Name: exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv
Uploaded: 2022-03-05T13:00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (subvenciones 31003A_166412 y 314730_188877).

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Los autores no tienen nada que revelar.

El papel de las modificaciones del ARN en la infección viral aún se desconoce en gran medida. Una mejor comprensión del papel de las modificaciones epitranscriptómicas en el contexto de la infección viral podría contribuir a la búsqueda de nuevos objetivos de tratamiento antiviral.
En este trabajo, proporcionamos un flujo de trabajo completo que permite la investigación de los epitranscriptomas m6A y m5C de las células infectadas. Dependiendo de la cuestión biológica, aconsejamos utilizar ARN seleccionado poli-A como material de partida. Aunque es opcional, ya que la tubería podría usarse con ARN total, es importante tener en cuenta que los ARNr, así como los ARN pequeños, están altamente modificados y contienen un número importante de residuos metilados. Esto podría resultar en una disminución de la calidad y cantidad de datos de secuenciación significativos.
Sin embargo, si el enfoque del estudio es el ARN no poliadenilado, la etapa de extracción de ARN debe adaptarse para evitar descartar el ARN pequeño (en caso de extracción de ARN basado en columna) y para privilegiar las técnicas de agotamiento de ribosomas en lugar de la selección de poli-A para ingresar a la tubería.
Con el fin de garantizar un ARN de alta calidad, una fragmentación correcta y una calidad adecuada de ARN enriquecido con m6A y convertido en BS para la preparación de la biblioteca, recomendamos encarecidamente utilizar un analizador de fragmentos o un bioanalizador. Sin embargo, este equipo no siempre está disponible. Como alternativa, la calidad del ARN, el ARNm y el tamaño del ARN fragmentado también podrían evaluarse mediante visualización en gel de agarosa. Alternativamente, la preparación de la biblioteca se puede realizar sin una evaluación previa de la cantidad de ARN.
Utilizamos la técnica MeRIP-Seq16 basada en anticuerpos para explorar el panorama epitranscriptómico m6A. Esta técnica se basa en la inmunoprecipitación de ARN y tiene éxito; sin embargo, algunos pasos necesitan una optimización cuidadosa y pueden ser críticos. Aunque se ha descrito que la metilación m6A ocurre principalmente dentro de la secuencia de consenso RRA*CH, este motivo es muy frecuente a lo largo de las moléculas de ARNm y no permite la identificación precisa del sitio metilado. Por lo tanto, es fundamental lograr una fragmentación de ARN reproducible y consistente, generando pequeños fragmentos de ARN, para mejorar la resolución basada en RIP. En este protocolo, recomendamos un procedimiento optimizado, proporcionando resultados reproducibles y consistentes en nuestro entorno experimental; sin embargo, este paso de fragmentación puede necesitar una mayor optimización de acuerdo con características de muestra específicas.
Recientemente se describió una nueva técnica que permite la secuenciación directa m6A. Se basa en el uso de variantes específicas de transcriptasa inversa que exhiben firmas RT únicas como respuesta a la modificación del ARN m6A encontrada24. Esta tecnología, tras una cuidadosa optimización, podría eludir la principal limitación que enfrenta MeRIP-Seq (disminuir la cantidad de material inicial y permitir una mayor resolución). Para explorar la modificación m5C decidimos utilizar la técnica de conversión de bisulfito para detectar a resolución de nucleótidos los residuos de C modificados. Con el fin de reducir la tasa de falsos positivos debido a la presencia de estructuras secundarias de ARN, realizamos 3 ciclos de desnaturalización/ conversión de bisulfito y controlamos aún más el rendimiento de la tasa de conversión de bisulfito gracias al uso de controles de pico ERCC. Una de las limitaciones relacionadas con esta técnica es que la conversión de bisulfito es muy dura y tres ciclos de desnaturalización / conversión de bisulfito podrían degradar parte del ARN y, por lo tanto, reducir la resolución. Sin embargo, en nuestra configuración, elegimos conformarnos con una resolución potencialmente ligeramente más baja para aumentar la calidad del conjunto de datos.
Gracias a estas optimizaciones y controles, pudimos proporcionar un flujo de trabajo confiable y sólido que puede ser explotado para investigar el panorama epitranscriptómico y su alteración en el contexto de infecciones virales, interacciones huésped-patógeno o cualquier exposición a tratamientos específicos.

Desde hace tiempo se sabe que las moléculas de ARN pueden modificarse, y hasta la fecha se han descrito más de 150 modificaciones post-transcripcionales1. Consisten en la adición de grupos químicos, principalmente grupos metilo, a prácticamente cualquier posición de los anillos de pirimidina y purina de las moléculas de ARN2. Ya se ha demostrado que tales modificaciones post-transcripcionales están altamente enriquecidas en ARN de transferencia (ARNt) y ARN ribosómico (ARNr) y recientemente también se han descrito en moléculas de ARNm.
El auge de las nuevas tecnologías, como la secuenciación de próxima generación (NGS), y la producción de anticuerpos específicos que reconocen modificaciones químicas definidas permitieron, por primera vez, la investigación de la ubicación y la frecuencia de modificaciones químicas específicas a nivel de transcriptoma. Estos avances han llevado a una mejor comprensión de las modificaciones de ARN y al mapeo de varias modificaciones en moléculas de ARNm3,4.
Mientras que la epigenética investiga el papel de las modificaciones del ADN y las histonas en la regulación del transcriptoma, la epitranscriptómica de manera similar se centra en las modificaciones del ARN y su papel. La investigación de las modificaciones epitranscriptómicas ofrece nuevas oportunidades para destacar nuevos mecanismos de regulación que pueden sintonizar una variedad de procesos celulares (es decir, empalme de ARN, exportación, estabilidad y traducción)5. Por lo tanto, no fue una gran sorpresa que estudios recientes descubrieran muchas modificaciones epitranscriptómicas sobre la infección viral en ARN celulares y virales6. Los virus investigados hasta ahora incluyen virus de ADN y ARN; entre ellos, el VIH puede considerarse como un ejemplo pionero. En conjunto, el descubrimiento de la metilación del ARN en el contexto de las infecciones virales puede permitir la investigación de mecanismos aún no descritos de expresión o replicación viral, proporcionando así nuevas herramientas y dianas para controlarlos7.
En el campo de la epitranscriptómica del VIH, las modificaciones de las transcripciones virales han sido ampliamente investigadas y han demostrado que la presencia de esta modificación fue beneficiosa para la replicación viral8,9,10,11,12,13. Hasta la fecha se pueden utilizar varias técnicas para detectar marcas epitranscriptómicas a nivel de transcriptoma. Las técnicas más utilizadas para la identificación de m6A se basan en técnicas de precipitación inmune como MeRIP-Seq y miCLIP. Mientras que MeRIP-Seq se basa en la fragmentación de ARN para capturar fragmentos que contienen residuos metilados, miCLIP se basa en la generación de mutaciones de firma específicas de anticuerpos α-m6A sobre la reticulación UV arn-anticuerpo, lo que permite un mapeo más preciso.
La detección de la modificación de m5C se puede lograr mediante tecnologías basadas en anticuerpos similares a la detección de m6A (m5C RIP), o mediante conversión de bisulfito o por AZA-IP o por miCLIP. Tanto Aza-IP como m5C miCLIP utilizan una metiltransferasa específica como cebo para atacar el ARN mientras pasan por la metilación del ARN. En Aza-IP, las células diana están expuestas a la 5-azacitidina, lo que resulta en la introducción aleatoria de sitios análogos de citidina 5-azacitidina en el ARN naciente. En miCLIP, la metiltransferasa NSun2 está modificada genéticamente para albergar la mutación C271A14,15.
En este trabajo, nos centramos en la caracterización dual de las modificaciones m6A y m5C en células infectadas, utilizando el VIH como modelo. Tras la optimización metodológica, hemos desarrollado un flujo de trabajo que combina la inmunoprecipitación de ARN metilado (MeRIP) y la conversión de bisulfito de ARN (BS), lo que permite la exploración simultánea de marcas epitranscriptómicas m6A y m5C a nivel de transcriptoma, tanto en contextos celulares como virales. Este flujo de trabajo se puede implementar en extractos de ARN celular, así como en ARN aislado de partículas virales.
El enfoque de Inmunoprecipitación de ARN Metilado (MeRIP)16 que permite la investigación de m6A a nivel de transcriptoma está bien establecido y una serie de anticuerpos específicos de m6A están disponibles comercialmente hasta la fecha17. Este método consiste en la captura selectiva de piezas de ARN que contienen m6A utilizando un anticuerpo específico de m6A. Los dos principales inconvenientes de esta técnica son (i) la resolución limitada, que depende en gran medida del tamaño de los fragmentos de ARN y, por lo tanto, proporciona una ubicación y región aproximadas que contienen el residuo metilado, y (ii) la gran cantidad de material necesario para realizar el análisis. En el siguiente protocolo optimizado, estandarizamos el tamaño del fragmento a aproximadamente 150 nt y redujimos la cantidad de material de partida de 10 μg de ARN seleccionado poli-A, que actualmente es la cantidad recomendada de material de partida, a solo 1 μg de ARN seleccionado poli-A. También maximizamos la eficiencia de recuperación de fragmentos de ARN m6A unidos a anticuerpos específicos utilizando una elución mediante un enfoque de competencia con un péptido m6A en lugar de métodos de elución más convencionales y menos específicos utilizando técnicas basadas en fenol o proteinasa K. La principal limitación de este ensayo basado en RIP, sin embargo, sigue siendo la resolución subóptima que no permite la identificación del nucleótido A modificado con precisión.
El análisis de la marca m5C se puede realizar actualmente utilizando dos enfoques diferentes: un método basado en RIP con anticuerpos específicos de m5C y la conversión de bisulfito de ARN. Como RIP ofrece solo una resolución limitada en la identificación del residuo metilado, utilizamos la conversión de bisulfito que puede ofrecer una resolución de un solo nucleótido. La exposición de ARN al bisulfito (BS) conduce a la desaminación de citosina, convirtiendo así el residuo de citosina en uracilo. Por lo tanto, durante la reacción de conversión de bisulfito de ARN, cada citosina no metilada se desamina y se convierte en uracilo, mientras que la presencia de un grupo metilo en la posición 5 de la citosina tiene un efecto protector, previniendo la desaminación inducida por BS y preservando el residuo de citosina. El enfoque basado en BS permite la detección de un nucleótido modificado m5C a una resolución de base única y la evaluación de la frecuencia de metilación de cada transcripción, proporcionando información sobre la dinámica de modificación de m5C18. Sin embargo, la principal limitación de esta técnica se basa en la tasa de falsos positivos de residuos metilados. De hecho, la conversión de BS es efectiva en ARN monocatenario con residuos de C accesibles. Sin embargo, la presencia de una estructura secundaria de ARN apretada podría enmascarar la posición de N5C y dificultar la conversión de BS, lo que resulta en residuos de C no metilados que no se convierten en residuos de U y, por lo tanto, falsos positivos. Para eludir este problema y minimizar la tasa de falsos positivos, aplicamos 3 rondas de ciclos de desnaturalización y conversión de bisulfito19. También introdujimos 2 controles en las muestras para permitir la estimación de la eficiencia de conversión de bisulfito: incorporamos controles de secuenciación ERCC (secuencias estandarizadas no metiladas y disponibles comercialmente)20, así como ARN poli-A-agotados para evaluar la tasa de conversión de bisulfito por un lado, y para verificar mediante RT-PCR la presencia de un sitio metilado conocido y bien conservado, C4447, en el ARN ribosómico 28S por otro lado21.
En el campo de la virología, el acoplamiento de estos dos métodos de investigación epitranscriptómica con la secuenciación de próxima generación y el análisis bioinformático preciso permite el estudio en profundidad de la dinámica m6A y m5C (es decir, los cambios temporales de modificación del ARN que podrían ocurrir en la infección viral y podrían descubrir una serie de nuevos objetivos terapéuticamente relevantes para uso clínico).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrime Pfx SuperMix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12344-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ RNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>EZR5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-472-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-471-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina TruSeq Stranded mRNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Beads A/G Blend</td>
			<td>Merck</td>
			<td>16-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-Methyladenosine, 5&#8242;-monophosphate sodium salt (m6A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2780-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse IgG</td>
			<td>Merk</td>
			<td>12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo(dT)25</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61005,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRapace</td>
			<td>Stratec</td>
			<td>1020220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick RNA Viral Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Fragmentation Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv

El papel de las modificaciones del ARN en los procesos biológicos ha sido el foco de un número creciente de estudios en los últimos años y se conoce hoy en día como epitranscriptómica. Entre otros, se han descrito modificaciones del ARN de N6-metiladenosina (m6A) y 5-metilcitosina (m5C) en moléculas de ARNm y pueden tener un papel en la modulación de los procesos celulares. La epitranscriptómica es, por lo tanto, una nueva capa de regulación que debe considerarse además de los análisis transcriptómicos, ya que también puede ser alterada o modulada por la exposición a cualquier agente químico o biológico, incluidas las infecciones virales.
Aquí, presentamos un flujo de trabajo que permite analizar el paisaje epitranscriptómico celular y viral conjunto de las marcas m6A y m5C simultáneamente, en células infectadas o no con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Tras el aislamiento y la fragmentación del ARNm de células infectadas y no infectadas por el VIH, utilizamos dos procedimientos diferentes: MeRIP-Seq, una técnica basada en la inmunoprecipitación de ARN, para enriquecer fragmentos de ARN que contienen la marca m6A y BS-Seq, una técnica basada en la conversión de bisulfito, para identificar la marca m5C a una resolución de nucleótido único. Tras la captura específica de metilación, las bibliotecas de ARN se preparan para la secuenciación de alto rendimiento. También desarrollamos una línea de bioinformática dedicada para identificar transcripciones diferencialmente metiladas (DM) independientemente de su perfil de expresión basal.
En general, la metodología permite la exploración de múltiples marcas epitranscriptómicas simultáneamente y proporciona un atlas de transcripciones de DM sobre infección viral o cualquier otra perturbación celular. Este enfoque ofrece nuevas oportunidades para identificar nuevos actores y nuevos mecanismos de respuesta celular, como los factores celulares que promueven o restringen la replicación viral.

Este flujo de trabajo ha demostrado ser útil para investigar el papel de la metilación de m6A y m5C en el contexto de la infección por VIH. Para esto, utilizamos un modelo de línea de células T CD4 + (SupT1) que infectamos con VIH o dejamos sin tratar. Comenzamos el flujo de trabajo con 50 millones de células por condición y obtuvimos un promedio de 500 μg de ARN total con un número de calidad de ARN de 10 (Figura 1A-B). Tras la selección de poli-A se recuperaron entre 10 y 12 μg de ARNm por condición (lo que representa aproximadamente el 2% del ARN total) (Figura 1B). En este punto, utilizamos 5 μg de ARN seleccionado poli-A para la tubería MeRIP-Seq y 1 μg para la tubería BS-Seq. Dado que el ARN del VIH está poliadenilado, no se necesita ninguna acción adicional y los procedimientos MeRIP-Seq y BS-Seq se pueden aplicar directamente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig01.jpg"> Figura 1: Preparación de ARN para aplicaciones posteriores. A) Flujo de trabajo que representa la preparación y distribución de ARN para tuberías simultáneas MeRIP-Seq y BS-Seq. Cada forma hexagonal rellena representa un tipo de modificación de ARN, como m6A (verde) o m5C (rosa). Se indican las cantidades de material de ARN necesarias para llevar a cabo el experimento. B) Resultados representativos que representan los perfiles de distribución de ARN esperados (tamaño y cantidad) en la extracción total de ARN (panel superior) y la selección de poli-A (panel inferior). Las muestras se cargaron en el analizador de fragmentos con un kit de sensibilidad estándar para evaluar la calidad del ARN antes de ingresar a procedimientos específicos de MeRIP-Seq y BS-Seq. RQN: número de calidad de ARN; nt: nucleótidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La tubería MeRIP-Seq es una técnica basada en la inmunoprecipitación de ARN que permite la investigación de la modificación de m6A a lo largo de las moléculas de ARN. Para esto, el ARN se fragmenta primero y luego se incuba con anticuerpos específicos de m6A acoplados a perlas magnéticas para la inmunoprecipitación y captura. Los fragmentos de ARN enriquecidos con MeRIP y la fracción intacta (entrada) se secuencian y comparan para identificar regiones de ARN modificadas con m6A y, por lo tanto, transcripciones metiladas con m6A (Figura 2A). La resolución de la técnica se basa en la eficiencia de la fragmentación del ARN. De hecho, los fragmentos más cortos permiten una localización más precisa del residuo m6A. Aquí, los ARN celulares seleccionados poli-A y los ARN virales se sometieron a fragmentación basada en iones con tampón de fragmentación de ARN durante 15 min en un volumen final de 20 μL para obtener fragmentos de ARN de 100-150 nt. A partir de 5 μg de ARNm, recuperamos 4,5 μg de ARN fragmentado, lo que corresponde a una tasa de recuperación del 90% (Figura 2B). Utilizamos 100 ng de ARN fragmentado y purificado como control de entrada, sometido directamente a la preparación y secuenciación de la biblioteca. El ARN restante (~4,4 μg) se procesó de acuerdo con la tubería MeRIP-Seq, que comienza con la incubación de ARN fragmentado con perlas unidas a anticuerpos específicos anti-m6A o a anticuerpos anti-IgG como control. El RIP específico de m6A (MeRIP) de 2,5 μg de ARN fragmentado permitió recuperar alrededor de 15 ng de material enriquecido con m6A que se sometió a preparación y secuenciación de bibliotecas (Figura 2B). Rip con control anti-IgG, como se esperaba, no produjo suficiente ARN para permitir un análisis adicional (Figura 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig02.jpg"> Figura 2: Canalización MeRIP-Seq. A) Representación esquemática del flujo de trabajo MeRIP-Seq y control de entrada. Tras la selección de poli-A, las muestras se fragmentaron en piezas de 120-150 nt y, ya sea directamente sometidas a secuenciación (100 ng, control de entrada), o utilizadas para inmunoprecipitación de ARN (2,5 μg, RIP) con anticuerpos específicos anti-m6A o anticuerpos anti-IgG como control negativo antes de la secuenciación. B) Resultados representativos que muestran perfiles de distribución de ARN esperados (tamaño y cantidad) sobre fragmentación (panel superior) y RIP (paneles inferiores, MeRIP: izquierda, control IgG: derecha). Las muestras se cargaron en el analizador de fragmentos para evaluar la calidad y la concentración de ARN antes de su posterior procesamiento para la preparación y secuenciación de la biblioteca. El análisis de ARN fragmentado se realizó utilizando el kit de sensibilidad estándar de ARN, mientras que el ARN inmunoprecipitado utilizó el kit de alta sensibilidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La tubería BS-Seq permite la exploración de la modificación del ARN m5C a resolución de nucleótidos y conduce a la identificación de transcripciones metiladas m5C. Tras la conversión de bisulfito, las citosinas no metiladas se convierten en uracilo, mientras que las citosinas metiladas permanecen sin cambios (Figura 3A). Debido a las duras condiciones del procedimiento de conversión de bisulfito (es decir, alta temperatura y bajo pH), los ARNm convertidos están altamente degradados (Figura 3B), sin embargo, esto no interfiere con la preparación y secuenciación de la biblioteca. La conversión de bisulfito es eficiente solo en ARN de cadena simple y, por lo tanto, puede verse obstaculizada potencialmente por estructuras secundarias de ARN de doble cadena. Para evaluar la eficiencia de la conversión C-U se introdujeron dos controles. Como control positivo, aprovechamos la presencia previamente descrita de una citosina altamente metilada en la posición C4447 del ARNr 28S23. Tras la amplificación y secuenciación por RT-PCR de un fragmento de 200 pb que rodea el sitio metilado, pudimos observar que todas las citosinas se convirtieron con éxito en uracilos, apareciendo así como timidinas en la secuencia de ADN, excepto la citosina en la posición 4447 que permaneció sin cambios. Como control de la tasa de conversión de bisulfito, utilizamos secuencias de ARN ERCC sintéticas disponibles comercialmente. Esta mezcla consiste en un conjunto de secuencias de ARN conocidas, no metiladas y poliadeniladas, con una variedad de estructuras secundarias y longitudes. Tras la preparación y secuenciación de la biblioteca, nos centramos en estas secuencias ERCC para calcular la tasa de conversión, que se puede realizar contando el número de C convertidos entre los residuos C totales en todas las secuencias ERCC y en cada muestra. Obtuvimos una tasa de conversión del 99,5%, confirmando la eficiencia y el éxito de la reacción de conversión de bisulfito (Figura 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig03.jpg"> Figura 3: Tubería BS-Seq. A) Representación esquemática del flujo de trabajo de BS-Seq. Tras la selección de poli-A, las muestras se exponen al bisulfito, lo que resulta en la conversión de C a U (debido a la desaminación) para residuos de C no metilados. Por el contrario, los residuos de C metilado (m5C) no se ven afectados por el tratamiento con bisulfito y permanecen sin cambios. B) Resultado representativo del perfil de distribución de ARN convertido en bisulfito (tamaño y cantidad) tras el análisis en el analizador de fragmentos con un kit de sensibilidad estándar. C) Electroferograma que muestra el resultado de secuenciación representativo del amplicón RT-PCR de la región que rodea el C 100% metilado en la posición 4447 en el ARNr 28S (resaltado en azul). Por el contrario, los residuos de C de la secuencia de referencia se identificaron como residuos T en la secuencia de amplicón debido al éxito de la conversión de bisulfito. D) Evaluación de la tasa de conversión de C-U mediante el análisis de secuencias de picos de ERCC en células infectadas y no infectadas por el VIH. La tasa de conversión media es del 99,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Las muestras enriquecidas con M6A, las muestras convertidas en bisulfito y los controles de entrada se procesan para la preparación de la biblioteca, la secuenciación y el análisis bioinformático (Figura 4). De acuerdo con el diseño experimental y la(s) pregunta(s) biológica(s) abordada(s), se pueden aplicar múltiples análisis bioinformáticos. Como prueba de principio aquí, mostramos resultados representativos de una aplicación potencial (es decir, el análisis de metilación diferencial), que se centra en la identificación de transcripciones diferencialmente metiladas inducidas por la infección por VIH. Brevemente, investigamos el nivel de metilación m6A o m5C de las transcripciones, independientemente de su nivel de expresión génica, tanto en células no infectadas como infectadas por el VIH, con el fin de comprender mejor el papel de las metilaciones de ARN durante el ciclo de vida viral. Tras la normalización de la expresión génica, identificamos que la transcripción ZNF469 estaba diferencialmente metilada por m6A de acuerdo con el estado de la infección, de hecho, esta transcripción no estaba metilada en células no infectadas, mientras que mostraba varios picos metilados en la infección por VIH (Figura 5A). Un análisis de metilación diferencial similar en m5C reveló que la transcripción de PHLPP1 contenía varios residuos metilados, que tienden a ser metilados con mayor frecuencia en la condición de VIH (Figura 5B). En este contexto, ambos análisis sugieren que la infección por VIH afecta al epitranscriptoma celular.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig04.jpg"> Figura 4: Representación esquemática del flujo de trabajo bioinformático para el análisis de datos m6A y m5C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig05.jpg"> Figura 5: Ejemplo de transcripciones diferencialmente metiladas tras la infección. A) Resultado representativo que muestra la metilación m6A de la transcripción de ZNF459 en células infectadas por VIH (verdes) y no infectadas (grises). La intensidad máxima (tras la sustracción de la expresión de entrada) se muestra en el eje y y la posición en el cromosoma a lo largo del eje x. El análisis de metilación diferencial revela que la transcripción de ZFN469 está hipermetilada tras la infección por VIH. B) Resultado representativo del gen metilado m5C en células infectadas por VIH (carril superior) y no infectadas (carril inferior). La altura de cada barra representa el número de lecturas por nucleótido y permite la evaluación de la cobertura. Cada residuo de C se representa en rojo, y la proporción de C metilado se representa en azul. La tasa exacta de metilación (%) se informa por encima de cada residuo de C. Las flechas resaltan C diferencialmente metilada estadísticamente significativa. Las muestras se visualizaron utilizando el visor IGV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

El papel de las modificaciones del ARN en las infecciones virales apenas está comenzando a explorarse y podría resaltar nuevos mecanismos de interacción virus-huésped. En este trabajo, proporcionamos una tubería para investigar las modificaciones de ARN m6A y m5C en el contexto de las infecciones virales.

Explorando los epitrancrismos de m6A y m5C sobre la infección viral: un ejemplo con el VIH

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

Hola, en este video le mostraremos cómo explorar los epitranscriptomas m6A y m5C sobre la infección viral. Para comenzar el experimento, necesitará 50 millones de células para los no infectados y 50 millones para la afección infectada. Para obtener un conjunto de datos de alta calidad tras el análisis, deberá lograr una infección universal.Aquí infectamos estas células con un vector basado en el VIH y medimos la GFP codificada viralmente por FACS. En este caso, teníamos el 80% de las células infectadas y continuamos con el flujo de trabajo comenzando con la extracción total de ARN. Así que dividimos las células en alícuotas de 10 millones cada una y las lijamos en 1 ml de Trizol.Luego agregamos 200 microlitros de cloroformo al lisado celular y lo mezclamos por inversión. En este punto, dejamos reposar el lisado durante tres minutos a temperatura ambiente y luego centrifugamos todas las muestras a alta velocidad durante 15 minutos a cuatro grados. Esperará ver una separación de fases en tres fases diferentes, como se muestra aquí.El ARN se asienta en la fase superior, por lo que transfiera cuidadosamente la fase acuosa a un tubo fresco prestando atención a no transferir la capa orgánica. En este punto, agregue 0.5 ml de isopropanol a la fase acuosa y mezcle cuidadosamente por inversión. Las muestras se pueden incubar una hora a 80 grados para garantizar la precipitación de ARN.Tras la centrifugación a alta velocidad, debería poder ver un buen pellet de ARN como se muestra aquí. Deseche cuidadosamente el sobrenadante ya sea por inversión o por pipeteo, prestando atención a no interrumpir el pellet. Luego lave el pellet de ARN con un ml de etanol de grado molecular al 75%.Y vórtice la muestra brevemente. Tras la centrifugación, asegúrese de recuperar una buena bolita de ARN blanco. Deseche el sobrenadante y deje que el gránulo de ARN se seque durante 15 minutos a temperatura ambiente.Resuspender cada pellet en 20 microlitros de agua y agrupar todas las muestras de la misma condición juntas. El ARN total ya está listo para el aislamiento de ARNm mediante selección de poli-A. Para cada muestra de 75 microgramos de ARN, prepare 200 microlitros de perlas magnéticas oligo-DT y lávelas en un ml de tampón de unión.Coloque el tubo en un soporte magnético y permita que las perlas se unan al imán durante una mezcla. Deseche el sobrenadante y repita el procedimiento para un segundo lavado. Luego retire las perlas de los soportes magnéticos y vuelva a suspenderlas cuidadosamente en 100 microlitros de tampón de unión.En este punto, prepare la muestra de ARN dividiéndolas en 75 microgramos de ARN por alícuota resuspendida en 100 microlitros de agua. Agregue 100 microlitros de tampón de unión e incube durante dos minutos a 65 grados. Luego gire las muestras e incube en hielo.Agregue 100 microlitros de perlas magnéticas lavadas a cada muestra de ARN y permita la unión en una rueda giratoria durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, coloque el tubo de nuevo en un estante magnético y déjelos incubar durante un minuto. Luego recupere el sobrenadante en un tubo fresco y manténgalo a un lado para una segunda ronda de aislamiento.Lave las cuentas dos veces con 200 microlitros de tampón de lavado y luego proceda a la elución. Para eluir el ARN seleccionado de poli-A de las perlas magnéticas, agregue 20 microlitros de TRIS HCl helado a cada muestra y pipetee cuidadosamente. Luego incuba tus muestras a 80 grados durante dos minutos para liberar el ARN de las perlas.Transfiera el sobrenadante que contiene ARN seleccionado de poli-A a un tubo fresco, teniendo cuidado de evitar el arrastre de perlas. El paso de elución, así como el paso de aislamiento, deben repetirse dos veces para aumentar el rendimiento de ARNm. El ARNm ahora está listo para ingresar a la tubería meRIP-Seq en el paso de fragmentación o ir directamente a la conversión de bisulfito.El primer paso para entrar en la canalización meRIP-Seq consiste en la fragmentación del ARNm. Para ello, se necesitan cinco microgramos de ARNm divididos en alícuotas de 18 microlitros en tubos de 0,2 mL. Para garantizar datos consistentes, es fundamental trabajar rápidamente y con solo unas pocas muestras en ese momento.Para este experimento se ha optimizado la fragmentación con el fin de obtener fragmentos de un tamaño entre 115 y 200 nucleótidos. Luego agregue dos microlitros de reactivo de fragmentación a cada tubo que contenga 18 microlitros de ARNm teniendo cuidado al depositar la gota en la pared del tubo. Girar todas las muestras para permitir el contacto entre el reactivo y el ARN al mismo tiempo e incubar a 70 grados durante 15 minutos.Una vez finalizada la incubación, detener la reacción añadiendo dos microlitros de 0,5 M de EDTA. En este punto, puede purificar su ARNm fragmentado con el método de su elección y proceder a un control de calidad de ARN mediante analizador de fragmentos. Este paso es opcional, pero permitirá evaluar el tamaño del fragmento antes de activar la precipitación de ARN.Como se puede ver aquí en el cuarto carril, obtenemos para ambos nuestro fragmento de muestra de alrededor de 150 nucleótidos cada uno. Luego procedimos con meRIP-Seq. El primer paso consiste en un par de perlas magnéticas A/G con anticuerpos anti-m6A o controles IgG.Para cada plan de reacción, transfiera 25 microlitros de perlas magnéticas a un tubo fresco. Tenga en cuenta que necesitará al menos una condición específica de m6A y una condición de control. Lave cada 25 microlitros de perlas con 250 microlitros de tampón IP.Resusponga suavemente las perlas canalizando hacia arriba y hacia abajo y coloque el tubo en la rejilla magnética durante un minuto para permitir la separación de las perlas. Retire y deseche el sobrenadante, prestando atención a no aspirar las perlas magnéticas y repita el paso de lavado una vez. Luego vuelva a suspender las perlas magnéticas en 100 microlitros de búfer IP por cada 25 microlitros de volumen original de cuentas.Prepare y etiquete un tubo por cada condición. En nuestro caso, tendremos dos tubos para la condición infectada, uno para m6A y otro para el control de IgG, y dos tubos para la condición no infectada. Luego agregue 100 microlitros de cuentas lavadas en cada tubo.Las perlas ahora están listas para combinarse con anticuerpos específicos o controles de IgG. Agregue cinco microgramos de anticuerpo anti-m6A específico o anticuerpo de control anti-IgG a cada tubo que contenga 100 microlitros de perlas magnéticas lavadas. Permita la conjugación anticuerpo-perlas incubando el tubo 30 minutos en una rueda giratoria.Mientras tanto, proceda con la preparación de la muestra. Para cada condición planificada, ya sea específica de m6A o control de IgG, su material de partida será de 2.5 microgramos de ARNm fragmentado resuspendido 100 microlitros de agua. Para tener un volumen de reacción final de 500 microlitros, agregue 295 microlitros de agua a cada muestra.Agregue luego cinco microlitros de inhibidor de la ARNasa concentrado a 40 unidades por microlitro para una cantidad total de 200 unidades por muestra y mezcle suavemente. Finalmente agregue 100 microlitros de búfer IP concentrado 5X a cada tubo. Las muestras ya están listas para la reacción de precipitación inmune.Recupere las perlas magnéticas junto con el anticuerpo de la rueda giratoria y gírelas hacia abajo. Agregue luego 500 microlitros de las muestras previamente preparadas a cada 100 microlitros de cuentas junto con los anticuerpos específicos. Mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces para resuspendir completamente las cuentas.Incubelos o su reacción meRIP en una rueda giratoria a cuatro grados durante dos horas. Una vez que termine la incubación, gire hacia abajo cada tubo y colóquelos en una rejilla magnética durante un minuto para permitir la separación de cuentas. Luego retire la fracción no unida y colóquela en un tubo nuevo y guárdela para un análisis más detallado, si es necesario.Retire el imán del bastidor y vuelva a suspender todas las muestras en 500 microlitros de búfer IP. Resuspender cada muestra cuidadosamente mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Inserte el imán en la rejilla, incube durante un minuto y luego retire cuidadosamente el sobrenadante.Repita el lavado dos veces y luego proceda con la elución. Para cada par de muestras, m6A específicas y de control, prepare 225 microlitros de tampón de elución que contengan 20 milimolares de m6A purificados. A continuación, añadir 100 microlitros de tampón de elución por muestra.Incubar toda la muestra una hora a cuatro grados en un balancín. Luego recoja toda la muestra de ARN enriquecido con m6A en un tubo fresco y proceda con una segunda ronda de elución. Purifique el ARN enriquecido con m6A con el método de su elección Y luego, en este punto, las muestras están listas para la preparación y secuenciación de la biblioteca.Para investigar la modificación de m5C, utilizamos la conversión de bisulfito. Comience el experimento con 500 nanogramos de ARN poliadenilado. Aunque es opcional, agregar a su muestra 500 picogramos de ARN agotado de poli-A para garantizar la representación ribosómica y 0.5 microlitros de secuencia sintética disponible comercialmente le permitirá evaluar la tasa de conversión de bisulfito en la secuenciación.Ajuste su muestra a un volumen final de 20 microlitros en agua y luego agregue 130 microlitros de reactivo de conversión de ARN a cada muestra. Mezcle cuidadosamente canalizando hacia arriba y hacia abajo y gire hacia abajo toda la muestra para asegurarse de que no queden gotas en el costado de los tubos. Incubar toda la muestra en una máquina de PCR durante tres ciclos de desnaturalización a 70 grados durante cinco minutos y conversión de bisulfito a 54 grados durante 45 minutos.Realice la desaminación en columna agregando directamente sobre una columna vacía, 250 microlitros de tampón de unión de ARN, 150 microlitros de su muestra convertida en bisulfito. Mezcle la muestra canalizando hacia arriba y hacia abajo, pero prestando atención a no tocar los filtros de columna. Agregue 400 microlitros de etanol 95-100% a la mezcla tampón de unión de ARN de muestra directamente en la columna.Cierre la tapa y mezcle inmediatamente por inversión. Gire hacia abajo su muestra durante 30 segundos y descarte el flujo. Lave su columna con tampón de lavado y luego agregue 200 microlitros de solución de desulfonación al centro de cada columna.Incuba toda tu muestra durante 30 minutos a temperatura ambiente. Gire la muestra durante 30 segundos y luego proceda con dos rondas de lavado. Agregue 400 microlitros de tampón de lavado a cada muestra, centrífique durante 30 segundos a toda velocidad y deseche el flujo.Coloque la columna en un nuevo tubo vacío y eluya el ARN convertido en bisulfito en 20 microlitros de agua. Controle la eficiencia de conversión de bisulfito mediante RT-qPCR y luego proceda a la preparación y secuenciación de la biblioteca. Tras el análisis bioinformático, aquí hay algunos ejemplos de resultados que puede obtener con este flujo de trabajo.Aquí comparamos el epitranscriptoma de las células infectadas por el VIH frente a las células no infectadas. a las 24 horas después de la infección. En el panel A, puede ver los resultados que obtenemos explorando el epitranscriptome m6A.En este gráfico, trazamos las lecturas enriquecidas m6A sobre el análisis meRIP-Seq. Podemos ver muy bien que un dedo de zinc está hipermetilado 24 horas después de la infección. Realizamos el mismo tipo de análisis para la investigación del epitranscriptoma m5C en el panel B.In este gráfico, cada citosina no metilada se muestra en rojo, mientras que la proporción de citosina que ha sido metilada m5C se muestra en azul.Como puede ver, PHLPP1, las tres citosinas que están hipermetiladas 24 horas después de la infección por VIH. En general, este flujo de trabajo permite investigar tanto el epitranscriptoma M6A como el m5C de las células infectadas y también se puede aplicar como tal en partículas virales. La comprensión de la infección viral es capaz de modificar el paisaje epitranscriptómico del huésped que nos dará acceso a una nueva capa de regulación.La investigación de transcripciones metiladas diferenciales sobre la infección viral proporcionará, por supuesto, un recurso valioso para una nueva intervención terapéutica. En el enlace aquí abajo puede encontrar nuestro recurso de acceso abierto para la investigación de la transcripción metilada diferencial sobre la infección por VIH a lo largo del tiempo.

Research

JoVE Journal

Biology

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

Entrevista: El VIH-1 La escisión del ADN proviral uso de una recombinasa evolucionado

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Investigación

Biología

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Protocolos para la infección oral de larvas de lepidópteros con Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

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Explorar las funciones cognitivas en bebés, niños y adultos con Espectroscopia de Infrarrojo Cercano

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

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Caracterización de los mecanismos de resistencia Herbívoro: salivazo en Brachiaria Spp. como ejemplo

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Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

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Medición de la osmótica de agua Coeficiente de Permeabilidad (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos de plantas aisladas como ejemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

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La técnica de infiltración-centrifugación para extracción de apoplástico fluido procedente de hojas de la planta Uso<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Como ejemplo

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Transfectar células RAW264.7 con un gen informador de luciferasa

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Evaluación de la disponibilidad de minerales en los alimentos para peces utilizando métodos complementarios demostrados con el ejemplo de zinc en el salmón del Atlántico

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

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Aislamiento, proliferación y diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo de macaco rhesus

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