Name: exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv
Uploaded: 2022-03-05T13:00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

Эта работа была поддержана Швейцарским национальным научным фондом (гранты 31003A_166412 и 314730_188877).

<ol>
	<li>Machnicka, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways--2013+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways--2013 update.</a> Nucleic Acids Research. 41, 262-267 (2013).</li><li>Zaccara, S., Ries, R. J., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading,+writing+and+erasing+mRNA+methylation.">Reading, writing and erasing mRNA methylation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 608-624 (2019).</li><li>Davalos, V., Blanco, S., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Messenger+RNA+Modifications.">SnapShot: Messenger RNA Modifications.</a> Cell. 174 (2), 498 (2018).</li><li>Saletore, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+birth+of+the+Epitranscriptome:+deciphering+the+function+of+RNA+modifications.">The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).</li><li>Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications.">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2017).</li><li>Netzband, R., Pager, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+marks:+Emerging+modulators+of+RNA+virus+gene+expression.">Epitranscriptomic marks: Emerging modulators of RNA virus gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (3), 1576 (2020).</li><li>Pereira-Montecinos, C., Valiente-Echeverria, F., Soto-Rifo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+regulation+of+viral+replication.">Epitranscriptomic regulation of viral replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (4), 460-471 (2017).</li><li>Lichinchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+human+and+viral+m(6)A+RNA+methylomes+during+HIV-1+infection+of+T+cells.">Dynamics of the human and viral m(6)A RNA methylomes during HIV-1 infection of T cells.</a> Nature Microbiology. 1, 16011 (2016).</li><li>Courtney, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+Addition+of+m(5)C+to+HIV-1+Transcripts+Regulates+Viral+Gene+Expression.">Epitranscriptomic Addition of m(5)C to HIV-1 Transcripts Regulates Viral Gene Expression.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).</li><li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+m(6)A+Editing+of+HIV-1+mRNAs+Enhances+Viral+Gene+Expression.">Posttranscriptional m(6)A Editing of HIV-1 mRNAs Enhances Viral Gene Expression.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 675-685 (2016).</li><li>Tirumuru, N., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+envelope+proteins+up-regulate+N+(6)-methyladenosine+levels+of+cellular+RNA+independently+of+viral+replication.">HIV-1 envelope proteins up-regulate N (6)-methyladenosine levels of cellular RNA independently of viral replication.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3249-3260 (2019).</li><li>Tirumuru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+of+HIV-1+RNA+regulates+viral+infection+and+HIV-1+Gag+protein+expression.">N(6)-methyladenosine of HIV-1 RNA regulates viral infection and HIV-1 Gag protein expression.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell.">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> Frontiers in Virology. 1 (11), (2021).</li><li>Khoddami, V., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+target+profiling+of+RNA+cytosine+methyltransferases+using+the+mechanism-based+enrichment+procedure+Aza-IP.">Transcriptome-wide target profiling of RNA cytosine methyltransferases using the mechanism-based enrichment procedure Aza-IP.</a> Nature Protocols. 9 (2), 337-361 (2014).</li><li>Hussain, S., Aleksic, J., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (11), 215 (2013).</li><li>Dominissini, D., Moshitch-Moshkovitz, S., Salmon-Divon, M., Amariglio, N., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+mapping+of+N6-methyladenosine+by+m6A-seq+based+on+immunocapturing+and+massively+parallel+sequencing.">Transcriptome-wide mapping of N6-methyladenosine by m6A-seq based on immunocapturing and massively parallel sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (1), 176-189 (2013).</li><li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq.">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li><li>Shobbir Hussain, J. A., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (215), (2013).</li><li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+5-methylcytosine+profiles+in+poly(A)+RNA+from+mouse+embryonic+stem+cells+and+brain.">Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain.</a> Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).</li><li>Endrullat, C., Gl&#246;kler, J., Franke, P., Frohme, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+and+quality+management+in+next-generation+sequencing.">Standardization and quality management in next-generation sequencing.</a> Applied &amp; Translational Genomics. 10, 2-9 (2016).</li><li>Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+cytosine+methylation+analysis+by+bisulfite+sequencing.">RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 12 (2009).</li><li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell.">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> biorxiv. 1 (11), (2021).</li><li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+noncoding+RNA.">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and noncoding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li><li>Aschenbrenner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+DNA+Polymerase+for+Direct+m(6)+A+Sequencing.">Engineering of a DNA Polymerase for Direct m(6) A Sequencing.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 57 (2), 417-421 (2018).</li><li>Didion, J. P., Martin, M., Collins, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atropos:+specific,+sensitive,+and+speedy+trimming+of+sequencing+reads.">Atropos: specific, sensitive, and speedy trimming of sequencing reads.</a> PeerJ. 5, 3720 (2017).</li><li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISAT:+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements.">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Okonechnikov, K., Conesa, A., Garc&#237;a-Alcalde, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualimap+2:+advanced+multi-sample+quality+control+for+high-throughput+sequencing+data.">Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., K&#228;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet Journal. 17 (1), (2011).</li><li>Shen, W., Le, S., Li, Y., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeqKit:+A+Cross-Platform+and+Ultrafast+Toolkit+for+FASTA/Q+File+Manipulation.">SeqKit: A Cross-Platform and Ultrafast Toolkit for FASTA/Q File Manipulation.</a> PLOS ONE. 11 (10), 0163962 (2016).</li><li>Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=meRanTK:+methylated+RNA+analysis+ToolKit.">meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit.</a> Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Роль модификаций РНК в вирусной инфекции до сих пор в значительной степени неизвестна. Лучшее понимание роли эпитранскриптомных модификаций в контексте вирусной инфекции может способствовать поиску новых целей противовирусного лечения.
В этой работе мы обеспечиваем полный рабочий процесс, который позволяет исследовать эпитранскриптомы m6A и m5C инфицированных клеток. В зависимости от биологического вопроса мы советуем использовать поли-А-выбранную РНК в качестве исходного материала. Хотя это необязательно, поскольку конвейер может использоваться с общей РНК, важно иметь в виду, что рРНК, а также малые РНК сильно модифицированы и содержат значительное количество метилированных остатков. Это может привести к снижению качества и количества значимых данных о последовательности.
Однако, если основное внимание в исследовании уделяется неполиаденилированной РНК, этап экстракции РНК должен быть адаптирован, чтобы избежать отбрасывания малой РНК (в случае экстракции РНК на основе колонки) и дать предпочтение методам истощения рибосом, а не отбора поли-А для входа в конвейер.
Для обеспечения высокого качества РНК, правильной фрагментации и подходящего качества РНК, обогащенной m6A и преобразованной BS, для подготовки библиотеки мы настоятельно рекомендуем использовать анализатор фрагментов или биоанализатор. Однако это оборудование не всегда доступно. В качестве альтернативы качество РНК, мРНК и размер фрагментированной РНК также могут быть оценены путем визуализации на агарозном геле. Альтернативно, подготовка библиотеки может быть выполнена без предварительной оценки количества РНК.
Мы использовали технику MeRIP-Seq16 на основе антител для изучения эпитранскриптомного ландшафта m6A. Данная методика основана на иммунопреципитации РНК и является успешной; однако некоторые шаги требуют тщательной оптимизации и могут быть критическими. Хотя было описано, что метилирование m6A происходит в основном в рамках консенсусной последовательности RRA*CH, этот мотив очень часто встречается вдоль молекул мРНК и не позволяет точно идентифицировать метилированный участок. Таким образом, крайне важно достичь воспроизводимой и последовательной фрагментации РНК, генерируя небольшие фрагменты РНК, для улучшения разрешения на основе RIP. В этом протоколе мы рекомендуем оптимизированную процедуру, обеспечивающую воспроизводимые и последовательные результаты в наших экспериментальных условиях; однако этот этап фрагментации может потребовать дальнейшей оптимизации в соответствии с конкретными характеристиками выборки.
Недавно была описана новая методика, позволяющая прямое секвенирование m6A. Он основан на использовании специфических вариантов обратной транскриптазы, которые демонстрируют уникальные RT-сигнатуры в ответ на столкновение с модификацией РНК m6A24. Эта технология, при тщательной оптимизации, может обойти основное ограничение, с которым сталкивается MeRIP-Seq (уменьшение количества исходного материала и обеспечение более высокого разрешения). Для изучения модификации m5C мы решили использовать метод конверсии бисульфитов для обнаружения с разрешением нуклеотидов модифицированных остатков C. Чтобы снизить частоту ложных срабатываний из-за наличия вторичных структур РНК, мы выполнили 3 цикла денатурации / превращения бисульфита и дополнительно контролировали скорость превращения бисульфита благодаря использованию элементов управления всплесками ERCC. Одним из ограничений, связанных с этим методом, является то, что превращение бисульфита очень жесткое, и три цикла денатурации / превращения бисульфита могут разрушать некоторые РНК и, следовательно, уменьшать разрешение. Однако в наших настройках мы решили довольствоваться потенциально немного более низким разрешением, чтобы повысить качество набора данных.
Благодаря этим оптимизациям и контролю мы смогли обеспечить надежный и надежный рабочий процесс, который можно использовать для исследования эпитранскриптомного ландшафта и его изменения в контексте вирусных инфекций, взаимодействий хозяин-патоген или любого воздействия конкретных методов лечения.

Давно известно, что молекулы РНК могут быть модифицированы, и на сегодняшний день описано более 150 посттранскрипционных модификаций1. Они заключаются в добавлении химических групп, главным образом метильных групп, практически к любому положению пиримидиновых и пуриновых колец молекул РНК2. Уже было показано, что такие посттранскрипционные модификации сильно обогащены трансферной РНК (тРНК) и рибосомной РНК (рРНК) и недавно были описаны на молекулах мРНК.
Появление новых технологий, таких как секвенирование следующего поколения (NGS), и производство специфических антител, распознающих определенные химические модификации, позволили впервые исследовать местоположение и частоту конкретных химических модификаций на уровне транскриптома. Эти достижения привели к лучшему пониманию модификаций РНК и картированию нескольких модификаций на молекулах мРНК3,4.
В то время как эпигенетика исследует роль модификаций ДНК и гистонов в регуляции транскриптома, эпитранскриптомика аналогичным образом фокусируется на модификациях РНК и их роли. Исследование эпитранскриптомных модификаций предоставляет новые возможности для выявления новых механизмов регуляции, которые могут настраивать различные клеточные процессы (т.е. сплайсинг, экспорт, стабильность и трансляцию РНК)5. Поэтому неудивительно, что недавние исследования обнаружили множество эпитранскриптомных модификаций при вирусной инфекции как в клеточных, так и в вирусных РНК6. Вирусы, исследованные до сих пор, включают как ДНК, так и РНК-вирусы; среди них ВИЧ можно рассматривать как новаторский пример. В целом, открытие метилирования РНК в контексте вирусных инфекций может позволить исследовать еще не описанные механизмы вирусной экспрессии или репликации, тем самым предоставляя новые инструменты и цели для их контроля7.
В области эпитранскриптомики ВИЧ модификации вирусных транскриптов были широко исследованы и показали, что наличие этой модификации было полезно для репликации вируса8,9,10,11,12,13. На сегодняшний день различные методы могут быть использованы для обнаружения эпитранскриптомных меток на уровне транскриптома. Наиболее часто используемые методы идентификации m6A основаны на методах иммунного осаждения, таких как MeRIP-Seq и miCLIP. В то время как MeRIP-Seq полагается на фрагментацию РНК для захвата фрагментов, содержащих метилированные остатки, miCLIP основан на генерации специфических сигнатурных мутаций антител α-m6A при Сшивании УФ-излучения РНК-антитела, что позволяет более точное картирование.
Обнаружение модификации m5C может быть достигнуто либо с помощью технологий на основе антител, аналогичных обнаружению m6A (m5C RIP), либо путем конверсии бисульфита, либо с помощью AZA-IP, либо с помощью miCLIP. Как Aza-IP, так и m5C miCLIP используют специфическую метилтрансферазу в качестве приманки для нацеливания на РНК при прохождении метилирования РНК. В Aza-IP клетки-мишени подвергаются воздействию 5-азацитидина, что приводит к случайному введению цитидиновых аналоговых 5-азацитидиновых сайтов в зарождающуюся РНК. В miCLIP метилтрансфераза NSun2 генетически модифицирована для содержания мутации C271A14,15.
В этой работе мы фокусируемся на двойной характеристике модификаций m6A и m5C в инфицированных клетках, используя ВИЧ в качестве модели. После методологической оптимизации мы разработали рабочий процесс, который сочетает в себе иммунопреципитацию метилированной РНК (MeRIP) и конверсию бисульфита РНК (BS), что позволяет одновременно исследовать эпитранскриптомные метки m6A и m5C на уровне транскриптома как в клеточном, так и в вирусном контекстах. Этот рабочий процесс может быть реализован на клеточных экстрактах РНК, а также на РНК, выделенной из вирусных частиц.
Подход метилированной РНК ImmunoPrecipitation (MeRIP)16 , позволяющий исследовать m6A на уровне транскриптома, хорошо известен, и на сегодняшний день коммерчески доступен массив m6A-специфических антител17. Этот метод заключается в селективном захвате м6А-содержащих фрагментов РНК с использованием м6А-специфического антитела. Двумя основными недостатками этого метода являются (i) ограниченное разрешение, которое сильно зависит от размера фрагментов РНК и, таким образом, обеспечивает приблизительное местоположение и область, содержащую метилированный остаток, и (ii) большое количество материала, необходимого для выполнения анализа. В следующем оптимизированном протоколе мы стандартизировали размер фрагмента примерно до 150 нт и уменьшили количество исходного материала с 10 мкг поли-А-выбранной РНК, которая в настоящее время является рекомендуемым количеством исходного материала, до всего лишь 1 мкг поли-А-выбранной РНК. Мы также максимизировали эффективность восстановления фрагментов РНК m6A, связанных со специфическими антителами, используя элюирование с помощью конкурентного подхода с пептидом m6A вместо более традиционных и менее специфических методов элюирования с использованием методов на основе фенола или протеиназы K. Однако основным ограничением этого анализа на основе RIP остается неоптимальное разрешение, которое не позволяет идентифицировать точный модифицированный нуклеотид А.
Анализ марки m5C в настоящее время может быть выполнен с использованием двух различных подходов: метода на основе RIP с m5C-специфическими антителами и конверсией РНК-бисульфита. Поскольку RIP предлагает только ограниченное разрешение на идентификацию метилированного остатка, мы использовали бисульфитовую конверсию, которая может предложить разрешение одного нуклеотида. Воздействие РНК бисульфита (BS) приводит к дезаминированию цитозина, тем самым превращая остаток цитозина в урацил. Таким образом, во время реакции превращения бисульфита РНК каждый неметилированный цитозин дезаминируется и превращается в урацил, при этом присутствие метильной группы в положении 5 цитозина оказывает защитное действие, предотвращая дезаминирование, индуцированное BS, и сохраняя остаток цитозина. Подход, основанный на BS, позволяет обнаруживать модифицированный нуклеотид m5C с разрешением одного основания и оценивать частоту метилирования каждого транскрипта, обеспечивая понимание динамики модификации m5C18. Однако основное ограничение этого метода зависит от ложноположительной скорости метилированных остатков. Действительно, конверсия BS эффективна на одноцепочечной РНК с доступными остатками C. Однако наличие плотной вторичной структуры РНК может маскировать положение N5C и препятствовать конверсии BS, что приводит к неметилированным остаткам C, которые не превращаются в остатки U, и, следовательно, ложноположительным результатам. Чтобы обойти эту проблему и свести к минимуму частоту ложных срабатываний, мы применили 3 цикла денатурации и конверсии бисульфитов19. Мы также ввели 2 контрольных элемента в образцах, чтобы можно было оценить эффективность конверсии бисульфита: мы увеличили контроль секвенирования ERCC (неметилированные стандартизированные и коммерчески доступные последовательности)20, а также поли-А-обедненные РНК для оценки скорости конверсии бисульфита, с одной стороны, и для проверки с помощью ОТ-ПЦР наличия известного и хорошо законсервированного метилированного сайта C4447, на 28S рибосомной РНК с другой стороны21.
В области вирусологии соединение этих двух эпитранскриптомных методов исследования с секвенированием следующего поколения и точным биоинформационным анализом позволяет проводить углубленное изучение динамики m6A и m5C (т.е. временных изменений модификации РНК, которые могут произойти при вирусной инфекции и могут выявить множество новых терапевтически значимых целей для клинического использования).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrime Pfx SuperMix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12344-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ RNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>EZR5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-472-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-471-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina TruSeq Stranded mRNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Beads A/G Blend</td>
			<td>Merck</td>
			<td>16-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-Methyladenosine, 5&#8242;-monophosphate sodium salt (m6A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2780-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse IgG</td>
			<td>Merk</td>
			<td>12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo(dT)25</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61005,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRapace</td>
			<td>Stratec</td>
			<td>1020220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick RNA Viral Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Fragmentation Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv

Роль модификаций РНК в биологических процессах была в центре внимания все большего числа исследований в последние несколько лет и в настоящее время известна как эпитранскриптомика. Среди прочего, модификации РНК N6-метиладенозина (m6A) и 5-метилцитозина (m5C) были описаны на молекулах мРНК и могут играть роль в модуляции клеточных процессов. Таким образом, эпитранскриптомика является новым слоем регуляции, который необходимо рассматривать в дополнение к транскриптомному анализу, поскольку он также может быть изменен или модулирован воздействием любого химического или биологического агента, включая вирусные инфекции.
Здесь мы представляем рабочий процесс, который позволяет анализировать совместный клеточный и вирусный эпитранскриптомный ландшафт меток m6A и m5C одновременно, в клетках, инфицированных или не инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). При выделении и фрагментации мРНК из ВИЧ-инфицированных и неинфицированных клеток мы использовали две различные процедуры: MeRIP-Seq, метод на основе иммунопреципитации РНК, для обогащения фрагментов РНК, содержащих метку m6A, и BS-Seq, метод на основе конверсии бисульфита, для идентификации метки m5C с разрешением одного нуклеотида. После метилирования-специфического захвата библиотеки РНК подготавливаются для высокопроизводительного секвенирования. Мы также разработали специальный конвейер биоинформатики для идентификации дифференциально метилированных (DM) транскриптов независимо от их базального профиля экспрессии.
В целом, методология позволяет исследовать несколько эпитранскриптомных меток одновременно и предоставляет атлас транскриптов СД при вирусной инфекции или любом другом клеточном возмущении. Этот подход предлагает новые возможности для выявления новых игроков и новых механизмов клеточного ответа, таких как клеточные факторы, способствующие или ограничивающие репликацию вируса.

Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Роль модификаций РНК в вирусных инфекциях только начинает изучаться и может выявить новые механизмы взаимодействия вируса и хозяина. В этой работе мы предоставляем конвейер для исследования модификаций РНК m6A и m5C в контексте вирусных инфекций.

Изучение эпитранскриптомов m6A и m5C при вирусной инфекции: пример с ВИЧ

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

Интервью: ВИЧ-1 провирусной Иссечение ДНК Использование Evolved рекомбиназы

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Протоколы для устного Заражение чешуекрылых Личинки с Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

Изучение когнитивных функций у новорожденных, детей и взрослых с ближней инфракрасной спектроскопии

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Характеризуя травоядным механизмы сопротивления: Spittlebugs на Brachiaria Sрр. как пример

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Измерение осмотического водопроницаемость Коэффициент (P<sub&gt; F</sub&gt;) Из сферических ячеек: изолированные протопласты растений в качестве примера

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

Инфильтрации центрифугирования Техника для извлечения апопластической Жидкость из листьев растений, используя<em&gt; Phaseolus обыкновенная</em&gt; Как пример

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Трансфекции клеток RAW264.7 с люциферазы гена

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Оценка минеральной доступности в кормах для рыб с использованием дополнительных методов, продемонстрированная на примере цинка в атлантическом лососе

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Одноклеточная микро-аспирация в качестве альтернативной стратегии для флуоресценции активированной сортировки клеток для гигантского разделения вирусной смеси

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Выделение, пролиферация и дифференциация стволовых клеток, полученных из адипозы макаки-резуса

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...