contribuir para a busca de novas metas de tratamento antiviral.
Neste trabalho, fornecemos um fluxo de trabalho completo que permite a investigação dos epitranscriptos m6A e m5C de células infectadas. Dependendo da questão biológica, aconselhamos usar o RNA poli-A selecionado como material inicial. Embora opcional, como o gasoduto poderia ser usado com RNA total, é importante ter em mente que as rRNAs, bem como os pequenos RNAs são altamente modificados e contêm um importante número de resíduos metilados. Isso poderia resultar em uma diminuição da qualidade e quantidade de dados significativos de sequenciamento.
No entanto, se o foco do estudo for RNA não poli-adenylated, a etapa de extração de RNA deve ser adaptada para evitar descartar o pequeno RNA (em caso de extração de RNA baseada em coluna) e privilegiar técnicas de esgotamento ribossomo em vez de seleção poli-A para entrar no pipeline.
A fim de garantir RNA de alta qualidade, fragmentação correta e qualidade de RNA enriquecida com m6A e BS adequada para preparação da biblioteca, aconselhamos fortemente usar um analisador de fragmentos ou um bioanalíter. No entanto, este equipamento nem sempre está disponível. Como alternativa, a qualidade do RNA, mRNA e tamanho do RNA fragmentado também poderia ser avaliada pela visualização em gel de agarose. Alternativamente, a preparação da biblioteca pode ser realizada sem avaliação prévia da quantidade de RNA.
Usamos a técnica MeRIP-Seq16 baseada em anticorpos para explorar a paisagem epitranscriptômica m6A. Esta técnica é baseada na imunoprecipitação de RNA e é bem sucedida; no entanto, algumas etapas precisam de uma otimização cuidadosa e podem ser críticas. Embora a metilação m6A tenha sido descrita para ocorrer principalmente dentro da sequência de consenso RRA*CH, este motivo é altamente frequente ao longo de moléculas de mRNA e não permite a identificação precisa do local metilado. Assim, é fundamental alcançar uma fragmentação de RNA reprodutível e consistente, gerando pequenos fragmentos de RNA, para melhorar a resolução baseada em RIP. Neste protocolo, recomendamos um procedimento otimizado, proporcionando resultados reprodutíveis e consistentes em nosso cenário experimental; no entanto, essa etapa de fragmentação pode precisar de maior otimização de acordo com características específicas da amostra.
Recentemente, uma nova técnica que permite o sequenciamento direto m6A foi descrita. Baseia-se no uso de variantes específicas de transcriptase reversa que exibem assinaturas rt exclusivas como resposta à alteração de RNA m6A24. Essa tecnologia, após uma otimização cuidadosa, poderia contornar a maior limitação enfrentada pelo MeRIP-Seq (diminuindo a quantidade de material inicial e permitindo uma resolução maior). Para explorar a modificação m5C decidimos usar a técnica de conversão de bisulfato para detectar na resolução nucleotídea os resíduos C modificados. A fim de reduzir a taxa de falso positivo devido à presença de estruturas secundárias de RNA, realizamos 3 ciclos de conversão de denaturação/bisulfita e maior desempenho da taxa de conversão de bisulfita de controle, graças ao uso de controles de pico de ERCC. Uma das limitações ligadas a esta técnica é que a conversão de bisulfito é muito dura e três ciclos de conversão de desnaturação/bisulfato poderiam degradar algum RNA e, consequentemente, reduzir a resolução. No entanto, em nosso cenário, optamos por se contentar com uma resolução potencialmente ligeiramente menor, a fim de aumentar a qualidade do conjunto de dados.
Graças a essas otimizações e controles, conseguimos fornecer um fluxo de trabalho confiável e sólido que pode ser explorado para investigar a paisagem epitransomica e sua alteração no contexto de infecções virais, interações hospedeiro-patógeno ou qualquer exposição a tratamentos específicos.

Sabe-se há muito tempo que as moléculas de RNA podem ser modificadas, e mais de 150 modificações pós-transcrições foram descritas até o momento1. Eles consistem na adição de grupos químicos, principalmente grupos de metila, a praticamente qualquer posição dos anéis pirimidina e purina das moléculas de RNA2. Tais modificações pós-transcrição já foram demonstradas como altamente enriquecidas na transferência de RNA (tRNA) e RNA ribossômico (rRNA) e foram recentemente descritas em moléculas de mRNA também.
O surgimento de novas tecnologias, como o Sequenciamento de Próxima Geração (NGS), e a produção de anticorpos específicos que reconhecem modificações químicas definitivas permitiram, pela primeira vez, a investigação do local e a frequência de modificações químicas específicas em nível de transcriptome-em todo o nível. Esses avanços levaram a uma melhor compreensão das modificações do RNA e ao mapeamento de várias modificações nas moléculas de mRNA3,4.
Enquanto a epigenética investiga o papel das modificações de DNA e histona na regulação do transcriptome, a epitranscriptomia de forma semelhante se concentra nas modificações do RNA e seu papel. A investigação de modificações epitransomicas oferece novas oportunidades para destacar novos mecanismos de regulação que podem sintonizar uma variedade de processos celulares (ou seja, emendas de RNA, exportação, estabilidade e tradução)5. Não foi, portanto, grande surpresa que estudos recentes descobriram muitas modificações epitranscriômicas sobre infecção viral tanto no celular quanto no viral RNAs6. Os vírus investigados até agora incluem tanto os vírus DNA quanto o RNA; entre eles, o HIV pode ser considerado como um exemplo pioneiro. Ao todo, a descoberta da metilação de RNA no contexto de infecções virais pode permitir a investigação de mecanismos ainda não atribuídos de expressão ou replicação viral, fornecendo assim novas ferramentas e metas para controlá-los7.
No campo da epitranscriptomia do HIV, modificações de transcrições virais têm sido amplamente investigadas e mostraram que a presença dessa modificação foi benéfica para a replicação viral8,9,10,11,12,13. Até o momento, várias técnicas podem ser usadas para detectar marcas epitranscriômicas no nível de transcriptome em todo o mundo. As técnicas mais utilizadas para identificação m6A dependem de técnicas de precipitação imunológica, como MeRIP-Seq e miCLIP. Enquanto o MeRIP-Seq depende da fragmentação do RNA para capturar fragmentos contendo resíduos metilados, o miCLIP baseia-se na geração de mutações específicas de assinatura de anticorpos α-m6A no crosslinking UV RNA-anticorpos, permitindo assim um mapeamento mais preciso.
A detecção da modificação m5C pode ser alcançada por tecnologias baseadas em anticorpos semelhantes à detecção de m6A (rip m5C), ou por conversão de bisullfita ou por AZA-IP ou por miCLIP. Tanto o Aza-IP quanto o m5C miCLIP usam um metiltransferase específico como isca para atingir o RNA enquanto passa pela metilação de RNA. Em Aza-IP, as células-alvo são expostas a 5-azacytidina, resultando na introdução aleatória de sítios analógicos de 5 azacytidina de citidina em RNA nascente. No miCLIP, o NSun2 metiltransferase é geneticamente modificado para abrigar a mutação C271A14,15.
Neste trabalho, focamos na caracterização dupla das modificações m6A e m5C em células infectadas, utilizando o HIV como modelo. Após a otimização metodológica, desenvolvemos um fluxo de trabalho que combina imunoprecipitação de RNA metilado (MeRIP) e conversão de bisullfita de RNA (BS), permitindo a exploração simultânea de marcas epitransomicas m6A e m5C em nível transcriptome-wide, tanto em contextos celulares quanto virais. Este fluxo de trabalho pode ser implementado em extratos de RNA celular, bem como em RNA isolado de partículas virais.
A abordagem metilada RNA ImmunoPrecipitation (MeRIP)16 permitindo a investigação do m6A no nível de transcriptome-em todo o nível está bem estabelecida e uma matriz de anticorpos específicos m6A estão disponíveis comercialmente até o momento17. Este método consiste na captura seletiva de peças de RNA contendo m6A usando um anticorpo específico m6A. As duas principais desvantagens dessa técnica são (i) a resolução limitada, que é altamente dependente do tamanho dos fragmentos de RNA e, portanto, fornece uma localização e região aproximadas contendo o resíduo metilado, e (ii) a grande quantidade de material necessária para realizar a análise. No protocolo otimizado a seguir, padronizamos o tamanho do fragmento para cerca de 150 nt e reduzimos a quantidade de material inicial de 10 μg de RNA poli-A selecionado, que atualmente é a quantidade aconselhada de material inicial, para apenas 1 μg de RNA poli-A selecionado. Também maximizamos a eficiência de recuperação de fragmentos de RNA m6A ligados a anticorpos específicos usando uma eluição por uma abordagem de competição com um peptídeo m6A em vez de métodos de elução mais convencionais e menos específicos usando técnicas à base de fenol ou proteinase K. A principal limitação deste ensaio baseado em RIP, no entanto, continua sendo a resolução subótima que não permite a identificação do nucleotídeo A modificado preciso.
A análise da marca m5C pode ser realizada atualmente usando duas abordagens diferentes: um método baseado em RIP com anticorpos específicos m5C e conversão de bisullfita de RNA. Como o RIP oferece apenas resolução limitada sobre a identificação do resíduo metilado, utilizamos conversão de bisulfito que pode oferecer resolução de nucleotídeo único. A exposição do RNA ao bisulfita (BS) leva à deaminação da citosina, convertendo assim o resíduo de citosina em uracil. Assim, durante a reação de conversão de bisulfita de RNA, toda citosina não metilada é desaminada e convertida em uracil, enquanto a presença de um grupo de metila na posição 5 da citosina tem um efeito protetor, impedindo a desaminação induzida pela BS e preservando o resíduo de citosina. A abordagem baseada em BS permite a detecção de um nucleotídeo modificado por m5C em resolução de base única e para avaliação da frequência de metilação de cada transcrição, fornecendo insights sobre a dinâmica de modificação m5C18. A principal limitação dessa técnica, no entanto, baseia-se na taxa falsa positiva de resíduos metilados. De fato, a conversão de BS é eficaz em RNA de fio único com resíduos C acessíveis. No entanto, a presença de uma estrutura secundária de RNA apertada poderia mascarar a posição N5C e dificultar a conversão de BS, resultando em resíduos C não metilados que não são convertidos em resíduos de U e, portanto, falsos positivos. Para contornar essa questão e minimizar a taxa falsa positiva, aplicamos 3 rodadas de ciclos de conversão de desnaturação e bisulfato19. Também introduzimos 2 controles nas amostras para permitir a estimativa da eficiência de conversão de bisulfato: nós, controles de sequenciamento de ERCC (sequências padronizadas e comercialmente disponíveis não metiladas)20, bem como RNAs poli-A-esgotadas para avaliar a taxa de conversão de bisulfatos por um lado, e verificar por RT-PCR a presença de um local metilado conhecido e bem conservado, C4447, em 28S ribossômico RNA, por outro lado,21.
No campo da virologia, o acoplamento desses dois métodos de investigação epitransomica com sequenciamento de próxima geração e análise bioinformática precisa permite o estudo aprofundado da dinâmica m6A e m5C (ou seja, alterações temporais de modificação de RNA que poderiam ocorrer após a infecção viral e poderiam descobrir uma série de novos alvos terapeuticamente relevantes para uso clínico).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrime Pfx SuperMix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12344-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ RNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>EZR5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-472-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-471-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina TruSeq Stranded mRNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Beads A/G Blend</td>
			<td>Merck</td>
			<td>16-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-Methyladenosine, 5&#8242;-monophosphate sodium salt (m6A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2780-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse IgG</td>
			<td>Merk</td>
			<td>12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo(dT)25</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61005,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRapace</td>
			<td>Stratec</td>
			<td>1020220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick RNA Viral Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Fragmentation Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv

O papel das modificações do RNA nos processos biológicos tem sido o foco de um número crescente de estudos nos últimos anos e é conhecido hoje em dia como epitranscriptomia. Entre outros, as modificações de RNA N6-metiladenosine (m6A) e 5-metilcytosina (m5C) foram descritas em moléculas de mRNA e podem ter um papel na modulação dos processos celulares. A epitranscriptomia é, portanto, uma nova camada de regulação que deve ser considerada além das análises transcriômicas, pois também pode ser alterada ou modulada pela exposição a qualquer agente químico ou biológico, incluindo infecções virais.
Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho que permite a análise da paisagem epitransomica celular e viral das marcas m6A e m5C simultaneamente, em células infectadas ou não com o vírus da imunodeficiência humana (HIV). Após o isolamento e fragmentação do mRNA a partir de células infectadas pelo HIV e não infectadas, utilizamos dois procedimentos diferentes: MeRIP-Seq, uma técnica baseada em imunoprecipitação de RNA, para enriquecer para fragmentos de RNA contendo a marca m6A e BS-Seq, uma técnica baseada em conversão de bisullfita, para identificar a marca m5C em uma única resolução nucleotídea. Após a captura específica da metilação, as bibliotecas RNA são preparadas para sequenciamento de alto rendimento. Também desenvolvemos um pipeline de bioinformática dedicado para identificar transcrições diferencialmente metiladas (DM) independentemente de seu perfil de expressão basal.
No geral, a metodologia permite a exploração de múltiplas marcas epitranscriptômicas simultaneamente e fornece um atlas de transcrições de DM sobre infecção viral ou qualquer outra perturbação celular. Essa abordagem oferece novas oportunidades para identificar novos atores e novos mecanismos de resposta celular, como fatores celulares que promovem ou restringem a replicação viral.

Este fluxo de trabalho tem se mostrado útil para investigar o papel da metilação m6A e m5C no contexto da infecção pelo HIV. Para isso, usamos um modelo de linha celular CD4+ T (SupT1) que ou infectamos com HIV ou não tratados. Iniciamos o fluxo de trabalho com 50 milhões de células por condição e obtivemos uma média de 500 μg de RNA total com um número de qualidade de RNA de 10 (Figura 1A-B). Após a seleção poli-A recuperamos entre 10 e 12 μg de mRNA por condição (representando cerca de 2% do RNA total) (Figura 1B). Neste ponto, usamos 5 μg de RNA poli-A selecionado para o gasoduto MeRIP-Seq e 1 μg para o gasoduto BS-Seq. Uma vez que o RNA do HIV é poli-adenilado, nenhuma ação adicional é necessária e os procedimentos MeRIP-Seq e BS-Seq podem ser aplicados diretamente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig01.jpg"> Figura 1: Preparação de RNA para aplicações a jusante. A) Fluxo de trabalho que retrata a preparação e distribuição do RNA para os gasodutos MeRIP-Seq e BS-Seq simultâneos. Cada forma hexagonal preenchida representa um tipo de modificação de RNA, como m6A (verde) ou m5C (rosa). São indicadas quantidades de material de RNA necessários para a realização do experimento. B) Resultados representativos que retratam os perfis de distribuição de RNA esperados (tamanho e quantidade) na extração total de RNA (painel superior) e seleção poli-A (painel inferior). As amostras foram carregadas no analisador de fragmentos com kit de sensibilidade padrão, a fim de avaliar a qualidade do RNA antes de inserir procedimentos específicos de MeRIP-Seq e BS-Seq. RQN: número de qualidade de RNA; nt: nucleotídeos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O gasoduto MeRIP-Seq é uma técnica baseada em imunoprecipitação de RNA que permite a investigação da modificação m6A ao longo das moléculas de RNA. Para isso, o RNA é primeiro fragmentado e depois incubado com anticorpos específicos m6A acoplados a contas magnéticas para imunoprecipitação e captura. Fragmentos de RNA enriquecidos por MeRIP e a fração intocada (entrada) são então sequenciados e comparados para identificar regiões de RNA modificadas por m6A e, portanto, transcrições m6A-metiladas (Figura 2A). A resolução da técnica depende da eficiência da fragmentação do RNA. De fato, fragmentos mais curtos permitem uma localização mais precisa do resíduo m6A. Aqui, rnas poli-A selecionadas celulares e RNAs virais foram submetidos à fragmentação baseada em íons com tampão de fragmentação de RNA durante 15 min em um volume final de 20 μL para obter fragmentos de RNA de 100-150 nt. A partir de 5 μg de mRNA, recuperamos 4,5 μg de RNA fragmentado, correspondendo a uma taxa de recuperação de 90% (Figura 2B). Usamos 100 ng de RNA fragmentado e purificado como controle de entrada, submetido diretamente à preparação e sequenciamento da biblioteca. O RNA restante (~4,4 μg) foi processado de acordo com o gasoduto MeRIP-Seq, que começa com a incubação de RNA fragmentado com contas ligadas a anticorpos específicos anti-m6A ou a anticorpos anti-IgG como controle. RIP (MeRIP) específico para m6A de 2,5 μg de RNA fragmentado permitiu recuperar cerca de 15 ng de material enriquecido com m6A que passou por preparação e sequenciamento da biblioteca (Figura 2B). RIP com controle anti-IgG, como esperado, não rendeu RNA suficiente para permitir uma análise mais aprofundada (Figura 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig02.jpg"> Figura 2: Pipeline MeRIP-Seq. A) Representação esquemática do fluxo de trabalho MeRIP-Seq e controle de entrada. Após a seleção poli-A, as amostras foram fragmentadas em peças de 120-150 nt e, diretamente submetidas a sequenciamento (100 ng, controle de entrada), ou utilizadas para imunoprecipitação de RNA (2,5 μg, RIP) com anticorpo específico anti-m6A ou anticorpo anti-IgG como controle negativo antes do sequenciamento. B) Resultados representativos mostrando os perfis de distribuição de RNA esperados (tamanho e quantidade) após a fragmentação (painel superior) e RIP (painéis inferiores, MeRIP: esquerda, controle IgG: à direita). As amostras foram carregadas no analisador de fragmentos para avaliar a qualidade e concentração do RNA antes de posterior processamento para preparação e sequenciamento da biblioteca. A análise fragmentada do RNA foi realizada utilizando-se o kit de sensibilidade padrão RNA, enquanto o RNA imunoprecipitado utilizou o kit de alta sensibilidade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O gasoduto BS-Seq permite a exploração da modificação de RNA m5C na resolução de nucleotídeos e leva à identificação de transcrições m5C-metiladas. Após a conversão de bisulfita, citosinas não metiladas são convertidas em uracil, enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas (Figura 3A). Devido às condições adversas do procedimento de conversão de bisullfita (ou seja, alta temperatura e pH baixo), os mRNAs convertidos são altamente degradados (Figura 3B), porém isso não interfere na preparação e sequenciamento da biblioteca. A conversão de bisulfita é eficiente apenas no RNA de uma única-encalhada e, portanto, pode ser potencialmente prejudicada por estruturas secundárias de RNA de dupla-encalhadas. Para avaliar a eficiência da conversão C-U introduzimos dois controles. Como controle positivo, aproveitamos a presença previamente descrita de uma citosina altamente metilada na posição C4447 do 28S rRNA23. Após a amplificação e sequenciamento do RT-PCR de um fragmento de 200 bps em torno do local metilado pudemos observar que todas as citosinas foram convertidas com sucesso em uracils, aparecendo assim como timmidinas na sequência de DNA, exceto a citosina na posição 4447 que permaneceu inalterada. Como um controle para taxa de conversão de bisulfita, usamos sequências RNA sintéticas ercc ercc comercialmente disponíveis. Esta mistura consiste em uma piscina de sequências de RNA conhecidas, não metiladas e poli-adenylated, com uma variedade de estruturas secundárias e comprimentos. Após a preparação e sequenciamento da biblioteca, focamos nessas sequências de ERCC para calcular a taxa de conversão, que pode ser realizada contando o número de C convertidos entre os resíduos C totais em todas as sequências de ERCC e em cada amostra. Obtivemos uma taxa de conversão de 99,5%, confirmando a eficiência e o sucesso da reação de conversão de bisulfato (Figura 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig03.jpg"> Figura 3: Gasoduto BS-Seq. A) Representação esquemática do fluxo de trabalho BS-Seq. Após a seleção poli-A, as amostras são expostas ao bisulfato, resultando na conversão de C para U (devido à desaminação) para resíduos C não metilados. Em contraste, os resíduos de C metilados (m5C) não são afetados pelo tratamento de bisulfato e permanecem inalterados. B) Resultado representativo do perfil de distribuição de RNA convertido de bisulfato (tamanho e quantidade) após análise no analisador de fragmentos com um kit de sensibilidade padrão. C) Eletroferógrama mostrando resultado representativo de sequenciamento de amplicon RT-PCR da região em torno do C 100% metilado na posição 4447 em 28S rRNA (destacado em azul). Em contraste, os resíduos C da sequência de referência foram identificados como resíduos T na sequência de amplicon devido ao sucesso de conversão de bisullfita. D) Avaliação da taxa de conversão de C-U por análise de sequências de pico do ERCC em células infectadas pelo HIV e não infectadas. A taxa média de conversão é de 99,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Amostras enriquecidas com M6A, amostras convertidas por bisulfato e controles de entrada são processados para preparação de bibliotecas, sequenciamento e análise bioinformática (Figura 4). De acordo com o desenho experimental e as perguntas biológicas abordadas, podem ser aplicadas múltiplas análises bioinformáticas. Como prova de princípio aqui, mostramos resultados representativos de uma aplicação potencial (ou seja, análise diferencial de metilação), que se concentra na identificação de transcrições diferencialmente metiladas induzidas pela infecção pelo HIV. Brevemente, investigamos o nível de metilação m6A ou metilação m5C, independentemente de seu nível de expressão genética, tanto em células não infectadas quanto infectadas pelo HIV, a fim de entender melhor o papel das metilações de RNA durante o ciclo de vida viral. Após a normalização da expressão genética, identificamos que a transcrição ZNF469 foi diferencialmente m6A-metilada de acordo com o estado de infecção, na verdade esta transcrição não foi metilada em células não infectadas enquanto exibia vários picos metilados sobre a infecção pelo HIV (Figura 5A). Uma análise de metilação diferencial semelhante no m5C revelou que a transcrição phlpp1 continha vários resíduos metilados, que tendem a ser mais frequentemente metilados na condição do HIV (Figura 5B). Nesse contexto, ambas as análises sugerem que a infecção pelo HIV impacta o epitranscripto celular.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig04.jpg"> Figura 4: Representação esquemática do fluxo de trabalho bioinforático para a análise dos dados m6A e m5C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig05.jpg"> Figura 5: Exemplo de transcrições diferencialmente metiladas após a infecção. A) Resultado representativo mostrando metilação m6A de transcrição ZNF459 em células infectadas pelo HIV (verde) e não infectadas (cinza). A intensidade máxima (após subtração de expressão de entrada) é mostrada no eixo y e posição no cromossomo ao longo do eixo x. A análise diferencial da metilação revela que a transcrição ZFN469 é hipermetilada após a infecção pelo HIV. B) Resultado representativo de células metiladas m5C em células infectadas pelo HIV (pista superior) e não infectadas (pista inferior). A altura de cada barra representa o número de leituras por nucleotídeo e permite a avaliação da cobertura. Cada resíduo C representado em vermelho, e a proporção de C metilado é representada em azul. A taxa exata de metilação (%) é relatada acima de cada resíduo C. Setas destacam diferencialmente significante diferencialmente metilado C. As amostras foram visualizadas utilizando-se do visualizador IGV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

O papel das modificações do RNA em infecções virais está apenas começando a ser explorado e pode destacar novos mecanismos de interação viral-host. Neste trabalho, fornecemos um pipeline para investigar modificações de RNA m6A e m5C no contexto de infecções virais.

Explorando epitransomos m6A e m5C sobre infecção viral: um exemplo com HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

Oi, neste vídeo vamos mostrar como explorar os epitranscriptos m6A e m5C sobre infecção viral. Para começar o experimento, você precisará de 50 milhões de células para os não infectados e 50 milhões para a condição infectada. Para obter um conjunto de dados de alta qualidade após análise, você precisará alcançar uma infecção universal.Aqui infectamos essas células com um vetor baseado em HIV e medimos o GFP codificado viralmente pela FACS. Neste caso, tivemos 80% das células infectadas e prosseguimos com o fluxo de trabalho começando com a extração total do RNA. Então dividimos as células em alíquotas de 10 milhões cada e as lisemos em 1 mL de Trizol.Em seguida, adicionamos 200 microliter de clorofórmio ao lise celular e misturado por inversão. Neste ponto, deixamos o lise sentar por três minutos em temperatura ambiente e, em seguida, centrifugar todas as amostras em alta velocidade por 15 minutos a quatro graus. Você espera ver uma separação de fase em três fases diferentes, como é mostrado aqui.O RNA está sentado na fase superior, então transfira cuidadosamente a fase aquosa para um tubo fresco, prestando atenção em não transferir a camada orgânica. Neste ponto, adicione 0,5 mL de isopropanol à fase aquosa e misture cuidadosamente por inversão. As amostras podem então ser incubadas uma hora a 80 graus para garantir a precipitação do RNA.Após a centrifugação em alta velocidade, você deve ser capaz de ver uma boa pelota de RNA como é mostrado aqui. Descarte cuidadosamente o supernatante por inversão ou por pipetação, prestando atenção em não interromper a pelota. Em seguida, lave a pelota de RNA com um mL de etanol de grau molecular de 75%.E vórtice da amostra brevemente. Após a centrifugação, certifique-se de recuperar uma boa pelota de RNA branca. Descarte o supernatante e deixe a pelota de RNA secar por 15 minutos em temperatura ambiente.Resuspenda cada pelota em 20 microliter de água e acumule todas as amostras da mesma condição juntos. O RNA total está pronto para o isolamento do mRNA por seleção poli-A. Para cada amostra de 75 microgramas de RNA, prepare 200 microliter de contas magnéticas oligo-DT e lave-as em um mL de tampão de ligação.Coloque o tubo em um suporte magnético e deixe que as contas se liguem ao ímã durante uma mistura. Descarte o sobrenante e repita o procedimento para uma segunda lavagem. Em seguida, remova as contas das bancadas magnéticas e resumita cuidadosamente em 100 microliter de tampão de ligação.Neste ponto, prepare a amostra de RNA dividindo-as em 75 microgramas de RNA por aliquot resuspended em 100 microliter de água. Adicione 100 microliter de tampão de ligação e incubar por dois minutos a 65 graus. Em seguida, gire as amostras e incubar no gelo.Adicione então 100 microliter de contas magnéticas lavadas a cada amostra de RNA e permita a ligação em uma roda giratória por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, coloque o tubo de volta em um rack magnético e deixe-os incubar por um minuto. Em seguida, recupere o supernaente em um tubo fresco e mantenha-o de lado para uma segunda rodada de isolamento.Lave as contas duas vezes com 200 microliter de tampão de lavagem e, em seguida, proceda para a eluição. A fim de elute poly-A selecionado RNA a partir das contas magnéticas, adicione 20 microliter de TRIS HCl gelado a cada amostra e pipeta cuidadosamente. Em seguida, incubar suas amostras a 80 graus por dois minutos para liberar o RNA das contas.Transfira o supernante contendo RNA poli-A selecionado para um tubo fresco, tomando cuidado para evitar a transferência de contas. O passo de eluição, bem como a etapa de isolamento, devem ser repetidos duas vezes para aumentar o rendimento do mRNA. MRNA está agora pronto para entrar no pipeline meRIP-Seq na etapa de fragmentação ou ir diretamente para a conversão de bisulfato.O primeiro passo para entrar no gasoduto meRIP-Seq consiste na fragmentação do mRNA. Para isso, você precisa de cinco microgramas de mRNA divididos em alíquotas de 18 microliter em tubos de 0,2 mL. Para garantir dados consistentes, é fundamental trabalhar rapidamente e com apenas poucas amostras no momento.Para este experimento, a fragmentação foi otimizada para obter fragmentos de tamanho entre 115 e 200 nucleotídeos. Em seguida, adicione dois microliter de reagente de fragmentação a cada tubo contendo 18 microliter de mRNA sendo cuidadosos ao depositar a gota na parede do tubo. Gire todas as amostras para permitir o contato entre o reagente e o RNA ao mesmo tempo e incubar a 70 graus por 15 minutos.Uma vez que a incubação termine, pare a reação adicionando dois microliter de 0,5 M EDTA. Neste ponto, você pode purificar seu mRNA fragmentado com seu método de escolha e proceder a um controle de qualidade RNA por analisador de fragmentos. Esta etapa é opcional, mas permitirá avaliar o tamanho do fragmento antes de engajar a precipitação do RNA.Como você pode ver aqui na quarta pista, nós obtemos para o nosso fragmento amostral de cerca de 150 nucleotídeos cada. Em seguida, prosseguimos com meRIP-Seq. O primeiro passo consiste em algumas contas magnéticas A/G com anticorpos anti-m6A ou controles IgG.Para cada plano de reação, transfira 25 microliter de contas magnéticas para um tubo fresco. Por favor, note que você precisará de pelo menos uma condição específica m6A e uma condição de controle. Lave cada 25 microliter de contas com 250 microliter de tampão IP.Levemente resuspenque as contas pipetando para cima e para baixo e coloque o tubo no rack magnético por um minuto, a fim de permitir a separação das contas. Remova e descarte o supernaspeito, prestando atenção em não aspirar as contas magnéticas e repetir o passo de lavagem uma vez. Em seguida, resuspenja as contas magnéticas em 100 microliter de tampão IP por cada 25 microliter de volume original de contas.Prepare e rotule um tubo por cada condição. No nosso caso, teremos dois tubos para a condição infectada, um para m6A e um para controle de IgG, e dois tubos para a condição não infectada. Em seguida, adicione 100 microliter de contas lavadas em cada tubo.As contas estão agora prontas para serem acoplado a anticorpos específicos ou controles IgG. Adicione cinco microgramas de anticorpo anti-m6A específico ou anticorpo de controle anti-IgG a cada tubo contendo 100 microliter de contas magnéticas lavadas. Permita a conjugação de contas de anticorpos incubando o tubo 30 minutos em uma roda giratória.Enquanto isso, prossiga com a preparação da amostra. Para cada condição planejada, seja de controle m6A ou IgG, seu material inicial será de 2,5 microgramas de mRNA fragmentado resuspended 100 microliter de água. Para ter um volume final de reação de 500 microliter, adicione 295 microliter de água a cada amostra.Adicione então cinco microliter do inibidor RNAase concentrado em 40 unidades por microliter para uma quantidade total de 200 unidades por amostra e misture suavemente. Por fim, adicione 100 microliter de 5X tampão IP concentrado a cada tubo. As amostras estão prontas para a reação de precipitação imunológica.Recupere as contas magnéticas acoplado com anticorpos da roda giratória e gire-as para baixo. Adicione então 500 microliteres das amostras previamente preparadas a cada 100 microliteres de contas acoplado aos anticorpos específicos. Misture suavemente por pipetting para cima e para baixo várias vezes para resuspensar completamente as contas.Incubar-os ou sua reação meRIP em uma roda giratória a quatro graus durante duas horas. Uma vez que a incubação acabou, gire cada tubo e coloque-os em um rack magnético por um minuto para permitir a separação das contas. Em seguida, remova a fração desvinculada e coloque-a em um tubo fresco e mantenha-a para análise mais aprofundada, se necessário.Remova o ímã do rack e resuspenja todas as amostras em 500 microliter de tampão IP. Resuspenda cada amostra cuidadosamente, pipetando para cima e para baixo. Insira o ímã no rack, incuba por um minuto e, em seguida, remova cuidadosamente o sobrenatário.Repita a lavagem duas vezes e, em seguida, proceda com a eluição. Para cada par de amostras, m6A específica e controle, prepare 225 microliter de tampão de eluição contendo 20 milimiliar de m6A purificado. Em seguida, adicione 100 microliter de tampão de eluição por amostra.Incubar todas as amostras uma hora a quatro graus em um roqueiro. Em seguida, colete todas as amostras de RNA enriquecidas m6A em um tubo fresco e proceda com uma segunda rodada de eluição. Purifique o RNA enriquecido m6A com seu método de escolha e, neste momento, as amostras estão prontas para preparação e sequenciamento da biblioteca.Para investigar a modificação do M5C, usamos conversão de bisulfito. Inicie o experimento com 500 nanogramas de RNA poli-adenilado. Embora opcional, adicionar à sua amostra 500 picogramas de RNA poli-A esgotado para garantir a representação ribossômica e 0,5 microliter de sequência sintética comercialmente disponível permitirá que você avalie a taxa de conversão de bisulfoto no sequenciamento.Ajuste sua amostra para um volume final de 20 microliter na água e, em seguida, adicione 130 microliter de reagente de conversão de RNA a cada amostra. Misture cuidadosamente por tubos para cima e para baixo e gire para baixo toda a amostra para ter certeza de que não há gotas deixadas na lateral dos tubos. Incubar todas as amostras em uma máquina PCR para três ciclos de desnaturação de 70 graus por cinco minutos e conversão de bisulfato a 54 graus durante 45 minutos.Realize a desaminação na coluna adicionando diretamente em uma coluna vazia, 250 microliter de buffer de ligação de RNA, 150 microliter da sua amostra convertida de bisullfita. Misture a amostra por pipetação para cima e para baixo, mas preste atenção em não tocar nos filtros da coluna. Adicione 400 microliter de 95-100% etanol à mistura de tampão de ligação de RNA da amostra diretamente na coluna.Feche a tampa e misture imediatamente por inversão. Gire sua amostra por 30 segundos e descarte o fluxo. Lave sua coluna com tampão de lavagem e adicione 200 microliter de solução de dessefonação ao centro de cada coluna.Incubar toda a sua amostra por 30 minutos em temperatura ambiente. Gire a amostra por 30 segundos e, em seguida, prossiga com duas rodadas de lavagem. Adicione 400 microliter de tampão de lavagem a cada amostra, centrífuga por 30 segundos a toda velocidade e descarte o fluxo-through.Coloque a coluna em um novo tubo vazio e elute o bisullfita convertido RNA em 20 microliter de água. Controle a eficiência de conversão de bisulfato pelo RT-qPCR e, em seguida, proceda à preparação e sequenciamento da biblioteca. Após a análise biointicética, aqui está um exemplo de resultados que você pode obter com este fluxo de trabalho.Aqui comparamos o epitranscriptome das células infectadas pelo HIV versus as células não infectadas. a 24 horas após a infecção. No painel A, você pode ver os resultados que obtemos explorando o epitranscriptome m6A.Neste gráfico, traçamos as leituras enriquecidas do m6A sobre a análise de meRIP-Seq. Podemos ver que um dedo de zinco está hipermetilado 24 horas após a infecção. Realizamos o mesmo tipo de análise para a investigação de epitranscrito m5C no painel B.In este gráfico, cada citosina não metilada é exibida em vermelho, enquanto a proporção de citosina que foi metilada m5C é mostrada em azul.Como você pode ver, PHLPP1, todas as três citosinas que são hiper-metiladas 24 horas após a infecção pelo HIV. No geral, este fluxo de trabalho permite investigar tanto o epitranscriptome M6A quanto o m5C de células infectadas e pode ser aplicado como tal em partículas virais também. A compreensão da infecção viral é capaz de modificar a paisagem epitransomica hospedeira nos dará acesso a uma nova camada de regulação.A investigação de transcrições diferenciadas metiladas sobre infecção viral fornecerá, naturalmente, um recurso valioso para uma nova intervenção terapêutica. No link aqui abaixo você pode encontrar nosso recurso de acesso aberto para a investigação da transcrição diferencial metilada sobre a infecção pelo HIV ao longo do tempo.

Research

JoVE Journal

Biology

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

Entrevista: HIV-1 DNA proviral Excisão Usando um Recombinase Evolved

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Biologia

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Protocolos para a Infecção Oral de lagartas de Lepidoptera com Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

Explorando Funções Cognitivas em Bebés, Crianças e Adultos com Espectroscopia no Infravermelho Próximo

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Mecanismos Herbívoro caracterizando Resistance: Spittlebugs em Brachiaria Spp. como Exemplo

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos planta isolada como um exemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

A técnica de infiltração-centrifugação para Extração de apoplásticas Fluid das folhas da planta Usando<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Como exemplo

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

RAW264.7 transfecção de células com um gene repórter de luciferase

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Avaliação da disponibilidade mineral em rações de peixe usando métodos complementares demonstrados com o exemplo de zinco no salmão atlântico

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Micro-aspiração de célula única como uma estratégia alternativa à classificação celular ativada por fluorescência para separação de mistura de vírus gigante

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Isolamento, Proliferação e Diferenciação de Células-Tronco Derivadas de Adiposos de Macacos Rhesus

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...