Name: exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv
Uploaded: 2022-03-05T13:00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Swiss National Science Foundation (bidrag 31003A_166412 och 314730_188877).

<ol>
	<li>Machnicka, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways--2013+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways--2013 update.</a> Nucleic Acids Research. 41, 262-267 (2013).</li><li>Zaccara, S., Ries, R. J., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading,+writing+and+erasing+mRNA+methylation.">Reading, writing and erasing mRNA methylation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 608-624 (2019).</li><li>Davalos, V., Blanco, S., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Messenger+RNA+Modifications.">SnapShot: Messenger RNA Modifications.</a> Cell. 174 (2), 498 (2018).</li><li>Saletore, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+birth+of+the+Epitranscriptome:+deciphering+the+function+of+RNA+modifications.">The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).</li><li>Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications.">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2017).</li><li>Netzband, R., Pager, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+marks:+Emerging+modulators+of+RNA+virus+gene+expression.">Epitranscriptomic marks: Emerging modulators of RNA virus gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (3), 1576 (2020).</li><li>Pereira-Montecinos, C., Valiente-Echeverria, F., Soto-Rifo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+regulation+of+viral+replication.">Epitranscriptomic regulation of viral replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (4), 460-471 (2017).</li><li>Lichinchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+human+and+viral+m(6)A+RNA+methylomes+during+HIV-1+infection+of+T+cells.">Dynamics of the human and viral m(6)A RNA methylomes during HIV-1 infection of T cells.</a> Nature Microbiology. 1, 16011 (2016).</li><li>Courtney, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+Addition+of+m(5)C+to+HIV-1+Transcripts+Regulates+Viral+Gene+Expression.">Epitranscriptomic Addition of m(5)C to HIV-1 Transcripts Regulates Viral Gene Expression.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).</li><li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+m(6)A+Editing+of+HIV-1+mRNAs+Enhances+Viral+Gene+Expression.">Posttranscriptional m(6)A Editing of HIV-1 mRNAs Enhances Viral Gene Expression.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 675-685 (2016).</li><li>Tirumuru, N., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+envelope+proteins+up-regulate+N+(6)-methyladenosine+levels+of+cellular+RNA+independently+of+viral+replication.">HIV-1 envelope proteins up-regulate N (6)-methyladenosine levels of cellular RNA independently of viral replication.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3249-3260 (2019).</li><li>Tirumuru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+of+HIV-1+RNA+regulates+viral+infection+and+HIV-1+Gag+protein+expression.">N(6)-methyladenosine of HIV-1 RNA regulates viral infection and HIV-1 Gag protein expression.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell.">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> Frontiers in Virology. 1 (11), (2021).</li><li>Khoddami, V., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+target+profiling+of+RNA+cytosine+methyltransferases+using+the+mechanism-based+enrichment+procedure+Aza-IP.">Transcriptome-wide target profiling of RNA cytosine methyltransferases using the mechanism-based enrichment procedure Aza-IP.</a> Nature Protocols. 9 (2), 337-361 (2014).</li><li>Hussain, S., Aleksic, J., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (11), 215 (2013).</li><li>Dominissini, D., Moshitch-Moshkovitz, S., Salmon-Divon, M., Amariglio, N., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+mapping+of+N6-methyladenosine+by+m6A-seq+based+on+immunocapturing+and+massively+parallel+sequencing.">Transcriptome-wide mapping of N6-methyladenosine by m6A-seq based on immunocapturing and massively parallel sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (1), 176-189 (2013).</li><li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq.">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li><li>Shobbir Hussain, J. A., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (215), (2013).</li><li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+5-methylcytosine+profiles+in+poly(A)+RNA+from+mouse+embryonic+stem+cells+and+brain.">Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain.</a> Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).</li><li>Endrullat, C., Gl&#246;kler, J., Franke, P., Frohme, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+and+quality+management+in+next-generation+sequencing.">Standardization and quality management in next-generation sequencing.</a> Applied &amp; Translational Genomics. 10, 2-9 (2016).</li><li>Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+cytosine+methylation+analysis+by+bisulfite+sequencing.">RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 12 (2009).</li><li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell.">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> biorxiv. 1 (11), (2021).</li><li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+noncoding+RNA.">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and noncoding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li><li>Aschenbrenner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+DNA+Polymerase+for+Direct+m(6)+A+Sequencing.">Engineering of a DNA Polymerase for Direct m(6) A Sequencing.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 57 (2), 417-421 (2018).</li><li>Didion, J. P., Martin, M., Collins, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atropos:+specific,+sensitive,+and+speedy+trimming+of+sequencing+reads.">Atropos: specific, sensitive, and speedy trimming of sequencing reads.</a> PeerJ. 5, 3720 (2017).</li><li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISAT:+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements.">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Okonechnikov, K., Conesa, A., Garc&#237;a-Alcalde, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualimap+2:+advanced+multi-sample+quality+control+for+high-throughput+sequencing+data.">Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., K&#228;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet Journal. 17 (1), (2011).</li><li>Shen, W., Le, S., Li, Y., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeqKit:+A+Cross-Platform+and+Ultrafast+Toolkit+for+FASTA/Q+File+Manipulation.">SeqKit: A Cross-Platform and Ultrafast Toolkit for FASTA/Q File Manipulation.</a> PLOS ONE. 11 (10), 0163962 (2016).</li><li>Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=meRanTK:+methylated+RNA+analysis+ToolKit.">meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit.</a> Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Rollen av RNA ändringar i viral infektion är fortfarande i stort sett okänd. En bättre förståelse för rollen av epitranscriptomic modifieringar i samband med virusinfektion kan bidra till sökandet efter nya antivirala behandlingsmål.
I detta arbete tillhandahåller vi ett komplett arbetsflöde som möjliggör undersökning av m6A och m5C epitranscriptomes av infekterade celler. Beroende på den biologiska frågan rekommenderar vi att du använder poly-A-valt RNA som startmaterial. Även om det är valfritt, eftersom rörledningen kan användas med totalt RNA, är det viktigt att komma ihåg att rRNAs samt små RNAs är mycket modifierade och innehåller ett viktigt antal metylerade rester. Detta kan resultera i en minskad kvalitet och kvantitet av meningsfulla sekvenseringsdata.
Emellertid, om fokusera av studien är non-poly-adenylated RNA, bör RNA extraktion kliver anpassas för att undvika att kassera lilla RNA (i fall av kolonn-baserade RNA extraktion) och att privilegiera ribosom-utarmningtekniker i stället för poly-A val för att skriva in pipelinen.
För att säkerställa högkvalitativt RNA, korrekt fragmentering och lämplig m6A-berikad och BS-konverterad RNA-kvalitet för biblioteksberedning rekommenderar vi starkt att du använder en fragmentanalysator eller en bioanalyzer. Denna utrustning är dock inte alltid tillgänglig. Som ett alternativ kan kvaliteten på RNA, mRNA och storleken på fragmenterat RNA också bedömas genom visualisering på agarosgel. Alternativt kan biblioteksförberedelser utföras utan tidigare bedömning av RNA-kvantitet.
Vi använde den antikroppsbaserade MeRIP-Seq16-tekniken för att utforska det epitranskriptomiska landskapet m6A. Denna teknik är baserad på RNA immunoprecipitation och är framgångsrik. Vissa steg behöver dock noggrann optimering och kan vara kritiska. Även om m6A metylering har beskrivits främst inom konsensussekvensen RRA * CH, är detta motiv mycket frekvent längs mRNA-molekyler och tillåter inte exakt identifiering av det metylerade området. Det är därför viktigt att uppnå en reproducerbar och konsekvent RNA-fragmentering, som genererar små RNA-fragment, för att förbättra den RIP-baserade upplösningen. I det här protokollet rekommenderar vi en optimerad procedur som ger reproducerbara och konsekventa resultat i vår experimentella inställning; Detta fragmenteringssteg kan dock behöva ytterligare optimering enligt specifika exempelfunktioner.
Nyligen beskrevs en ny teknik som tillåter m6A direkt sekvensering. Det är baserat på användningen av specifika omvända transkriptasvarianter som uppvisar unika RT-signaturer som ett svar på att stöta på m6A RNA-modifiering24. Denna teknik, vid noggrann optimering, kan kringgå den stora begränsningen som merip-seq står inför (minska mängden initialt material och tillåta en högre upplösning). För att utforska m5C-modifieringen bestämde vi oss för att använda bisulfitkonverteringstekniken för att vid nukleotidupplösning upptäcka de modifierade C-resterna. För att minska den falska positiva hastigheten på grund av förekomsten av RNA sekundära strukturer, utförde vi 3 cykler av denaturation/bisulfite konvertering och ytterligare kontroll bisulfite konverteringsfrekvens prestanda tack vare användningen av ERCC spike-in kontroller. En av begränsningarna kopplade till denna teknik är att bisulfit omvandling är mycket hård och tre cykler av denaturation/bisulfite omvandling kan försämra vissa RNA och därmed minska upplösningen. I vår miljö valde vi dock att nöja oss med en potentiellt något lägre upplösning för att öka datauppsättningens kvalitet.
Tack vare dessa optimeringar och kontroller kunde vi tillhandahålla ett tillförlitligt och sunt arbetsflöde som kan utnyttjas för att undersöka det epitranskriptomiska landskapet och dess förändring i samband med virusinfektioner, värdpatogeninteraktioner eller exponering för specifika behandlingar.

Det är länge känt att RNA-molekyler kan modifieras, och mer än 150 post-transkriptionella modifieringar har beskrivits hittills1. De består i tillsats av kemiska grupper, främst metylgrupper, till praktiskt taget alla positioner av pyrimidin- och purinringar av RNA-molekyler2. Sådana post-transkriptionella modifieringar har redan visat sig vara mycket berikade i överföring RNA (tRNA) och ribosomal RNA (rRNA) och har nyligen beskrivits på mRNA-molekyler samt.
Uppkomsten av ny teknik, såsom nästa generations sekvensering (NGS), och produktionen av specifika antikroppar som erkänner bestämda kemiska modifieringar gjorde det för första gången möjligt att undersöka platsen och frekvensen av specifika kemiska modifieringar på transkriptomomfattande nivå. Dessa framsteg har lett till en bättre förståelse av RNA-modifieringar och till kartläggning av flera modifieringar på mRNA-molekyler3,4.
Medan epigenetik undersöker DNA: s roll och histonmodifieringar i transkriptomreglering, fokuserar epitranscriptomics på ett liknande sätt på RNA-modifieringar och deras roll. Undersökningen av epitranscriptomiska modifieringar ger nya möjligheter att lyfta fram nya regleringsmekanismer som kan finjustera en mängd olika cellulära processer (dvs. RNA-splitsning, export, stabilitet och översättning)5. Det var därför ingen stor överraskning att nyligen genomförda studier avslöjade många epitranscriptomiska modifieringar vid virusinfektion i både cellulära och virala RNAs6. Virus som hittills undersökts inkluderar både DNA- och RNA-virus; hiv kan betraktas som ett banbrytande exempel. Sammantaget kan upptäckten av RNA-metylering i samband med virusinfektioner tillåta undersökning av ännu obeskrivna mekanismer för virusuttryck eller replikering, vilket ger nya verktyg och mål för att kontrollera dem7.
Inom hiv-epitranscriptomics har modifieringar av virala transkriptioner undersökts i stor utsträckning och har visat att förekomsten av denna modifiering var fördelaktig för viral replikering8,9,10,11,12,13. Hittills kan olika tekniker användas för att upptäcka epitranscriptomiska märken på transkriptomnivå. De mest använda teknikerna för m6A-identifiering förlitar sig på immunutfällningstekniker som MeRIP-Seq och miCLIP. Medan MeRIP-Seq förlitar sig på RNA-fragmentering för att fånga fragment som innehåller metylerade rester, är miCLIP baserat på generering av α-m6A antikroppsspecifika signaturmutationer på RNA-antikropps UV-korslänkning, vilket möjliggör en mer exakt kartläggning.
Detektion av m5C-modifiering kan uppnås antingen genom antikroppsbaserad teknik som liknar m6A-detektion (m5C RIP) eller genom bisulfitkonvertering eller genom AZA-IP eller genom miCLIP. Både Aza-IP och m5C miCLIP använder en specifik metyltransferas som bete för att rikta in sig på RNA medan de genomgår RNA-metylering. I Aza-IP exponeras målceller för 5-azacytidin, vilket resulterar i slumpmässig introduktion av cytidinanaloga 5-azacytidin platser i gryende RNA. I miCLIP är NSun2 metyltransferas genetiskt modifierad för att hysa C271A mutationen14,15.
I detta arbete fokuserar vi på dubbel karakterisering av m6A- och m5C-modifieringar i infekterade celler, med HIV som modell. Vid metodoptimering har vi utvecklat ett arbetsflöde som kombinerar metylerad RNA immunoprecipitation (MeRIP) och RNA bisulfite conversion (BS), vilket möjliggör samtidig utforskning av m6A och m5C epitranscriptomic märken på en transkriptom-bred nivå, i både cellulära och virala sammanhang. Detta arbetsflöde kan implementeras på cellulära RNA-extrakt samt på RNA isolerat från viruspartiklar.
Metoden Methylated RNA ImmunoPrecipitation (MeRIP)16 som möjliggör undersökning av m6A på transkriptom-wide nivå är väl etablerad och en rad m6A-specifika antikroppar är kommersiellt tillgängliga hittills17. Denna metod består i selektiv avskiljning av m6A-innehållande RNA-bitar med hjälp av en m6A-specifik antikropp. De två största nackdelarna med denna teknik är i) den begränsade upplösningen, som är mycket beroende av storleken på RNA-fragment och därmed ger en ungefärlig plats och region som innehåller de metylerade resterna, och (ii) den stora mängd material som behövs för att utföra analysen. I följande optimerade protokoll standardiserade vi fragmentstorleken till ca 150 nt och minskade mängden startmaterial från 10 μg poly-A-valt RNA, som för närvarande är den rekommenderade mängden startmaterial, till endast 1 μg poly-A-valt RNA. Vi maximerade också återvinningseffektiviteten hos m6A RNA fragment bundna till specifika antikroppar med hjälp av en elution genom en konkurrensmetod med en m6A peptid i stället för mer konventionella och mindre specifika elution metoder med fenol-baserade tekniker eller proteinas K. Den huvudsakliga begränsningen av denna RIP-baserade analys är dock fortfarande den suboptimala upplösningen som inte tillåter identifiering av den exakta modifierade A-nukleotid.
Analys av m5C-märket kan för närvarande utföras med två olika metoder: en RIP-baserad metod med m5C-specifika antikroppar och RNA bisulfitkonvertering. Eftersom RIP endast erbjuder begränsad upplösning på identifiering av metylerade rester, använde vi bisulfitomvandling som kan erbjuda en enda nukleotidupplösning. RNA-exponering för bisulfit (BS) leder till cytosindeaminering och omvandlar därmed cytosinresterna till uracil. Således, under RNA bisulfite omvandlingsreaktionen, varje icke-metylerad cytosin deamineras och omvandlas till uracil, medan närvaron av en metylgrupp i position 5 av cytosin har en skyddande effekt, förhindra BS-inducerad deamination och bevara cytosin resterna. Den BS-baserade metoden möjliggör detektion av en m5C modifierad nukleotid vid en enda basupplösning och för bedömning av metyleringsfrekvensen för varje transkription, vilket ger insikter om m5C modifieringsdynamik18. Den huvudsakliga begränsningen av denna teknik förlitar sig dock på den falska positiva hastigheten av metylerade rester. BS-omvandlingen är faktiskt effektiv på enkelsträngat RNA med tillgängliga C-rester. Förekomsten av en snäv RNA sekundär struktur kan dock maskera N5C-positionen och hämma BS-omvandlingen, vilket resulterar i icke-metylerade C-rester som inte omvandlas till U-rester, och därmed falska positiva. För att kringgå det här problemet och minimera den falska positiva frekvensen tillämpade vi 3 omgångar av denaturering och bisulfitkonverteringscykler19. Vi införde också 2 kontroller i proverna för att möjliggöra uppskattning av bisulfitomvandlingseffektivitet: vi spikar in ERCC-sekvenseringskontroller (icke-metylerade standardiserade och kommersiellt tillgängliga sekvenser)20 samt poly-A-utarmade RNAs för att bedöma bisulfitomvandlingshastigheten å ena sidan och för att verifiera genom RT-PCR närvaron av ett känt och välkonserverat metylerat område, C4447, på 28S ribosomal RNA å ena sidan21.
Inom virologin möjliggör kopplingen av dessa två epitriskriptomiska undersökningsmetoder med nästa generations sekvensering och noggrann bioinformatisk analys en djupgående studie av m6A- och m5C-dynamiken (dvs. RNA-modifiering av tidsförändringar som kan uppstå vid virusinfektion och kan avslöja en rad nya terapeutiskt relevanta mål för klinisk användning).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrime Pfx SuperMix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12344-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ RNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>EZR5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-472-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-471-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina TruSeq Stranded mRNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Beads A/G Blend</td>
			<td>Merck</td>
			<td>16-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-Methyladenosine, 5&#8242;-monophosphate sodium salt (m6A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2780-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse IgG</td>
			<td>Merk</td>
			<td>12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo(dT)25</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61005,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRapace</td>
			<td>Stratec</td>
			<td>1020220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick RNA Viral Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Fragmentation Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv

RNA-modifieringarnas roll i biologiska processer har varit i fokus för ett ökande antal studier under de senaste åren och är idag känd som epitranscriptomics. Bland annat har N6-metyladenosin (m6A) och 5-metylcytosin (m5C) RNA-modifieringar beskrivits på mRNA-molekyler och kan ha en roll i modulering av cellulära processer. Epitranscriptomics är således ett nytt regleringslager som måste beaktas utöver transkriptomiska analyser, eftersom det också kan ändras eller moduleras genom exponering för något kemiskt eller biologiskt medel, inklusive virusinfektioner.
Här presenterar vi ett arbetsflöde som möjliggör analys av det gemensamma cellulära och virala epitranskriptomiska landskapet av m6A- och m5C-märkena samtidigt, i celler infekterade eller inte med humant immunbristvirus (HIV). Vid mRNA isolering och fragmentering från HIV- infekterade och icke-infekterade celler, använde vi två olika förfaranden: MeRIP-Seq, en RNA immunoprecipitation-baserad teknik, för att berika för RNA fragment som innehåller m6A märket och BS-Seq, en bisulfite konvertering-baserade teknik, för att identifiera m5C-märket vid en enda nukleotidupplösning. Vid metyleringsspecifik fångst förbereds RNA-bibliotek för sekvensering med hög genomströmning. Vi utvecklade också en dedikerad bioinformatik pipeline för att identifiera differentiellt metylerade (DM) transkriptioner oberoende av deras basala uttryck profil.
Sammantaget tillåter metoden utforskning av flera epitranscriptomic märken samtidigt och ger en atlas över DM transkript vid virusinfektion eller någon annan cell perturbation. Detta tillvägagångssätt erbjuder nya möjligheter att identifiera nya spelare och nya mekanismer för cellrespons, till exempel cellulära faktorer som främjar eller begränsar virusreplikering.

Detta arbetsflöde har visat sig användbart för att undersöka rollen av m6A och m5C metylering i samband med HIV-infektion. För detta använde vi en CD4 + T-cellinjemodell (SupT1) som vi antingen infekterar med HIV eller lämnas obehandlad. Vi startade arbetsflödet med 50 miljoner celler per tillstånd och erhöll i genomsnitt 500 μg totalt RNA med ett RNA-kvalitetsnummer på 10 (figur 1A-B). Vid poly-A urval hämtade vi mellan 10 och 12 μg mRNA per villkor (som representerar ca 2% av det totala RNA) (figur 1B). Vid denna tidpunkt använde vi 5 μg poly-A-valt RNA för MeRIP-Seq-rörledningen och 1 μg för BS-Seq-rörledningen. Eftersom HIV RNA är poly-adenylated, behövs inga ytterligare åtgärder och MeRIP-Seq och BS-Seq förfaranden kan tillämpas direkt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig01.jpg"> Figur 1: RNA-förberedelse för nedströmstillämpningar. A) Arbetsflöde som visar RNA-förberedelse och distribution för samtidiga MeRIP-Seq- och BS-Seq-rörledningar. Varje fylld sexkantig form representerar en RNA-modifieringstyp, till exempel m6A (grön) eller m5C (rosa). Mängder RNA-material som behövs för att utföra experimentet anges. B) Representativa resultat som visar förväntade RNA-distributionsprofiler (storlek och mängd) vid total RNA-extraktion (övre panel) och poly-A-urval (nedre panelen). Prover laddades på fragmentanalysatorn med standardkänslighetssats för att bedöma RNA-kvalitet innan de gick in i specifika MeRIP-Seq- och BS-Seq-procedurer. RQN: RNA-kvalitetsnummer; nt: nukleotider. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
MeRIP-Seq pipeline är en RNA immunoprecipitation-baserad teknik som möjliggör undersökning av m6A modifiering längs RNA-molekyler. För detta fragmenteras RNA först och inkuberas sedan med m6A-specifika antikroppar kopplade till magnetiska pärlor för immunoprecipitation och fångst. MeRIP-berikade RNA-fragment och den orörda (indatafraktionen) sekvenseras sedan och jämförs för att identifiera m6A-modifierade RNA-regioner och därmed m6A-metylerade transkriptioner (figur 2A). Upplösningen av tekniken förlitar sig på effektiviteten av RNA-fragmentering. I själva verket möjliggör kortare fragment en mer exakt lokalisering av m6A-resterna. Här utsattes cellulära poly-A-utvalda RNAs och virala RNAs för jonbaserad fragmentering med RNA fragmentering buffert under 15 min i en 20 μL slutlig volym för att erhålla RNA fragment av 100-150 nt. Från och med 5 μg mRNA, vi återhämtade 4,5 μg fragmenterat RNA, motsvarande en återvinningsgrad på 90% (figur 2B). Vi använde 100 ng fragmenterat, renat RNA som inmatningskontroll, utsatt direkt för biblioteksförberedelse och sekvensering. Det återstående RNA (~4,4 μg) bearbetades enligt MeRIP-Seq-rörledningen, som börjar med inkubation av fragmenterat RNA med pärlor bundna antingen till anti-m6A-specifika antikroppar eller till anti-IgG-antikroppar som kontroll. m6A-specifik RIP (MeRIP) på 2,5 μg fragmenterat RNA tillät hämtning av cirka 15 ng m6A-berikat material som genomgick biblioteksberedning och sekvensering (figur 2B). RIP med anti-IgG kontroll, som förväntat, gav inte tillräckligt med RNA för att möjliggöra ytterligare analys (figur 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig02.jpg"> Bild 2: MeRIP-Seq-pipeline. A) Schematisk representation av MeRIP-Seq-arbetsflöde och inmatningskontroll. Vid poly-A-urval fragmenterades proverna i 120-150 nt bitar och, antingen direkt utsatt för sekvensering (100 ng, inmatningskontroll) eller användes för RNA immunoprecipitation (2,5 μg, RIP) med anti-m6A-specifika antikroppar eller anti-IgG-antikroppar som negativ kontroll före sekvensering. B) Representativa resultat som visar förväntade RNA-distributionsprofiler (storlek och mängd) vid fragmentering (övre panel) och RIP (nedre paneler, MeRIP: vänster, IgG-kontroll: höger). Prover laddades på fragmentanalysator för att utvärdera RNA kvalitet och koncentration före vidare bearbetning till biblioteksberedning och sekvensering. Fragmenterad RNA-analys utfördes med hjälp av RNA standard känslighet kit medan immunoprecipitated RNA använde hög känslighet kit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
BS-Seq pipeline tillåter prospektering av m5C RNA modifiering vid nukleotid upplösning och leder till identifiering av m5C-metylerade transkriptioner. Vid omvandling av bisulfit omvandlas icke-metylerade cytosiner till uracil, medan metylerade cytosiner förblir oförändrade (figur 3A). På grund av de hårda förhållandena i bisulfitkonverteringsförfarandet (dvs. hög temperatur och lågt pH) försämras konverterade mRNAs mycket (figur 3B), men detta stör inte biblioteksförberedelser och sekvensering. Bisulfitkonvertering är effektiv endast på enkelsträngat RNA och kan därmed potentiellt hindras av sekundära dubbelsträngade RNA-strukturer. För att utvärdera effektiviteten i C-U-konverteringen införde vi två kontroller. Som en positiv kontroll, vi utnyttjade den tidigare beskrivna förekomsten av en högt metylerad cytosin i position C4447 av 28S rRNA23. Vid RT-PCR förstärkning och sekvensering av en 200 bp fragment som omger den metylerade platsen kunde vi observera att alla cytosiner framgångsrikt omvandlades till uraciler, och därmed visas som tymidiner i DNA-sekvensen, förutom cytosin i läge 4447 som förblev oförändrade. Som en kontroll för bisulfitomvandlingshastighet använde vi kommersiellt tillgängliga syntetiska ERCC RNA-sekvenser. Denna blandning består i en pool av kända, icke-metylerade och polydenylerade RNA-sekvenser, med en mängd sekundära strukturer och längder. Vid biblioteksförberedelser och sekvensering fokuserade vi på dessa ERCC-sekvenser för att beräkna konverteringsfrekvensen, som kan utföras genom att räkna antalet konverterade C bland de totala C-resterna i alla ERCC-sekvenser och i varje prov. Vi erhöll en konverteringsfrekvens på 99,5%, vilket bekräftar effektiviteten och framgången för bisulfitkonverteringsreaktionen (figur 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig03.jpg"> Figur 3: BS-Seq-rörledning. A) Schematisk representation av BS-Seq-arbetsflöde. Vid poly-A-urval exponeras prover för bisulfit, vilket resulterar i C-U-omvandling (på grund av avmetaminering) för icke-metylerade C-rester. Metylerade C-rester (m5C) påverkas däremot inte av bisulfitbehandling och förblir oförändrade. B) Representativt resultat av bisulfitomvanderad RNA-fördelningsprofil (storlek och mängd) vid analys på fragmentanalysator med ett standardkänslighetskit. C) Elektrosfärogram som visar representativt sekvenseringsresultat av RT-PCR amplicon i regionen som omger 100% metylerad C vid position 4447 i 28S rRNA (markerad i blått). Däremot identifierades C rester av referenssekvensen som T rester i amplicon sekvensen på grund av att bisulfit omvandling framgång. D) Utvärdering av C-U-konverteringsfrekvensen genom analys av ERCC spike-in sekvenser i HIV-infekterade och icke-infekterade celler. Den genomsnittliga konverteringskursen är 99,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
M6A-berikade prover, bisulfitomvanderade prover och inmatningskontroller bearbetas vidare för biblioteksberedning, sekvensering och bioinformatisk analys (figur 4). Enligt den experimentella design och biologiska frågor som behandlas kan flera bioinformatiska analyser tillämpas. Som principbevis här visar vi representativa resultat från en potentiell applikation (dvs. differentialmetyleringsanalys), som fokuserar på identifiering av differentiellt metylerade transkript som induceras vid HIV-infektion. Kortfattat undersökte vi m6A eller m5C metylering nivå av transkriptioner, oberoende av deras genuttryck nivå, i både icke-infekterade och HIV-infekterade celler, för att ytterligare förstå rollen av RNA metylering under viral livscykel. Vid genuttryck normalisering identifierade vi att ZNF469 transkript var differentiell m6A-metylerad enligt infektion status, verkligen denna transkript var inte metylerad i icke-infekterade celler medan det visade flera metylerade toppar på HIV infektion (figur 5A). En liknande differentialmetyleringsanalys på m5C visade att PHLPP1-avskriften innehöll flera metylerade rester, som tenderar att vara oftare metylerade i HIV-tillståndet (figur 5B). I detta sammanhang tyder båda analyserna på att HIV-infektion påverkar cellulära epitranscriptome.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig04.jpg"> Bild 4: Schematisk representation av det bioinformatiska arbetsflödet för analys av m6A- och m5C-data. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig05.jpg"> Figur 5: Exempel på differentiellt metylerade transkript vid infektion. A) Representativt resultat som visar m6A-metylering av ZNF459-transkript i HIV-infekterade (gröna) och icke-infekterade (grå) celler. Toppintensitet (vid subtraktion av ingångsuttryck) visas på y-axeln och positionen i kromosomen längs x-axeln. Differentiell metylering analys visar att ZFN469 transkript är hypermethylated på HIV infektion. B) Representativt resultat av m5C metylerad gen i HIV-infekterade (övre körfält) och icke-infekterade (nedre körfält) celler. Höjden på varje stapel representerar antalet avläsningar per nukleotid och möjliggör täckningsbedömning. Varje C-rester representeras i rött och andelen metylerat C representeras i blått. Den exakta metyleringshastigheten (%) rapporteras över varje C-rest. Pilar markera statistiskt signifikant differentiellt metylerade C. Prover visualiserades med hjälp av IGV tittare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Rollen av RNA-modifieringar i virusinfektioner har precis börjat utforskas och kan lyfta fram nya interaktionsmekanismer för virus-värd. I detta arbete tillhandahåller vi en pipeline för att undersöka m6A och m5C RNA modifieringar i samband med virusinfektioner.

Utforska m6A och m5C Epitranscriptomes vid virusinfektion: ett exempel med HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

Hej, i den här videon visar vi dig hur du utforskar m6A och m5C epitranscriptomes vid virusinfektion. För att starta experimentet behöver du 50 miljoner celler för de icke-infekterade och 50 miljoner för det infekterade tillståndet. För att få en data uppsättning av hög kvalitet vid analys måste du uppnå en universell infektion.Här infekterar vi dessa celler med en HIV-baserad vektor och mäter den viralt kodade GFP av FACS. I det här fallet hade vi 80% av infekterade celler och fortsatte med arbetsflödet som börjar med total RNA-extraktion. Så vi delade cellerna i alikvoter på 10 miljoner vardera och lyse dem i 1 ml Trizol.Vi lade sedan till 200 mikroliter kloroform till cellen lysate och blandas av inversion. Vid denna tidpunkt låter vi lysate sitta i tre minuter vid rumstemperatur och sedan centrifugera alla prover i hög hastighet i 15 minuter vid fyra grader. Du förväntar dig att se en fasseparation i tre olika faser, som det visas här.RNA sitter i den övre fasen, så överför försiktigt vattenfasen till ett nytt rör genom att vara uppmärksam på att inte överföra det organiska skiktet. Vid denna punkt tillsätt 0,5 ml isopropanol till vattenfasen och blanda försiktigt genom inversion. Prover kan sedan inkuberas en timme vid 80 grader för att säkerställa RNA-nederbörd.Vid centrifugering i hög hastighet bör du kunna se en fin RNA-pellet som visas här. Kassera försiktigt supernatanten antingen genom inversion eller pipettering, var uppmärksam på att inte störa pelleten. Tvätta sedan RNA-pelleten med en ml 75% molekylär etanol.Och virvla provet kort. Vid centrifugering, se till att du hämtar en fin vit RNA-pellet. Kassera supernatanten och låt RNA-pelleten torka i 15 minuter vid rumstemperatur.Återanvänd varje pellet i 20 mikroliter vatten och slå alla prov från samma tillstånd tillsammans. Totalt RNA är nu redo för mRNA-isolering genom poly-A-urval. För varje prov på 75 mikrogram RNA, förbered 200 mikroliter av oligo-DT magnetiska pärlor och tvätta dem i ett ml bindningsbuffert.Placera röret på ett magnetiskt stativ och låt pärlorna binda till magneten under en blandning. Kassera supernatanten och upprepa proceduren för en andra tvätt. Ta sedan bort pärlorna från de magnetiska stativen och försiktigt återanvända dem i 100 mikroliter av bindningsbufferten.Förbered RNA-provet genom att dela upp dem i 75 mikrogram RNA per alikvot som återsuspenderas i 100 mikroliter vatten. Tillsätt 100 mikroliter bindningsbuffert och inkubera i två minuter vid 65 grader. Snurra sedan ner proverna och inkubera på is.Tillsätt sedan 100 mikroliter tvättade magnetiska pärlor till varje RNA-prov och låt binda på ett roterande hjul i 15 minuter vid rumstemperatur. Vid inkubation, placera röret tillbaka i ett magnetiskt rack och låt dem inkubera i en minut. Återställ sedan supernatanten i ett nytt rör och håll den åt sidan för en andra omgång isolering.Tvätta pärlorna två gånger med 200 mikroliter tvättbuffert och fortsätt sedan till elution. För att undkomma poly-A-valt RNA från de magnetiska pärlorna, tillsätt 20 mikroliter iskall TRIS HCl till varje prov och pipett noggrant. Inkubera sedan dina prover vid 80 grader i två minuter för att frigöra RNA från pärlorna.Överför supernatanten som innehåller poly-A vald RNA till ett nytt rör, var försiktig med att undvika pärlor överföring. Elution-steget samt isoleringssteget bör upprepas två gånger för att öka mRNA-utbytet. mRNA är nu redo att antingen gå in i meRIP-Seq-rörledningen vid fragmenteringssteget eller gå direkt till bisulfitkonvertering.Det första steget för att komma in i meRIP-Seq-rörledningen består i mRNA-fragmentering. För detta behöver du fem mikrogram mRNA uppdelat i alikvoter på 18 mikroliter i 0,2 ml-rör. För att säkerställa konsekventa data är det viktigt att arbeta snabbt och med endast ett fåtal exempel vid den tidpunkten.För detta experiment har fragmentering optimerats för att erhålla fragment av en storlek mellan 115 och 200 nukleotider. Tillsätt sedan två mikroliter fragmenteringsreagens till varje rör som innehåller 18 mikroliter mRNA var försiktig vid insättning av droppen på rörväggen. Snurra ner alla prover för att möjliggöra kontakt mellan reagenset och RNA samtidigt och inkubera vid 70 grader i 15 minuter.När inkubationen är över, stoppa reaktionen genom att tillsätta två mikroliter på 0,5 M EDTA. Vid denna tidpunkt kan du rena ditt fragmenterade mRNA med din valfria metod och gå vidare till en RNA-kvalitetskontroll av fragmentanalysator. Det här steget är valfritt, men det gör det möjligt att bedöma storleken på fragmentet innan RNA-nederbörd aktiveras.Som ni kan se här i fjärde körfältet får vi för båda våra provfragment på cirka 150 nukleotid vardera. Vi fortsatte sedan med meRIP-Seq. Det första steget består i par A/ G magnetiska pärlor med antingen anti-m6A antikroppar eller IgG kontroller.För varje reaktionsplan, överför 25 mikroliter magnetiska pärlor till ett nytt rör. Observera att du behöver minst ett m6A-specifikt tillstånd och ett kontrollvillkor. Tvätta varje 25 mikroliter pärlor med 250 mikroliter IP-buffert.Återutnyttja försiktigt pärlorna genom att pipettera upp och ner och placera röret på magnetstället i en minut för att möjliggöra pärlseparation. Ta bort och kassera supernatanten, var uppmärksam på att inte aspirera de magnetiska pärlorna och upprepa tvättsteget en gång. Sätt sedan tillbaka de magnetiska pärlorna i 100 mikroliter IP-buffert per varje 25 mikroliter av originalvolymen av pärlor.Förbered och märka ett rör per varje tillstånd. I vårt fall kommer vi att ha två rör för det infekterade tillståndet, en för m6A och en för IgG-kontroll och två rör för det icke-infekterade tillståndet. Tillsätt sedan 100 mikroliter tvättade pärlor i varje rör.Pärlor är nu redo att kopplas ihop med specifika antikroppar eller IgG-kontroller. Tillsätt fem mikrogram av antingen specifik anti-m6A antikropp eller anti-IgG kontrollantikropp till varje rör som innehåller 100 mikroliter tvättade magnetiska pärlor. Tillåt konjugation av antikroppspärlor genom att inkubera röret 30 minuter på ett roterande hjul.Under tiden fortsätter du med provberedning. För varje planerat tillstånd, antingen m6A-specifik eller IgG-kontroll, kommer ditt utgångsmaterial att vara 2,5 mikrogram fragmenterat mRNA-resuspended 100 mikroliter vatten. För att ha en slutlig reaktionsvolym på 500 mikroliter, tillsätt 295 mikroliter vatten till varje prov.Tillsätt sedan fem mikroliter RNAase-hämmare som är koncentrerad till 40 enheter per mikroliter för totalt 200 enheter per prov och blanda försiktigt. Tillsätt slutligen 100 mikroliter 5X koncentrerad IP-buffert till varje rör. Proverna är nu klara för immunutfällningsreaktionen.Hämta de magnetiska pärlorna i kombination med antikroppar från det roterande hjulet och snurra ner dem. Tillsätt sedan 500 mikroliter av de tidigare beredda proverna till varje 100 mikroliter pärlor i kombination med de specifika antikropparna. Blanda försiktigt genom pipettering upp och ner flera gånger för att helt återanvända pärlorna.Inkubera dem eller din meRIP-reaktion på ett roterande hjul vid fyra grader under två timmar. När inkubationen är över, snurra ner varje rör och placera dem på ett magnetiskt rack i en minut för att tillåta pärlseparation. Ta sedan bort den obundna fraktionen och placera den på ett nytt rör och behåll den för ytterligare analys om det behövs.Ta bort magneten från racket och återanvänd alla prover i 500 mikroliter IP-buffert. Återanvänd varje prov noggrant genom pipettering upp och ner. Sätt in magneten på racket, inkubera i en minut och ta sedan försiktigt bort supernatanten.Upprepa tvätten två gånger och fortsätt sedan med elution. För varje par prov, m6A-specifika och kontroll, förbered 225 mikroliter elutionsbuffert innehållande 20 millimolar renad m6A. Tillsätt sedan 100 mikroliter elutionsbuffert per prov.Inkubera alla prov en timme vid fyra grader på en rocker. Samla sedan alla m6A berikade RNA-prov i ett nytt rör och fortsätt med en andra elution. Rena m6A berikade RNA med din metod och sedan vid denna tidpunkt prover är redo för biblioteksförberedelse och sekvensering.För att undersöka m5C-modifieringen använder vi bisulfitkonvertering. Starta experimentet med 500 nanogram polyadenylerat RNA. Även om det är valfritt, lägger du till 500 piktogram av poly-A utarmat RNA för att säkerställa ribosomal representation och 0,5 mikroliter av kommersiellt tillgänglig syntetisk sekvens gör att du kan bedöma bisulfitomvandlingshastigheten vid sekvensering.Justera provet till en slutlig volym på 20 mikroliter i vatten och tillsätt sedan 130 mikroliter RNA-omvandlingsreagens till varje prov. Blanda försiktigt genom pipettering upp och ner och snurra ner allt prov för att se till att det inte finns några droppar kvar på sidan av rören. Inkubera allt prov i en PCR-maskin i tre cykler av denaturering 70 grader i fem minuter och bisulfitomvandling vid 54 grader under 45 minuter.Utför deamination i kolonnen genom att lägga till direkt på en tom kolumn, 250 mikroliter RNA-bindningsbuffert, 150 mikroliter av ditt bisulfitomvanderade prov. Blanda provet genom pipettering upp och ner, men var uppmärksam på att inte röra kolonnfiltren. Tillsätt 400 mikroliter 95-100% etanol till provets RNA-bindningsbuffertblandning direkt i kolonnen.Stäng locket och blanda omedelbart genom inversion. Snurra ner ditt prov i 30 sekunder och kassera genomflödet. Tvätta kolonnen med tvättbuffert och tillsätt sedan 200 mikroliter desulfonationslösning i mitten av varje kolumn.Inkubera allt ditt prov i 30 minuter vid rumstemperatur. Snurra ner provet i 30 sekunder och fortsätt sedan med två omgångar tvätt. Tillsätt 400 mikroliter tvättbuffert till varje prov, centrifugera i 30 sekunder med full hastighet och kassera genomströmningen.Placera kolonnen i ett nytt tomt rör och elute bisulfiten konverterade RNA till 20 mikroliter vatten. Kontrollera bisulfitkonverteringseffektiviteten med RT-qPCR och fortsätt sedan till biblioteksförberedelser och sekvensering. Vid bioinformatisk analys är här några exempel på resultat som du kan få med det här arbetsflödet.Här jämför vi epitranskriptomet av HIV-infekterade celler jämfört med icke-infekterade celler. 24 timmar efter infektion. I A-panelen kan du se de resultat vi får när du utforskar m6A-epitranskriptomen.I det här diagrammet ritar vi m6A berikade läsningar på meRIP-Seq analys. Vi kan fint se att ett zinkfinger är hypermetylaterat 24 timmar efter infektion. Vi utförde samma typ av analys för m5C epitranscriptome undersökning i panel B.In denna graf, varje icke-metylerad cytosin visas i rött, medan andelen cytosin som har m5C metyleras visas i blått.Som du kan se, PHLPP1, alla tre cytosin som är hypermetylerade 24 timmar efter HIV infektion. Sammantaget tillåter detta arbetsflöde att undersöka både M6A och m5C epitranscriptome av infekterade celler och kan tillämpas som sådan på viruspartiklar också. Förståelse för virusinfektion kan ändra värd epitranscriptomic landskapet kommer att ge oss tillgång till ett nytt lager av reglering.Undersökningen av differentiell metylerade transkriptioner vid virusinfektion kommer naturligtvis att ge en värdefull resurs för nya terapeutiska ingrepp. På länken här nedan hittar du vår open access-resurs för utredning av differentialmetylerad transkription vid HIV-infektion över tid.

Research

JoVE Journal

Biology

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

Intervju: HIV-1 proviral DNA Excision Använda en Evolved Recombinase

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Protokoll för oral infektion av ordningen fjärilar larver med baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring kognitiva funktioner hos Bebisar, Barn &amp; Vuxna med nära infraröd spektroskopi

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Kännetecknar Herbivore resistensmekanismer: Spittlebugs på Brachiaria SPP. Som ett exempel

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Mätning av det osmotiska Vatten permeabilitetskoefficienten (P<sub&gt; F</sub&gt;) Av Sfäriska Celler: isolerade växtprotoplaster som exempel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

Den Infiltration-centrifuge Teknik för Utvinning av apoplastisk Vätska från växtblad Använda<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Som ett exempel

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfektera RAW264.7 Celler med en luciferasrapportörgen

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Bedömning av mineraltillgänglighet i fiskfoder med kompletterande metoder som demonstreras med exemplet med zink i atlantlax

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Single cell Micro-aspiration som en alternativ strategi för fluorescens-aktiverad cell sortering för Giant virus blandning separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Isolering, spridning och differentiering av Rhesus macaque fett-härledda stamceller

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...