Name: exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv
Uploaded: 2022-03-05T13:00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A_166412 ve 314730_188877 hibeleri) tarafından desteklendi.

<ol>
	<li>Machnicka, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways--2013+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways--2013 update.</a> Nucleic Acids Research. 41, 262-267 (2013).</li><li>Zaccara, S., Ries, R. J., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading,+writing+and+erasing+mRNA+methylation.">Reading, writing and erasing mRNA methylation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 608-624 (2019).</li><li>Davalos, V., Blanco, S., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+Messenger+RNA+Modifications.">SnapShot: Messenger RNA Modifications.</a> Cell. 174 (2), 498 (2018).</li><li>Saletore, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+birth+of+the+Epitranscriptome:+deciphering+the+function+of+RNA+modifications.">The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).</li><li>Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications.">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2017).</li><li>Netzband, R., Pager, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+marks:+Emerging+modulators+of+RNA+virus+gene+expression.">Epitranscriptomic marks: Emerging modulators of RNA virus gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (3), 1576 (2020).</li><li>Pereira-Montecinos, C., Valiente-Echeverria, F., Soto-Rifo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+regulation+of+viral+replication.">Epitranscriptomic regulation of viral replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (4), 460-471 (2017).</li><li>Lichinchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+human+and+viral+m(6)A+RNA+methylomes+during+HIV-1+infection+of+T+cells.">Dynamics of the human and viral m(6)A RNA methylomes during HIV-1 infection of T cells.</a> Nature Microbiology. 1, 16011 (2016).</li><li>Courtney, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitranscriptomic+Addition+of+m(5)C+to+HIV-1+Transcripts+Regulates+Viral+Gene+Expression.">Epitranscriptomic Addition of m(5)C to HIV-1 Transcripts Regulates Viral Gene Expression.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).</li><li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+m(6)A+Editing+of+HIV-1+mRNAs+Enhances+Viral+Gene+Expression.">Posttranscriptional m(6)A Editing of HIV-1 mRNAs Enhances Viral Gene Expression.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 675-685 (2016).</li><li>Tirumuru, N., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+envelope+proteins+up-regulate+N+(6)-methyladenosine+levels+of+cellular+RNA+independently+of+viral+replication.">HIV-1 envelope proteins up-regulate N (6)-methyladenosine levels of cellular RNA independently of viral replication.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3249-3260 (2019).</li><li>Tirumuru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(6)-methyladenosine+of+HIV-1+RNA+regulates+viral+infection+and+HIV-1+Gag+protein+expression.">N(6)-methyladenosine of HIV-1 RNA regulates viral infection and HIV-1 Gag protein expression.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell.">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> Frontiers in Virology. 1 (11), (2021).</li><li>Khoddami, V., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+target+profiling+of+RNA+cytosine+methyltransferases+using+the+mechanism-based+enrichment+procedure+Aza-IP.">Transcriptome-wide target profiling of RNA cytosine methyltransferases using the mechanism-based enrichment procedure Aza-IP.</a> Nature Protocols. 9 (2), 337-361 (2014).</li><li>Hussain, S., Aleksic, J., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (11), 215 (2013).</li><li>Dominissini, D., Moshitch-Moshkovitz, S., Salmon-Divon, M., Amariglio, N., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+mapping+of+N6-methyladenosine+by+m6A-seq+based+on+immunocapturing+and+massively+parallel+sequencing.">Transcriptome-wide mapping of N6-methyladenosine by m6A-seq based on immunocapturing and massively parallel sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (1), 176-189 (2013).</li><li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq.">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li><li>Shobbir Hussain, J. A., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+5-methylcytosine+in+the+mammalian+epitranscriptome.">Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome.</a> Genome Biology. 14 (215), (2013).</li><li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+5-methylcytosine+profiles+in+poly(A)+RNA+from+mouse+embryonic+stem+cells+and+brain.">Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain.</a> Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).</li><li>Endrullat, C., Gl&#246;kler, J., Franke, P., Frohme, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+and+quality+management+in+next-generation+sequencing.">Standardization and quality management in next-generation sequencing.</a> Applied &amp; Translational Genomics. 10, 2-9 (2016).</li><li>Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+cytosine+methylation+analysis+by+bisulfite+sequencing.">RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 12 (2009).</li><li>Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Modifies+the+m6A+and+m5C+Epitranscriptomic+Landscape+of+the+Host+Cell.">HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell.</a> biorxiv. 1 (11), (2021).</li><li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+noncoding+RNA.">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and noncoding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li><li>Aschenbrenner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+DNA+Polymerase+for+Direct+m(6)+A+Sequencing.">Engineering of a DNA Polymerase for Direct m(6) A Sequencing.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 57 (2), 417-421 (2018).</li><li>Didion, J. P., Martin, M., Collins, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atropos:+specific,+sensitive,+and+speedy+trimming+of+sequencing+reads.">Atropos: specific, sensitive, and speedy trimming of sequencing reads.</a> PeerJ. 5, 3720 (2017).</li><li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISAT:+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements.">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Okonechnikov, K., Conesa, A., Garc&#237;a-Alcalde, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualimap+2:+advanced+multi-sample+quality+control+for+high-throughput+sequencing+data.">Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., K&#228;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet Journal. 17 (1), (2011).</li><li>Shen, W., Le, S., Li, Y., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeqKit:+A+Cross-Platform+and+Ultrafast+Toolkit+for+FASTA/Q+File+Manipulation.">SeqKit: A Cross-Platform and Ultrafast Toolkit for FASTA/Q File Manipulation.</a> PLOS ONE. 11 (10), 0163962 (2016).</li><li>Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=meRanTK:+methylated+RNA+analysis+ToolKit.">meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit.</a> Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Viral enfeksiyonda RNA modifikasyonlarının rolü hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Epitranscriptomic modifikasyonların viral enfeksiyon bağlamındaki rolünün daha iyi anlaşılması, yeni antiviral tedavi hedefleri arayışına katkıda bulunabilir.
Bu çalışmada, enfekte hücrelerin m6A ve m5C epitranscriptomelerinin araştırılmasına izin veren eksiksiz bir iş akışı sağlıyoruz. Biyolojik soruya bağlı olarak, başlangıç malzemesi olarak poli-A-seçilmiş RNA'yı kullanmanızı tavsiye ederiz. İsteğe bağlı olsa da, işlem hattı toplam RNA ile kullanılabileceğinden, rRNA'ların yanı sıra küçük RNA'ların da yüksek oranda değiştirildiğini ve önemli sayıda metillenmiş kalıntı içerdiğini akılda tutmak önemlidir. Bu, anlamlı sıralama verilerinin kalitesinin ve miktarının azalmasına neden olabilir.
Bununla birlikte, çalışmanın odak noktası poli-adenilasyonlu olmayan RNA ise, RNA ekstraksiyon adımı, küçük RNA'nın atılmasını önlemek (sütun bazlı RNA ekstraksiyonu durumunda) ve boru hattına girmek için poli-A seçimi yerine ribozom tükenmesi tekniklerini imtiyaz etmek için uyarlanmalıdır.
Kütüphane hazırlığı için yüksek kaliteli RNA, doğru parçalanma ve uygun m6A ile zenginleştirilmiş ve BS dönüştürülmüş RNA kalitesi sağlamak için bir parça analizörü veya biyoanalizör kullanmanızı şiddetle tavsiye ederiz. Ancak, bu ekipman her zaman mevcut değildir. Alternatif olarak, RNA, mRNA ve parçalanmış RNA'nın büyüklüğü de agarose jel üzerinde görselleştirme ile değerlendirilebilir. Alternatif olarak, kütüphane hazırlığı RNA miktarı önceden değerlendirilmeden gerçekleştirilebilir.
M6A epitranscriptomic manzarayı keşfetmek için antikor bazlı MeRIP-Seq16 tekniğini kullandık. Bu teknik RNA immün önksepitasyona dayanır ve başarılıdır; ancak, bazı adımların dikkatli bir optimizasyona ihtiyacı vardır ve kritik olabilir. M6A metilasyonunun esas olarak konsensüs dizisi RRA*CH içinde gerçekleştiği açıklansa da, bu motif mRNA molekülleri boyunca oldukça sık görülür ve metilasyon bölgesinin kesin olarak tanımlanmasına izin vermez. Bu nedenle, RIP tabanlı çözünürlüğü iyileştirmek için küçük RNA parçaları üreten tekrarlanabilir ve tutarlı bir RNA parçalanması elde etmek önemlidir. Bu protokolde, deneysel ortamımızda tekrarlanabilir ve tutarlı sonuçlar sağlayan optimize edilmiş bir prosedür öneriyoruz; ancak, bu parçalanma adımının belirli örnek özelliklere göre daha fazla iyileştirmeye ihtiyacı olabilir.
Son zamanlarda m6A doğrudan dizileme izin yeni bir teknik tanımlanmıştır. M6A RNA modifikasyonu24 ile karşılaşmaya yanıt olarak benzersiz RT imzaları sergileyen belirli ters transkriptaz varyantlarının kullanımına dayanmaktadır. Bu teknoloji, dikkatli optimizasyon üzerine, MeRIP-Seq ile karşı karşıya kalınmış büyük sınırlamayı aşabilir (ilk malzeme miktarını azaltır ve daha yüksek bir çözünürlüğe izin verir). M5C modifikasyonu keşfetmek için, modifiye C kalıntılarını nükleotid çözünürlüğünde tespit etmek için bisülfit dönüştürme tekniğini kullanmaya karar verdik. RNA ikincil yapıların varlığı nedeniyle yanlış pozitif oranı azaltmak için, ERCC çivili kontrollerin kullanımı sayesinde 3 döngü denatürasyon / bisülfit dönüştürme ve bisülfit dönüşüm oranı performansını daha fazla kontrol ettik. Bu tekniğe bağlı sınırlamalardan biri, bisülfit dönüşümünün çok sert olması ve üç denatürasyon / bisulfite dönüştürme döngüsünün bazı RNA'ları bozabileceği ve bu nedenle çözünürlüğü azaltabileceğidir. Ancak, bizim ayarımızda, veri kümesinin kalitesini artırmak için potansiyel olarak biraz daha düşük bir çözünürlükle yetinmeyi seçtik.
Bu optimizasyonlar ve kontroller sayesinde, epitranscriptomik manzarayı ve viral enfeksiyonlar, konak-patojen etkileşimleri veya belirli tedavilere maruz kalma bağlamındaki değişimini araştırmak için yararlanılabilen güvenilir ve sağlam bir iş akışı sağlayabildik.

RNA moleküllerinin değiştirilebildiği uzun zamandır bilinmektedir ve bugüne kadar 150'den fazla transkripsiyon sonrası modifikasyon tanımlanmıştır1. RNA moleküllerinin pirimidin ve pürin halkalarının hemen hemen her pozisyonuna başta metil grupları olmak üzere kimyasal grupların eklenmesinden oluşurlar2. Bu tür transkripsiyon sonrası değişikliklerin transfer RNA (tRNA) ve ribozomal RNA'da (rRNA) oldukça zenginleştirilmiş olduğu ve son zamanlarda mRNA molekülleri üzerinde de tanımlandığı gösterilmiştir.
Yeni Nesil Dizileme (NGS) gibi yeni teknolojilerin yükselişi ve kesin kimyasal modifikasyonları tanıyan spesifik antikorların üretilmesi, ilk kez transcriptome çapında belirli kimyasal modifikasyonların yerinin ve sıklığının araştırılmasına izin verildi. Bu gelişmeler, RNA modifikasyonlarının daha iyi anlaşılmasına ve mRNA molekülleri üzerinde çeşitli değişikliklerin haritalanmasına yol açmıştır3,4.
Epigenetik, transkriptomi regülasyonunda DNA ve histon modifikasyonlarının rolünü araştırırken, benzer bir şekilde epitranscriptomics RNA modifikasyonlarına ve rollerine odaklanmaktadır. Epitranscriptomic modifikasyonların araştırılması, çeşitli hücresel süreçleri (örneğin, RNA birleştirme, dışa aktarma, kararlılık ve çeviri) ayarlayabilecek yeni düzenleme mekanizmalarını vurgulamak için yeni fırsatlar sağlar 5. Bu nedenle, son çalışmaların hem hücresel hem de viral RNA'larda viral enfeksiyon üzerine birçok epitranscriptomik modifikasyonu ortaya çıkarması büyük bir sürpriz değildi. Şimdiye kadar araştırılan virüsler hem DNA hem de RNA virüslerini içerir; bunlar arasında HIV öncü bir örnek olarak kabul edilebilir. Tamamen, viral enfeksiyonlar bağlamında RNA metilasyonunun keşfi, viral ifade veya replikasyonun henüz atfedilmemiş mekanizmalarının araştırılmasına izin verebilir, böylece onları kontrol etmek için yeni araçlar ve hedefler sağlayabilir7.
HIV epitranscriptomics alanında, viral transkriptlerin modifikasyonları yaygın olarak araştırılmış ve bu değişikliğin varlığının viral replikasyon için yararlı olduğunu göstermiştir8,9,10,11,12,13. Bugüne kadar transkriptom düzeyinde epitranscriptomic izleri tespit etmek için çeşitli teknikler kullanılabilir. m6A tanımlama için en çok kullanılan teknikler MeRIP-Seq ve miCLIP gibi immün çökeltme tekniklerine dayanır. MeRIP-Seq metillenmiş kalıntılar içeren parçaları yakalamak için RNA parçalanmasına güvenirken, miCLIP RNA-antikor UV çapraz bağlama üzerine α-m6A antikor spesifik imza mutasyonlarının üretimine dayanır, böylece daha kesin bir haritalama sağlar.
m5C modifikasyonunun tespiti, m6A algılamasına (m5C RIP) benzer antikor bazlı teknolojilerle veya bisülfit dönüşümüyle veya AZA-IP veya miCLIP ile elde edilebilir. Hem Aza-IP hem de m5C miCLIP, RNA metilasyonundan geçerken RNA'yı hedeflemek için yem olarak belirli bir metiltransfenaz kullanır. Aza-IP'de, hedef hücreler 5-azacytidin'e maruz kalır ve bu da sitidin analog 5-azasitidin bölgelerinin nascent RNA'ya rastgele girmesiyle sonuçlanır. MiCLIP'te, NSun2 metiltransfez C271A mutasyonu14,15'i barındıracak şekilde genetik olarak değiştirilmiştir.
Bu çalışmada, HIV'i bir model olarak kullanarak, enfekte hücrelerde m6A ve m5C modifikasyonlarının ikili karakterizasyonuna odaklanıyoruz. Metodolojik optimizasyon üzerine, metillenmiş RNA immünödeksiyasyon (MeRIP) ve RNA bisülfit dönüşümünü (BS) birleştiren, m6A ve m5C epitranscriptomic izlerinin hem hücresel hem de viral bağlamlarda transkriptom çapında eşzamanlı olarak araştırılmasını sağlayan bir iş akışı geliştirdik. Bu iş akışı hücresel RNA özlerine ve viral parçacıklardan izole edilmiş RNA'ya uygulanabilir.
Metillenmiş RNA İmmün Önkseçasyon (MeRIP)16 yaklaşımı, m6A'nın transkriptome-wide düzeyinde araştırılmasına izin verir ve bugüne kadar bir dizi m6A spesifik antikor ticari olarak mevcuttur17. Bu yöntem, m6A içeren RNA parçalarının m6A'ya özgü bir antikor kullanılarak seçici olarak yakalanmasından oluşur. Bu tekniğin iki önemli dezavantajı(i) RNA parçalarının boyutuna oldukça bağlı olan ve böylece metillenmiş kalıntıyı içeren yaklaşık bir konum ve bölge sağlayan sınırlı çözünürlük ve (ii) analizi gerçekleştirmek için gereken büyük miktarda malzemedir. Aşağıdaki optimize edilmiş protokolde, parça boyutunu yaklaşık 150 nt'ye standartlaştırdık ve başlangıç malzemesi miktarını şu anda tavsiye edilen başlangıç malzemesi miktarı olan 10 μg poli-A seçilen RNA'dan sadece 1 μg poli-A seçilen RNA'ya düşürdük. Ayrıca fenol bazlı teknikler veya proteinaz K kullanarak daha geleneksel ve daha az spesifik elution yöntemleri yerine m6A peptitli bir rekabet yaklaşımı ile bir elution kullanarak spesifik antikorlara bağlı m6A RNA parçalarının geri kazanım verimliliğini en üst düzeye çıkardık. Bununla birlikte, bu RIP tabanlı tahlilin ana sınırlaması, kesin olarak değiştirilmiş A nükleotidinin tanımlanmasına izin vermeyen yetersiz çözünürlük olmaya devam etmektedir.
M5C işaretinin analizi şu anda iki farklı yaklaşım kullanılarak yapılabilir: m5C'ye özgü antikorlara sahip RIP tabanlı bir yöntem ve RNA bisülfit dönüşümü. RIP metillenmiş kalıntının tanımlanmasında sadece sınırlı çözünürlük sunduğundan, tek nükleotid çözünürlüğü sunabilen bisülfit dönüşümünü kullandık. Bisülfit (BS) RNA maruziyeti sitozin deaminasyonuna yol açar, böylece sitozin kalıntısını urasiye dönüştürür. Bu nedenle, RNA bisülfit dönüşüm reaksiyonu sırasında, metil olmayan her sitozin deaminasyona edilir ve urasil haline dönüştürülürken, sitozinin 5 pozisyonunda bir metil grubunun varlığı koruyucu bir etkiye sahiptir, BS kaynaklı deaminasyonu önler ve sitozin kalıntılarını korur. BS tabanlı yaklaşım, m5C modifiye nükleotitin tek baz çözünürlükte algılanmasına ve her transkriptin metilasyon sıklığının değerlendirilmesine olanak tanır ve m5C modifikasyon dinamikleri hakkında içgörü sağlar18. Bununla birlikte, bu tekniğin ana sınırlaması metillenmiş kalıntıların yanlış pozitif oranına dayanır. Gerçekten de, BS dönüşümü erişilebilir C kalıntılarına sahip tek iplikli RNA üzerinde etkilidir. Bununla birlikte, sıkı bir RNA ikincil yapısının varlığı N5C konumunu maskeleyebilir ve BS dönüşümünü engelleyebilir, bu da U kalıntılarına dönüştürülmeyen metillenmiş olmayan C kalıntılarına ve dolayısıyla yanlış pozitiflere neden olabilir. Bu sorunu atlatmak ve yanlış pozitif oranı en aza indirmek için 3 tur denatürasyon ve bisülfit dönüşüm döngüsü uyguladık19. Ayrıca, bisülfit dönüşüm verimliliğinin tahmin edilmesini sağlamak için numunelerde 2 kontrol sunduk: ERCC sıralama kontrollerinde (metillenmemiş standartlaştırılmış ve ticari olarak kullanılabilen diziler)20 ve bir yandan bisülfit dönüşüm oranını değerlendirmek için poli-A tükenmiş RNA'lar, ve RT-PCR tarafından bilinen ve iyi korunmuş bir metillenmiş site olan C4447'nin varlığını doğrulamak için, diğer yandan 28S ribozomal RNA üzerinde21.
Viroloji alanında, bu iki epitranscriptomik araştırma yönteminin yeni nesil dizileme ve doğru biyoinformatik analiz ile birlenmesi, m6A ve m5C dinamiklerinin derinlemesine incelenmesine izin verir (yani, viral enfeksiyon üzerine ortaya çıkabilecek ve klinik kullanım için terapötik olarak ilgili bir dizi yeni hedefi ortaya çıkarabilecek RNA modifikasyon zamansal değişiklikleri).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrime Pfx SuperMix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12344-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ RNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>EZR5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-472-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-471-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina TruSeq Stranded mRNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Beads A/G Blend</td>
			<td>Merck</td>
			<td>16-663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-Methyladenosine, 5&#8242;-monophosphate sodium salt (m6A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2780-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse IgG</td>
			<td>Merk</td>
			<td>12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo(dT)25</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>61005,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRapace</td>
			<td>Stratec</td>
			<td>1020220300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick RNA Viral Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Fragmentation Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring m6a and m5c epitranscriptomes upon viral infection: an example with hiv

RNA modifikasyonlarının biyolojik süreçlerdeki rolü, son birkaç yılda artan sayıda çalışmanın odak noktası olmuştur ve günümüzde epitranscriptomics olarak bilinmektedir. Diğerleri arasında, N6-metildenozin (m6A) ve 5-metilsitozin (m5C) RNA modifikasyonları mRNA molekülleri üzerinde tanımlanmıştır ve hücresel süreçlerin modülasyonunda rol alabilir. Epitranscriptomics, viral enfeksiyonlar da dahil olmak üzere herhangi bir kimyasal veya biyolojik maddeye maruz kalarak da değiştirilebileceği veya modüle edilebildiği için transkriptomik analizlere ek olarak dikkate alınması gereken yeni bir düzenleme katmanıdır.
Burada, insan immün yetmezlik virüsü (HIV) ile enfekte olmuş veya enfekte olmayan hücrelerde, m6A ve m5C izlerinin eklem hücresel ve viral epitranscriptomik manzarasının aynı anda analizini sağlayan bir iş akışı sunuyoruz. HIV ile enfekte ve enfekte olmayan hücrelerden mRNA izolasyonu ve parçalanması üzerine, iki farklı prosedür kullandık: M6A işareti içeren RNA parçaları için zenginleştirmek için RNA immün önkoşullama tabanlı bir teknik olan MeRIP-Seq ve iki çekirdekli dönüşüm tabanlı bir teknik olan BS-Seq, m5C işaretini tek bir nükleotid çözünürlüğünde tanımlamak için. Metilasyona özgü yakalama üzerine, RNA kitaplıkları yüksek verimli sıralama için hazırlanır. Ayrıca, bazal ifade profillerinden bağımsız olarak farklı metillenmiş (DM) transkriptleri tanımlamak için özel bir biyoinformatik boru hattı geliştirdik.
Genel olarak, metodoloji aynı anda birden fazla epitranscriptomic işaretin araştırılmasına izin verir ve viral enfeksiyon veya başka bir hücre pertürbasyonu üzerine bir DM transkript atlası sağlar. Bu yaklaşım, viral replikasyonu teşvik eden veya kısıtlayan hücresel faktörler gibi yeni oyuncuları ve hücre tepkisinin yeni mekanizmalarını tanımlamak için yeni fırsatlar sunar.

Bu iş akışı, HIV enfeksiyonu bağlamında m6A ve m5C metilasyonunun rolünü araştırmak için yararlı olmuştur. Bunun için HIV ile enfekte ettiğimiz veya tedavi edilmeyen bir CD4+ T hücre hattı modeli (SupT1) kullandık. İş akışını durum başına 50 milyon hücre ile başlattık ve RNA kalite sayısı 10 olan ortalama 500 μg toplam RNA elde ettik (Şekil 1A-B). Poli-A seçimi üzerine durum başına 10 ila 12 μg mRNA (toplam RNA'nın yaklaşık% 2'sini temsil eden) aldık (Şekil 1B). Bu noktada, MeRIP-Seq boru hattı için 5 μg poli-A seçilen RNA ve BS-Seq boru hattı için 1 μg kullandık. HIV RNA'ları poli-adenilasyonlu olduğundan, başka bir eyleme gerek yoktur ve MeRIP-Seq ve BS-Seq prosedürleri doğrudan uygulanabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig01.jpg"> Şekil 1: Aşağı akış uygulamaları için RNA hazırlığı. A) Eşzamanlı MeRIP-Seq ve BS-Seq işlem hatları için RNA hazırlama ve dağıtımını gösteren iş akışı. Her dolgulu altıgen şekil, m6A (yeşil) veya m5C (pembe) gibi bir RNA değişiklik türünü temsil eder. Deneyi gerçekleştirmek için gereken RNA malzemesi miktarları belirtilir. B) Toplam RNA ekstraksiyonu (üst panel) ve poli-A seçimi (alt panel) üzerine beklenen RNA dağıtım profillerini (boyut ve miktar) gösteren temsili sonuçlar. Numuneler, belirli MeRIP-Seq ve BS-Seq prosedürlerine girmeden önce RNA kalitesini değerlendirmek için standart hassasiyet kiti ile parça analizörüne yüklendi. RQN: RNA kalite numarası; nt: nükleotidler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
MeRIP-Seq boru hattı, RNA molekülleri boyunca m6A modifikasyonunun araştırılmasına izin veren RNA immün özürlüğe dayalı bir tekniktir. Bunun için RNA önce parçalanır ve daha sonra immün özürlülüğü ve yakalanması için manyetik boncuklara bağlı m6A spesifik antikorlarla inkübe edilir. MeRIP ile zenginleştirilmiş RNA parçaları ve el değmemiş (giriş) fraksiyonu daha sonra sıralanır ve m6A modifiye RNA bölgelerini ve dolayısıyla m6A metillenmiş transkriptleri tanımlamakla karşılaştırılır (Şekil 2A). Tekniğin çözünürlüğü RNA parçalanmasının verimliliğine dayanır. Aslında, daha kısa parçalar m6A kalıntısının daha hassas bir şekilde lokalizasyonunu sağlar. Burada hücresel poli-A seçilen RNA'lar ve viral RNA'lar 100-150 nt RNA parçaları elde etmek için 20 μL son hacimde 15 dakika boyunca RNA parçalanma tamponu ile iyon bazlı parçalanmaya maruz kaldı. 5 μg mRNA ile başlayarak, %90'lık bir geri kazanım oranına karşılık gelen 4,5 μg parçalı RNA'yı geri kazandık (Şekil 2B). Giriş kontrolü olarak doğrudan kütüphane hazırlığı ve dizilimine tabi tutulan 100 ng parçalı, saflaştırılmış RNA kullandık. Kalan RNA (~4.4 μg), parçalanmış RNA'nın anti-m6A spesifik antikorlara veya kontrol olarak anti-IgG antikorlarına bağlı boncuklarla inkübasyonu ile başlayan MeRIP-Seq boru hattına göre işlendi. 2,5 μg parçalı RNA'nın m6A'ya özgü RIP 'i (MeRIP), kütüphane hazırlığı ve dizilimine tabi olan yaklaşık 15 ng m6A ile zenginleştirilmiş malzemenin geri alınmasına izin verdi (Şekil 2B). Anti-IgG kontrollü RIP, beklendiği gibi, daha fazla analize izin verecek kadar RNA vermedi (Şekil 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig02.jpg"> Şekil 2: MeRIP-Seq ardışık düzeni. A) MeRIP-Seq iş akışının ve giriş denetiminin şematik gösterimi. Poli-A seçimi üzerine, numuneler 120-150 nt parçalara ayrıldı ve doğrudan sıralamaya (100 ng, giriş kontrolü) tabi tutuldu veya sıralamadan önce negatif kontrol olarak anti-m6A spesifik antikor veya anti-IgG antikoru ile RNA immün önkekipitasyon (2.5 μg, RIP) için kullanıldı. B) Parçalanma (üst panel) ve RIP (alt paneller, MeRIP: sol, IgG kontrolü: sağ) üzerine beklenen RNA dağıtım profillerini (boyut ve miktar) gösteren temsili sonuçlar. Numuneler, kütüphane hazırlama ve sıralamaya daha fazla işlemeden önce RNA kalitesini ve konsantrasyonu değerlendirmek için parça analizörüne yüklendi. Parçalanmış RNA analizi RNA standart duyarlılık kiti kullanılarak yapılırken, immün özürlü RNA yüksek hassasiyet kiti kullanılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
BS-Seq boru hattı, nükleotid çözünürlükte m5C RNA modifikasyonunun araştırılmasına izin verir ve m5C metillenmiş transkriptlerin tanımlanmasına yol açar. Bisülfit dönüşümünde metilasyonsuz sitozinler urasil haline dönüştürülürken metillenmiş sitozinler değişmeden kalır (Şekil 3A). Bisülfit dönüştürme prosedürünün zorlu koşulları (yani, yüksek sıcaklık ve düşük pH) nedeniyle, dönüştürülmüş mRNA'lar yüksek oranda bozulur (Şekil 3B), ancak bu kütüphane hazırlama ve sıralamayı engellemez. Bisulfite dönüşümü sadece tek iplikli RNA'da etkilidir ve bu nedenle ikincil çift iplikli RNA yapıları tarafından engellenebilir. C-U dönüşümünün verimliliğini değerlendirmek için iki kontrol sunduk. Pozitif bir kontrol olarak, 28S rRNA23'ün C4447 pozisyonunda yüksek metillenmiş bir sitozin varlığından yararlandık. Metillenmiş bölgeyi çevreleyen 200 bp'lik bir parçanın RT-PCR amplifikasyonu ve dizilimi üzerine, tüm sitozinlerin başarıyla urasillere dönüştürüldüğünü ve böylece 4447 pozisyonundaki sitozin hariç, DNA dizisinde timistinler olarak göründüğünü gözlemleyebiliriz. Bisülfit dönüşüm oranı için bir kontrol olarak, piyasada bulunan sentetik ERCC RNA dizilerini kullandık. Bu karışım, çeşitli ikincil yapılara ve uzunluklara sahip bilinen, metillenmemiş ve poli-adenilasyonlu RNA dizilerinden oluşan bir havuzdan oluşur. Kütüphane hazırlığı ve dizileme üzerine, tüm ERCC dizilerinde ve her örnekte toplam C kalıntıları arasında dönüştürülen C sayısı sayılarak gerçekleştirilebilecek dönüşüm oranını hesaplamak için bu ERCC dizilerine odaklandık. Bisülfit dönüşüm reaksiyonunun verimliliğini ve başarısını doğrulayarak% 99,5'lik bir dönüşüm oranı elde ettik (Şekil 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig03.jpg"> Şekil 3: BS-Seq ardışık düzeni. A) BS-Seq iş akışının şematik gösterimi. Poli-A seçimi üzerine, numuneler bisülfitlere maruz kalır ve metillenmiş olmayan C kalıntıları için C'den U'ya dönüşüme (deaminasyon nedeniyle) neden olur. Buna karşılık metillenmiş C kalıntıları (m5C) bisülfit tedavisinden etkilenmez ve değişmeden kalır. B) Standart hassasiyet kiti ile parça analizörü üzerinde yapılan analizler sonucunda bisülfit dönüştürülmüş RNA dağılım profilinin (boyut ve miktar) temsili sonucu. C) 28S rRNA'da 4447 pozisyonunda %100 metillenmiş C'yi çevreleyen bölgenin RT-PCR ampliconunun temsili dizileme sonucunu gösteren elektroferogram (mavi ile vurgulanır). Buna karşılık, referans dizisinin C kalıntıları bisülfit dönüşüm başarısı nedeniyle amplicon dizisinde T kalıntısı olarak tanımlanmıştır. D) HIV ile enfekte ve enfekte olmayan hücrelerde ERCC spike-in dizilerinin analizi ile C-U dönüşüm oranının değerlendirilmesi. Ortalama dönüşüm oranı %99,5'tir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
M6A ile zenginleştirilmiş numuneler, bisülfit dönüştürülmüş numuneler ve giriş kontrolleri kütüphane hazırlama, sıralama ve biyoinformatik analiz için daha fazla işlenir (Şekil 4). Ele alınan deneysel tasarım ve biyolojik soru(lar)a göre birden fazla biyoinformatik analiz uygulanabilir. Burada ilke kanıtı olarak, HIV enfeksiyonuna bağlı farklı metillenmiş transkriptlerin tanımlanmasına odaklanan bir potansiyel uygulamadan (yani diferansiyel metilasyon analizi) temsili sonuçlar gösteriyoruz. Kısaca, viral yaşam döngüsü sırasında RNA metilasyonlarının rolünü daha iyi anlamak için, hem enfekte olmayan hem de HIV ile enfekte olmuş hücrelerde gen ekspresyon seviyelerinden bağımsız olarak transkriptlerin m6A veya m5C metilasyon seviyesini araştırdık. Gen ekspresyonu normalleşmesi üzerine, ZNF469 transkriptinin enfeksiyon durumuna göre farklı m6A-metillendiğini tespit ettik, gerçekten de bu transkript HIV enfeksiyonu üzerinde birkaç metillenmiş zirve gösterirken enfekte olmayan hücrelerde metillenmedi (Şekil 5A). m5C'deki benzer bir diferansiyel metilasyon analizi, PHLPP1 transkriptinin HIV durumunda daha sık metillenme eğiliminde olan birkaç metillenmiş kalıntı içerdiğini ortaya koydu (Şekil 5B). Bu bağlamda, her iki analiz de HIV enfeksiyonlarının hücresel epitranscriptomu etkilediğini göstermektedir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig04.jpg"> Şekil 4: m6A ve m5C verilerinin analizi için biyoinformatik iş akışının şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62426/62426fig05.jpg"> Şekil 5: Enfeksiyon üzerine farklı metillenmiş transkript örneği. A) HIV ile enfekte (yeşil) ve enfekte olmayan (gri) hücrelerde ZNF459 transkriptinin m6A metilasyonunun temsili sonucu. Tepe yoğunluğu (giriş ifadesi çıkarma üzerine) x ekseni boyunca kromozomdaki y ekseninde ve konumunda gösterilir. Diferansiyel metilasyon analizi, ZFN469 transkriptinin HIV enfeksiyonu üzerine hipermetilasyon olduğunu ortaya koymaktadır. B) HIV ile enfekte (üst şerit) ve enfekte olmayan (alt şerit) hücrelerde m5C metillenmiş genin temsili sonucu. Her çubuğun yüksekliği nükleotid başına okuma sayısını temsil eder ve kapsama değerlendirmesine izin verir. Her C kalıntısı kırmızı ile temsil edilir ve metillenmiş C oranı mavi ile temsil edilir. Tam metilasyon oranı (%) her C kalıntısının üzerinde bildirilmektedir. Oklar istatistiksel olarak anlamlı olarak metillenmiş C'yi vurgular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62426/62426fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV at JoVE.com

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Viral enfeksiyonlarda RNA modifikasyonlarının rolü yeni yeni araştırılmaya başlanmıştır ve yeni viral konak etkileşim mekanizmalarını vurgulayabilir. Bu çalışmada, viral enfeksiyonlar bağlamında m6A ve m5C RNA modifikasyonlarını araştırmak için bir boru hattı sağlıyoruz.

Viral Enfeksiyon Üzerine m6A ve m5C Epitranscriptomes'i Keşfetmek: HIV ile Bir Örnek

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...

Merhaba, bu videoda viral enfeksiyon üzerine m6A ve m5C epitranscriptomes'i nasıl keşfedebileceğinizi göstereceğiz. Deneye başlamak için, enfekte olmayanlar için 50 milyon hücreye ve enfekte olan durum için 50 milyon hücreye ihtiyacınız olacak. Analiz sırasında yüksek kaliteli bir veri kümesi elde etmek için evrensel bir enfeksiyon elde etmeniz gerekir.Burada bu hücrelere HIV bazlı bir vektör bulaştırıyoruz ve FACS tarafından viral olarak kodlanmış GFP'yi ölçüyoruz. Bu durumda, enfekte hücrelerin% 80'ine sahiptik ve toplam RNA ekstraksiyonu ile başlayan iş akışına devam ettik. Bu yüzden hücreleri her biri 10 milyonluk aliquotlarda böldük ve 1 mL Trizol'a böldük.Daha sonra hücre lisatine 200 mikroliner kloroform ekledik ve ters çevirme ile karıştırdık. Bu noktada, lilatın oda sıcaklığında üç dakika oturmasına izin verdik ve daha sonra tüm örnekleri dört derecede 15 dakika boyunca yüksek hızda santrifüj ediyoruz. Burada gösterildiği gibi üç farklı aşamada bir faz ayrımı görmeyi bekleyeceksiniz.RNA üst fazda oturur, bu nedenle organik tabakayı aktarmamaya dikkat ederek sulu fazı dikkatlice taze bir tüpe aktarın. Bu noktada, sulu faza 0,5 mL izopropanol ekleyin ve ters çevrilerek dikkatlice karıştırın. Numuneler daha sonra RNA yağışını sağlamak için 80 derecede bir saat kukübe edilebilir.Yüksek hızda santrifüjleme üzerine, burada gösterildiği gibi güzel bir RNA pelet görebilmelisiniz. Peletin bozulmamasına dikkat ederek, ters çevrilerek veya pipetleme ile süpernatantı dikkatlice atın. Daha sonra RNA peletini% 75 moleküler sınıf etanol bir mL ile yıkayın.Ve örneği kısaca girdapla. Santrifüjleme üzerine, güzel beyaz bir RNA peletini geri aldığınızı unutmayın. Üstnatan atın ve RNA peletini oda sıcaklığında 15 dakika kurutun.Her peleti 20 mikroliter su ve havuza yeniden sunun, tüm numuneler aynı durumdan birlikte. Toplam RNA artık poli-A seçimi ile mRNA yalıtımı için hazırdır. 75 mikrogram RNA'nın her örneği için 200 mikroliter oligo-DT manyetik boncuk hazırlayın ve bir mL bağlama tamponunda yıkayın.Tüpü manyetik bir standa yerleştirin ve bir karışım sırasında boncukların mıknatısa bağlanmasını izin verin. Üstnatant atın ve ikinci bir yıkama için prosedürü tekrarlayın. Daha sonra boncukları manyetik standlardan çıkarın ve 100 mikroliter bağlama tamponunda dikkatlice yeniden diriltin.Bu noktada RNA örneğini 100 mikroliter suya yeniden sulanan aliquot başına 75 mikrogram RNA'ya bölerek hazırlayın. 100 mikroliter bağlama tamponu ekleyin ve 65 derecede iki dakika kuluçkaya yatırın. Sonra örnekleri aşağı çevirin ve buzda kuluçkaya yaslanın.Daha sonra her RNA örneğine 100 mikroliter yıkanmış manyetik boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca dönen bir tekerlek üzerinde bağlamaya izin verin. Kuluçkadan sonra, tüpü tekrar manyetik bir rafa yerleştirin ve bir dakika kuluçkaya yatmalarına izin verin. Sonra süpernatant taze bir tüp içine kurtarmak ve izolasyon ikinci bir tur için bir kenara tutun.Boncukları 200 mikroliter yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve ardından elution'a geçin. Manyetik boncuklardan poli-A seçilen RNA'yı elüte etmek için, her numuneye ve pipete dikkatlice 20 mikroliter buz gibi TRIS HCl ekleyin. Daha sonra RNA'yı boncuklardan serbest bırakmak için numunelerinizi iki dakika boyunca 80 derecede kuluçkaya yatırın.Poli-A'nın seçili RNA'sını içeren süpernatantı, boncuk taşımayı önlemede dikkatli olarak taze bir tüpe aktarın. MRNA verimini artırmak için elüasyon adımı ve izolasyon adımı iki kez tekrarlanmalıdır. mRNA artık parçalanma adımında meRIP-Seq işlem hattına girmeye veya doğrudan bisülfit dönüştürmeye gitmeye hazırdır.meRIP-Seq ardışık düzenine girmek için ilk adım mRNA parçalanmasıdır. Bunun için, 0.2 mL tüplerde 18 mikroliter aliquots bölünmüş beş mikrogram mRNA gerekir. Tutarlı veriler sağlamak için, hızlı ve o anda yalnızca birkaç örnekle çalışmak önemlidir.Bu deney için, parçalanma 115 ila 200 nükleotid arasında bir boyutta parça elde etmek için optimize edilmiştir. Daha sonra, damlacığın tüp duvarına depolanmasında dikkatli olmak için 18 mikroliter mRNA içeren her tüpe iki mikroliter parçalanma reaktifi ekleyin. Reaktif ve RNA arasında aynı anda temasa izin vermek için tüm örnekleri döndürün ve 15 dakika boyunca 70 derecede kuluçkaya yatırın.Kuluçka bittikten sonra, 0,5 M EDTA'nın iki mikroliterini ekleyerek reaksiyonun durdurulması. Bu noktada, parçalı mRNA'nızı seçtiğiniz yöntemle arındırabilir ve parça analizörü ile bir RNA kalite kontrolüne devam edebilirsiniz. Bu adım isteğe bağlıdır, ancak RNA yağışını uygulamadan önce parçanın boyutunu değerlendirmeye izin verir.Burada dördüncü şeritte gördüğünüz gibi, her biri yaklaşık 150 nükleotidden oluşan örnek parçamız için de elde ediyoruz. Daha sonra meRIP-Seq ile devam ettik. İlk adım, anti-m6A antikorları veya IgG kontrolleri olan çift A / G manyetik boncuklardan oluşur.Her reaksiyon planı için, 25 mikroliter manyetik boncukları taze bir tüpe aktarın. En az bir m6A'ya özgü koşula ve bir kontrol koşuluna ihtiyacınız olacağını lütfen unutmayın. Her 25 mikroliter boncuku 250 mikroliter IP tamponu ile yıkayın.Boncukların yukarı ve aşağı borusunu açarak hafifçe yeniden depolayın ve boncuk ayrımına izin vermek için tüpü bir dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin. Manyetik boncukları aspire etmemeye dikkat ederek süpernatant'ı çıkarın ve atın ve yıkama adımını bir kez tekrarlayın. Daha sonra manyetik boncukları, orijinal boncuk hacminin her 25 mikroliteri başına 100 mikroliter IP arabelleği halinde yeniden diriltin.Her koşul için bir tüp hazırlayın ve etiketleyin. Bizim durumumuzda, enfekte durum için iki tüp, m6A için bir ve IgG kontrolü için bir tüp ve enfekte olmayan durum için iki tüp olacak. Daha sonra her tüpe 100 mikroliter yıkanmış boncuk ekleyin.Boncuklar artık spesifik antikorlar veya IgG kontrolleri ile birleştirilecek şekilde hazırdır. 100 mikroliter yıkanmış manyetik boncuk içeren her tüpe beş mikrogram spesifik anti-m6A antikoru veya anti-IgG kontrol antikoru ekleyin. Tüpü dönen bir tekerlek üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırarak antikor boncuklarının konjugasyonuna izin verin.Bu arada, örnek hazırlamaya devam edin. Planlanan her durum için, m6A'ya özgü veya IgG kontrolü, başlangıç malzemeniz 2,5 mikrogram parçalanmış mRNA resüspended 100 mikroliter su olacaktır. 500 mikroliterlik son reaksiyon hacmine sahip olmak için her numuneye 295 mikroliter su ekleyin.Daha sonra numune başına toplam 200 birim için mikroliter başına 40 birim olarak konsantre beş mikroliter RNAase inhibitörü ekleyin ve hafifçe karıştırın. Son olarak her tüpe 100 mikroliter 5X konsantre IP tamponu ekleyin. Bağışıklık çökelttirilmiş reaksiyon için numuneler hazır.Dönen tekerlekten antikor ile birleştirilmiş manyetik boncukları alın ve aşağı çevirin. Daha sonra, önceden hazırlanmış örneklerin 500 mikroliterini, spesifik antikorlarla birleştirilmiş her 100 mikroliter boncuk için ekleyin. Boncukları tamamen yeniden çıkarmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hafifçe karıştırın.onları veya meRIP reaksiyonunuzu iki saat boyunca dört derecede dönen bir tekerlekte kuluçkaya yatırın. Kuluçka bittikten sonra, her tüpü aşağı çevirin ve boncuk ayrımına izin vermek için bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Daha sonra ilişkisiz fraksiyonu çıkarın ve taze bir tüpe yerleştirin ve gerekirse daha fazla analiz için saklayın.Mıknatısı raftan çıkarın ve tüm numuneleri 500 mikroliter IP tamponunda yeniden depolayın. Yukarı ve aşağı pipetleme ile her numuneyi dikkatlice yeniden dirildi. Mıknatısı rafa yerleştirin, bir dakika kuluçkaya yatırın ve ardından süpernatant'ı dikkatlice çıkarın.Yıkamayı iki kez tekrarlayın ve ardından elution ile devam edin. Her bir örnek, m6A spesifik ve kontrol çifti için, 20 milimoler saflaştırılmış m6A içeren 225 mikrolitrelik elution tampon hazırlayın. Ardından numune başına 100 mikroliter elütion tampon ekleyin.Tüm örnekleri bir rocker'da dört derecede bir saatte kuluçkaya yatır. Daha sonra tüm m6A zenginleştirilmiş RNA numunesini taze bir tüpte toplayın ve ikinci bir elution turu ile devam edin. m6A zenginleştirilmiş RNA'yı tercih yönteminizle arındırın ve bu noktada numuneler kütüphane hazırlığı ve dizileme için hazırdır.m5C değişikliğini araştırmak için bisülfit dönüşümünü kullanıyoruz. Deneye 500 nanogram poli-adenilasyonlu RNA ile başlayın. İsteğe bağlı olmasına rağmen, ribozomal temsili ve piyasada bulunan sentetik sıranın 0,5 mikroliterini sağlamak için poly-A tükenmiş RNA'nın örnek 500 pikogramını eklemek, sıralama sırasında bisülfit dönüşüm oranını değerlendirmenizi sağlayacaktır.Numunenizi suda 20 mikroliterlik son hacme ayarlayın ve ardından her numuneye 130 mikroliter RNA dönüştürme reaktifi ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak dikkatlice karıştırın ve tüplerin yan tarafında damlacık kalmadığından emin olmak için tüm numuneyi aşağı çevirin. Tüm numuneleri bir PCR makinesinde beş dakika boyunca 70 derecelik üç denatürasyon döngüsü ve 45 dakika boyunca 54 derecede bisülfit dönüşümü için kuluçkaya yatırın.Doğrudan boş bir sütuna, 250 mikroliter RNA bağlama arabelleğine, 150 mikroliter bisulfite dönüştürülmüş numunenize ekleyerek sütun içi deaminasyon gerçekleştirin. Numuneyi yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırın, ancak sütun filtrelerine dokunmamaya dikkat edin. Örnek RNA bağlama tampon karışımına doğrudan sütuna 400 mikroliter% 95-100 etanol ekleyin.Kapağı kapatın ve ters çevrilerek hemen karıştırın. Örneğinizi 30 saniye döndürün ve akışı atın. Kolonunuzu yıkama tamponu ile yıkayın ve ardından her sütunun ortasına 200 mikroliter desülfonasyon çözeltisi ekleyin.Tüm numunenizi oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Numuneyi 30 saniye döndürün ve ardından iki tur yıkama ile devam edin. Her numuneye 400 mikroliter yıkama tamponu ekleyin, tam hızda 30 saniye santrifüjleyin ve akışı atın.Sütunu yeni bir boş tüpe yerleştirin ve ikisülfit dönüştürülmüş RNA'yı 20 mikroliter suya dökün. RT-qPCR ile bisülfit dönüştürme verimliliğini kontrol edin ve ardından kütüphane hazırlama ve sıralamaya geçin. Biyo-enformatik analiz üzerine, bu iş akışıyla elde edebileceğin sonuçlara bir örnek aşağıda verilmiştir.Burada HIV ile enfekte olmuş hücrelerin epitranscriptom'ını enfekte olmayan hücrelere karşı karşılaştırıyoruz. Enfeksiyondan 24 saat sonra. A panelinde, m6A epitranscriptome'yi keşfederken elde ettiğimiz sonuçları görebilirsiniz.Bu grafikte, m6A zenginleştirilmiş okumaları meRIP-Seq analizi üzerine çiziyoruz. Çinko parmağın enfeksiyondan 24 saat sonra hipermetilasyona sahip olduğunu güzelce görebiliyoruz. Paneldeki m5C epitranscriptome araştırması için aynı analiz türünü gerçekleştirdik B.In bu grafikte, metillenmiş olmayan her sitozin kırmızı renkte görüntülenirken, m5C metillenmiş sitozin oranı mavi renkte gösterilmiştir.Gördüğünüz gibi PHLPP1, HIV sonrası enfeksiyondan 24 saat sonra hiper metillenmiş üç sitozin. Genel olarak, bu iş akışı enfekte hücrelerin hem M6A hem de m5C epitranscriptomlarını araştırmaya izin verir ve viral parçacıklara da uygulanabilir. Viral enfeksiyonun anlaşılması konak epitranscriptomic manzarayı değiştirebilir, bize yeni bir düzenleme katmanına erişim sağlayacaktır.Viral enfeksiyon üzerine diferansiyel metillenmiş transkriptlerin araştırılması elbette yeni terapötik müdahale için değerli bir kaynak sağlayacaktır. Aşağıdaki bağlantıda, zaman içinde HIV enfeksiyonu üzerine diferansiyel metillenmiş transkriptin araştırılması için açık erişim kaynağımızı bulabilirsiniz.

Research

JoVE Journal

Biology

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

Röportaj: Evolved Recombinase kullanarak HIV-1 Proviral DNA eksizyonu

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculovirus lepidopteran Larva Ağız Enfeksiyon Protokolleri

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

Yakın Kızılötesi Spektroskopisi ile bebekler, Çocuk ve Yetişkin Bilişsel Fonksiyonları keşfetmek

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Karakterize Otobur Direnç Mekanizmaları: Spittlebugs Brachiaria Spp. Bir Örnek

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Ozmotik Su Geçirgenliği Katsayısı (P Ölçme<sub&gt; F</sub&gt;) Küresel Hücreleri: Bir Örnek olarak İzole Bitki protoplastlan

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

Tesisinden Akışkan apoplastik çıkarımı için infiltrasyonu-santrifüj Tekniği Kullanarak bırakır<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Bir örnek olarak

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Lusiferaz haberci geni ile RAW264.7 hücreleri transfekte

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Atlantik Somonunda Çinko Örneğiyle Gösterilen Tamamlayıcı Yöntemler Kullanılarak Balık Yemlerinde Mineral Kullanılabilirliğinin Değerlendirilmesi

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Dev Virüs Karışım Ayırma için Floresan-Aktive Hücre Sıralama alternatif bir strateji olarak Tek Hücreli Mikro-aspirasyon

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Rhesus Macaque Adipoz Türevi Kök Hücrelerin İzolasyonu, Proliferasyonu ve Farklılaşması

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...