Name: preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements
Uploaded: 2021-07-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منحة NIH / NIDDK الداخلية ZIA DK 0251041-14 إلى Alan N Schechter ، MD.

تمت الموافقة على بروتوكول الحيوان من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان NIDDK (ASP K049-MMB-20). تم التعامل مع الحيوانات ومعالجتها وفقا للدليل الحالي لرعاية واستخدام المختبر المتاح مجانا على موقع AAALAC.
1. جمع العضلات الهيكلية الفئران
<ol><li>بينما يكون الجرذ تحت التخدير العميق (5٪ إيزوفلور?...

<ol>
	<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+as+a+unique+signaling+molecule+in+the+vascular+system:+a+historical+overview.">Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), 503-514 (2002).</li><li>Moncada, S., Higgs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-arginine-nitric+oxide+pathway.">The L-arginine-nitric oxide pathway.</a> New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).</li><li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+lifetime+of+nitric+oxide:+implications+for+the+perivascular+dynamics+of+NO+and+O2.">The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics.">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).</li><li>Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+in+plasma+nitrite+after+a+dietary+nitrate+load+is+markedly+attenuated+by+an+antibacterial+mouthwash.">The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash.</a> Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).</li><li>Jansson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+functional+nitrate+reductase+that+regulates+nitrite+and+nitric+oxide+homeostasis.">A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis.</a> Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).</li><li>Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+as+a+source+of+nitrite+and+nitric+oxide+during+exercise+hyperemia+in+rat+skeletal+muscle.">Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle.</a> Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).</li><li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation.">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li><li>Shiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxymyoglobin+is+a+nitrite+reductase+that+generates+nitric+oxide+and+regulates+mitochondrial+respiration.">Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration.</a> Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).</li><li>Millar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthine+oxidoreductase+catalyses+the+reduction+of+nitrates+and+nitrite+to+nitric+oxide+under+hypoxic+conditions.">Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions.</a> FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).</li><li>Benjamin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomach+NO+synthesis.">Stomach NO synthesis.</a> Nature. 368 (6471), 502 (1994).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragastric+nitric+oxide+production+in+humans:+measurements+in+expelled+air.">Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air.</a> Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).</li><li>Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dietary+nitrate+on+blood+pressure+in+healthy+volunteers.">Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).</li><li>Kapil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+nitrate+supplementation+lowers+blood+pressure+in+humans:+role+for+nitrite-derived+NO.">Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO.</a> Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).</li><li>Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nitrate+supplementation+and+exercise+performance.">Dietary nitrate supplementation and exercise performance.</a> Sports Medicine. 44, 35-45 (2014).</li><li>Piknova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+as+an+endogenous+nitrate+reservoir.">Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir.</a> Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).</li><li>Wylie, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+nitrate+store:+influence+of+dietary+nitrate+supplementation+and+exercise.">Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise.</a> Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).</li><li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitrite+in+blood+samples+using+the+ferricyanide-based+hemoglobin+oxidation+assay.">Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay.</a> Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).</li><li>Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Nitrite+and+Nitrate,+Metabolites+in+the+Nitric+Oxide+Pathway,+in+Biological+Materials+using+the+Chemiluminescence+Method.">Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).</li><li>Nyakayiru, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+nitrate+ingestion+increases+skeletal+muscle+nitrate+content+in+humans.">Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans.</a> Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).</li><li>Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitrate+and+nitrite+in+biopsy-sized+muscle+samples+using+HPLC.">Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC.</a> Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).</li><li>Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+DNA-strand+co-segregation+and+asymmetric+cell+division+in+skeletal+muscle+stem+cells.">Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).</li><li>Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+type+differences+in+nitrate+and+nitrite+storage+and+nitric+oxide+signaling+in+rats.">Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Ohtake, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nitrite+supplementation+improves+insulin+resistance+in+type+2+diabetic+KKA(y)+mice.">Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice.</a> Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).</li></ol>

لمراقبة التغيرات في مستقلبات NO والنترات والنتريت ، كدالة للتدخلات الفسيولوجية ، من الضروري قياس مستويات هذه الأيونات في الأعضاء المختلفة التي تعتبر حاسمة في عملية التمثيل الغذائي. نظرا لأن الهيموجلوبين في الدم سوف يتفاعل مع NO ومستقلباته ، فمن المهم أيضا إزالة الدم بسرعة من عينات الأنسجة...

يلعب أكسيد النيتريك (NO) ، وهو جزيء إشارات غازي صغير ، دورا مهما في العمليات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية1. لا يمكن إنتاج NO من L-arginine بواسطة إنزيمات داخلية من عائلة سينسيز أكسيد النيتريك (NOS) قبل الخضوع للأكسدة السريعة للنترات (NO 3-) ، وربما النتريت (NO 2-) في الدم والأنسجة 2,3. في الآونة الأخيرة ، ثبت أن هذه الأنيونات قد تم اختزالها مرة أخرى إلى NO في أنظمة الثدييات4. يتم تحويل النترات إلى نتريت ، بشكل رئيسي عن طريق اختزال النترات البكتيرية المتعايشة في تجويف الفم التي تعمل على الأيونات التي تفرزها الغدد اللعابية وتبتلع مباشرة 5 ، وإلى حد ما ، عن طريق إنزيمات الثدييات مثل أوكسيدوريكتاز الزانثين 6,7. يمكن تقليل النتريت إلى NO من خلال عدة آليات بما في ذلك deoxyhemoglobin8 ، deoxymyoglobin9 ، الإنزيمات المحتوية على الموليبدينوم 10 ، والاختزال غير الأنزيمي في وجود البروتونات11,12.
يتم تعزيز مسار النترات - النتريت - NO في ظل ظروف نقص الأكسجين حيث يتضاءل نشاط NOS لأن NOS يتطلب الأكسجين لتوليدNO 4. أبلغت العديد من الدراسات الحديثة عن آثار مفيدة للنترات الغذائية على تنظيم ضغط الدم وأداء التمارين الرياضية ، مما يشير إلى أن مسارات تقليل النترات تساهم في زيادة إشارات NO13،14،15. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن بعض العضلات الهيكلية هي على الأرجح أماكن تخزين النترات الرئيسية في الجسم16. بالمقارنة مع الدم أو الأعضاء الداخلية الأخرى مثل الكبد ، تحتوي العضلات الهيكلية (gluteus maximus) على مستويات أعلى بكثير من النترات ولها كتلة كبيرة في جسم الثدييات. تبين أن تمرين جهاز المشي يعزز تقليل النترات إلى النتريت و NO في الألوية في نموذجالفئران 7. تشير هذه النتائج إلى أن بعض العضلات الهيكلية يمكن أن تكون مصادر مهمة ل NO من خلال مسارات تقليل النترات في المواقف الفسيولوجية. تشير الدراسات الحديثة إلى أن هذه النتائج ، بما في ذلك التغيرات في مستويات نترات العضلات أثناء التمرين ، تحدث أيضا في البشر17.
كان اثنان من المؤلفين الحاليين قد وضعا سابقا طريقة لقياس مستويات النترات والنتريت في الدم وعينات سائلة أخرى18. ومع ذلك ، عندما تم تحليل مستويات هذه الأنيونات في تجانس الأنسجة في البداية ، لم تكن البروتوكولات التفصيلية متاحة. لفهم ديناميكيات النترات - النتريت - NO في العديد من الأعضاء المختلفة ، كان هدفنا هو تطوير طريقة دقيقة وفعالة لقياس مستويات النترات والنتريت في أنسجة الثدييات بما في ذلك العضلات الهيكلية. في الدراسات السابقة ، تم استخدام أنسجة القوارض لتطوير عمليات تجانس موثوقة ثم تحليل محتويات النترات والنتريت في تلك التجانسات7،16،19. تم توسيع استخدام طريقة التجانس هذه لتشمل عينات خزعة العضلات الهيكلية البشرية ، حيث تم تأكيد القيم ، والأهم من ذلك ، كانت القيم التي لوحظت للعضلات مقارنة بالدم / البلازما في نطاقات ونسب مماثلة لتلك التي لوحظت في القوارض17. في السنوات الأخيرة ، بدأت مجموعات أخرى أيضا في قياس مستويات النترات والنتريت في تجانس العضلات الهيكلية ، وأبلغت عن قيم قابلة للمقارنة لتلك التي أبلغت عنها مجموعتنا20,21.
الهدف من ورقة البروتوكول هذه هو وصف تفصيلي لإعداد متجانسات العضلات الهيكلية باستخدام ثلاث طرق تجانس مختلفة للقياس اللاحق لمستويات النترات والنتريت. بالإضافة إلى ذلك ، تم فحص تأثيرات وزن الأنسجة المستخدمة للتجانس على قيم النترات والنتريت في عينات العضلات الهيكلية. نعتقد أن هذه الطرق يمكن تطبيقها بسهولة على أنواع أخرى من أنسجة الثدييات. في الآونة الأخيرة ، وخاصة في مجال فسيولوجيا التمرين ، تم إيلاء الاهتمام للاختلافات المحتملة في فسيولوجيا النترات / النتريت / NO وفقا لمجموعات العضلات. نبلغ أيضا عن كميات النترات والنتريت في أربع عضلات مختلفة للقوارض ونجد توزيعا غير منتظم لكلا الأيونات بين هذه العضلات المختلفة. ملاحظة تتطلب مزيدا من الدراسة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>gentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentle MACS M tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td>Length: 87 mm; Diameter: 30 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC-0409-7620-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>NDC-10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys bead homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEM; N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide analyzer</td>
			<td>GE</td>
			<td>Sievers NOA 280i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>702587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys lysing kit</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000911-LYSK0-A</td>
			<td>contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulverizer kit</td>
			<td>Cellcrusher</td>
			<td>Cellcrusher kit</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements

كان يعتقد في السابق أن أيونات النترات (NO3-) هي منتجات نهائية خاملة لعملية التمثيل الغذائي لأكسيد النيتريك (NO). ومع ذلك ، أظهرت الدراسات السابقة أنه يمكن تحويل أيونات النترات مرة أخرى إلى NO في الثدييات من خلال آلية اختزال من خطوتين: يتم تقليل النترات إلى النتريت (NO2-) في الغالب عن طريق البكتيريا المتعايشة عن طريق الفم ، ثم يتم تقليل النتريت إلى NO بواسطة عدة آليات بما في ذلك عن طريق البروتينات المحتوية على الهيم أو الموليبدينوم. يساهم مسار النترات الاختزالي هذا في تعزيز مسارات الإشارات بدون وساطة ، لا سيما في نظام القلب والأوعية الدموية وأثناء ممارسة العضلات. يتم تحديد مستويات النترات في الجسم قبل هذا الاستخدام من خلال مصدرين مختلفين: عدم الأكسدة الذاتية وتناول النترات الغذائية ، بشكل أساسي من النباتات. لتوضيح دورة NO المعقدة في الظروف الفسيولوجية ، قمنا بفحص ديناميكيات مستقلباتها وأيونات النترات والنتريت ، والتي تكون مستقرة نسبيا مقارنة ب NO. في الدراسات السابقة ، تم تحديد العضلات الهيكلية كعضو تخزين رئيسي لأيونات النترات في الثدييات ، وكذلك مصدر مباشر ل NO أثناء التمرين. لذلك ، فإن إنشاء منهجية موثوقة لقياس مستويات النترات والنتريت في العضلات الهيكلية أمر مهم ويجب أن يكون مفيدا في توسيع نطاق تطبيقه ليشمل عينات الأنسجة الأخرى. يشرح هذا البحث بالتفصيل إعداد عينات العضلات الهيكلية ، باستخدام ثلاث طرق تجانس مختلفة ، لقياسات النترات والنتريت ويناقش القضايا المهمة المتعلقة بعمليات التجانس ، بما في ذلك حجم العينات. كما تمت مقارنة تركيزات النيترات والنتريت عبر أربع مجموعات عضلية مختلفة.

للحصول على نتائج تمثيلية ، تم استخدام أنسجة العضلات الهيكلية من 8 فئران Wistar (ذكور وإناث ، وزن 250 ± 50 جم). تم تحضير تجانس عضلات الهيكل العظمي للفئران (50 ملغ من عضلة الألوية القصوى لكل طريقة) بواسطة ثلاث أدوات تجانس مختلفة (الخالط الدوار ، الخالط الخرز ، والسحق). ثم تم تحديد محتويات النترات والنت...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements at JoVE.com

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

نقدم بروتوكولات لثلاث طرق مختلفة لتجانس أربع مجموعات عضلية مختلفة من الأنسجة العضلية الهيكلية للفئران لقياس ومقارنة مستويات النترات والنتريت. علاوة على ذلك ، نقارن أوزان العينات المختلفة للتحقق مما إذا كان حجم عينة الأنسجة يؤثر على نتائج التجانس.

تحضير تجانس عضلات الهيكل العظمي للفئران لقياسات النترات والنتريت

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

تعمل العضلات الهيكلية كخزان رئيسي للنترات التي ، بعد تحويلها إلى النتريت ، تعمل كمصدر ل NO أثناء التمرين. نقدم هنا منهجية لقياس هذه الأيونات في العضلات والأنسجة الأخرى. للبدء ، قم بإعداد محلول حفظ النترات أو إيقافه عن طريق الجمع بين 890 مليمولار من فيريسيانيد البوتاسيوم و 118 مليمولار n-methylmaleimide في الماء المقطر ، مما يضمن عدم بقاء بلورات في المحلول ، ثم أضف خافض للتوتر السطحي غير الأيوني بنسبة 1 إلى 9 واخلطه برفق لتجنب الرغوة.قم بتخفيف محلول التوقف بنسبة 1 إلى 9 بالماء المقطر وأضف محلول التوقف المخفف إلى أنبوب التجانس. بعد ذلك ، قم بإذابة الأنسجة العضلية السابقة المعزولة والمجمدة على الجليد. بمجرد ذوبان الأنسجة ، قم بإزالة الدهون المتبقية والنسيج الضام من العضلات الهيكلية.قطع قطع من العضلات والهيكل العظمي وصمة عار عليها على الشاش حتى تجف. قم بوزن الكمية المناسبة من الأنسجة العضلية الهيكلية ، ثم ضع نسيج الوزن المسبق في أنابيب التجانس التي تحتوي على محلول التوقف. للتجانس في الخالط الدوار ، ضع الأنبوب من النوع M الذي يحتوي على العضلات الهيكلية الموزونة مسبقا ومحلول التوقف المقاس مسبقا في الماكينة.قم بتجانس كل عينة مرتين ، وبعد كل تجانس ، ضع الأنبوب على الثلج على الفور لمدة 5 دقائق ليبرد. بعد التجانس ، الطرد المركزي الأنبوب لفترة وجيزة. ضع الأنبوب مرة أخرى على الثلج وأضف الحجم المناسب من الميثانول قبل الدوامة لمدة 15 ثانية.تجانس العينة مرة أخرى واحتضانها على الثلج لمدة 30 دقيقة ، ثم طرد العينة بالطرد المركزي ، واستنشاق المادة الطافية ، والمضي قدما في قياس مستويات النتريت والنترات. لتجانس الخرز ، ضع النسيج العضلي الهيكلي في أنبوب يحتوي على حبة وتجانس مرتين لمدة 45 ثانية بأعلى سرعة متاحة على الجهاز. بعد كل تجانس ، ضع الأنبوب على الفور على الثلج لمدة 5 دقائق ليبرد ، ثم طرد الأنبوب بالطرد المركزي ، ضع الأنبوب مرة أخرى على الجليد ، وأضف الحجم المناسب من الميثانول قبل الدوامة لمدة 15 ثانية.قم بتجانس العينة مرة أخرى لمدة 45 ثانية ثم احتضانها على الثلج لمدة 30 دقيقة. قم بالطرد المركزي للعينة ، واستنشاق المادة الطافية ، وانتقل إلى قياس مستويات النتريت والنترات. من أجل التجانس القائم على الطاحن ، قم بإعداد الأنابيب التي تحتوي على محلول التوقف المخفف ، ثم قم بوزن وتسجيل وزن الأنابيب.بعد تبريد أداة الطاحن على الثلج الجاف لمدة 30 دقيقة ، باستخدام ملاقط مبردة في النيتروجين السائل ، انقل عينة الأنسجة التي تم وزنها مسبقا إلى الطاحن ، ثم أضف كمية صغيرة من النيتروجين السائل للتأكد من أن الأنسجة في درجة حرارة النيتروجين السائل. بعد تبخير 95٪ من النيتروجين السائل ، ضع أداة التكسير فوق الأنسجة واضغط بقوة لتشعر بسحق العينة ، ثم باستخدام مطرقة ، اضرب أداة التكسير من 3 إلى 5 مرات. عندما يتم سحق العينة بأكملها ، باستخدام ملعقة وملاقط مبردة بالنيتروجين السائل ، قم بنقل الأنسجة المسحوقة مباشرة إلى الأنبوب الذي تم وزنه مسبقا والذي يحتوي على محلول التوقف المخفف.بعد ذلك ، قم بتدوير الأنبوب لمدة 15 ثانية ، ثم افتح الأنبوب للتحقق من وجود أي نسيج عالق في الغطاء. إذا كان هناك ، حاول إزاحته ، ثم دوامة مرة أخرى. الطرد المركزي لفترة وجيزة العينة لمدة 2 إلى 3 ثوان.قم بوزن الأنبوب مرة أخرى واحسب وزن الأنسجة عن طريق خصم وزن الأنبوب الأصلي من هذا الوزن الجديد. ضع الأنبوب على الثلج. أضف كمية مناسبة من الميثانول إلى الأنبوب وقم بتدوير الأنبوب جيدا لمدة 15 ثانية قبل احتضانه على الثلج لمدة 30 دقيقة ، ثم قم بالطرد المركزي للعينة ، وشفط المادة الطافية ، وانتقل إلى قياس مستويات النتريت والنترات.كانت مستويات النترات وتجانس عضلات الهيكل العظمي للفئران المحضرة باستخدام الخالط الدوار والخالط الخرز والسحق متشابهة. ومن المثير للاهتمام ، بالنسبة لمستويات النتريت ، أظهرت عينة التجانس التي أعدها الطاحن أعلى قيمة ، والتي كانت مختلفة إحصائيا عن قيمتي العينة الأخريين. أظهرت مقارنة مستويات النتريت والنترات في تجانس الألوية المحضرة من 20 و 50 و 200 ملليغرام من الأنسجة باستخدام خالط حبة أنه لا توجد مستويات نترات ولا نتريت تختلف اختلافا كبيرا بين أحجام عينات العضلات.كشفت مقارنة مستويات النترات في أنسجة العضلات الهيكلية المختلفة لساق القوارض أن عضلة الألوية لديها مستويات نترات أعلى بمرتين تقريبا من الأنسجة العضلية الثلاثة الأخرى. ومع ذلك ، لم تصل هذه الاختلافات إلى دلالة إحصائية. على غرار مستويات النترات ، كان تركيز النترات في عضلة الألوية أعلى أيضا من ذلك الموجود في الأنسجة العضلية الثلاثة الأخرى وكان أعلى بكثير من ذلك الموجود في عينة gastrocnemius.طريقتنا بسيطة نسبيا ومناسبة تماما للعينات الصغيرة مع الحفاظ على النترات والنتريت أثناء تحضير العينة.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

الكبار والعضلات والهيكل العظمي الجنينية Microexplant الثقافة وعزل خلايا جذعية عضلية هيكلية

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

إجراءات الجرذ<em&gt; في الموقع</em&gt; خصائص العضلات الهيكلية مقلص

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

الليزر بإلحاق الضرر من العضلات الهيكلية اسماك الزرد الجنينية

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

العزلة وثقافة فردية وMyofibers زنزاناتهم القمر الصناعي من العضلات الهيكلية الكبار

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

العزلة من الدم والأوعية المشتقة متعددة القدرات السلائف من العضلات الهيكلية البشرية

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

الفرز الأنسجة وتجميد لنماذج من الأمراض العضلات الهيكلية

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية للإنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية الجهاز التنفسي القياسات

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

قياس النتريت والنترات، الأيضية في اكسيد النيتريك المسار، في المواد البيولوجية باستخدام أسلوب التوهج

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

عزل الميتوكوندريا سليمة من العضلات الهيكلية التي كتبها التفاضلية الطرد المركزي لقياسات عالية الدقة قياس التنفس

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

تحديد وعزل وتوصيف السلف الليفية الشحمية (FAPs) والذرى العضلية المنشأ (أعضاء البرلمان) في العضلات الهيكلية في الجرذ

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...