Name: preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements
Uploaded: 2021-07-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af intramural NIH/NIDDK-bevilling ZIA DK 0251041-14 til Alan N Schechter, MD.

Dyreprotokol blev godkendt af NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20). Dyr blev håndteret og behandlet i henhold til den nuværende vejledning til pleje og brug af forsøgsdyr, der er frit tilgængelig på AAALAC's hjemmeside.
1. Samling af rotteskeletmuskler
<ol><li>Mens en rotte er under dyb anæstesi (5% isofluran, bekræftet ved manglende reaktion på hale / benklemme), skal du starte perfusion med saltvand indeholdende heparin ved at placere en 19 G nål i en spids af ven...

<ol>
	<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+as+a+unique+signaling+molecule+in+the+vascular+system:+a+historical+overview.">Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), 503-514 (2002).</li><li>Moncada, S., Higgs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-arginine-nitric+oxide+pathway.">The L-arginine-nitric oxide pathway.</a> New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).</li><li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+lifetime+of+nitric+oxide:+implications+for+the+perivascular+dynamics+of+NO+and+O2.">The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics.">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).</li><li>Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+in+plasma+nitrite+after+a+dietary+nitrate+load+is+markedly+attenuated+by+an+antibacterial+mouthwash.">The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash.</a> Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).</li><li>Jansson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+functional+nitrate+reductase+that+regulates+nitrite+and+nitric+oxide+homeostasis.">A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis.</a> Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).</li><li>Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+as+a+source+of+nitrite+and+nitric+oxide+during+exercise+hyperemia+in+rat+skeletal+muscle.">Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle.</a> Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).</li><li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation.">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li><li>Shiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxymyoglobin+is+a+nitrite+reductase+that+generates+nitric+oxide+and+regulates+mitochondrial+respiration.">Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration.</a> Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).</li><li>Millar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthine+oxidoreductase+catalyses+the+reduction+of+nitrates+and+nitrite+to+nitric+oxide+under+hypoxic+conditions.">Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions.</a> FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).</li><li>Benjamin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomach+NO+synthesis.">Stomach NO synthesis.</a> Nature. 368 (6471), 502 (1994).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragastric+nitric+oxide+production+in+humans:+measurements+in+expelled+air.">Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air.</a> Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).</li><li>Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dietary+nitrate+on+blood+pressure+in+healthy+volunteers.">Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).</li><li>Kapil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+nitrate+supplementation+lowers+blood+pressure+in+humans:+role+for+nitrite-derived+NO.">Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO.</a> Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).</li><li>Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nitrate+supplementation+and+exercise+performance.">Dietary nitrate supplementation and exercise performance.</a> Sports Medicine. 44, 35-45 (2014).</li><li>Piknova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+as+an+endogenous+nitrate+reservoir.">Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir.</a> Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).</li><li>Wylie, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+nitrate+store:+influence+of+dietary+nitrate+supplementation+and+exercise.">Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise.</a> Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).</li><li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitrite+in+blood+samples+using+the+ferricyanide-based+hemoglobin+oxidation+assay.">Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay.</a> Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).</li><li>Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Nitrite+and+Nitrate,+Metabolites+in+the+Nitric+Oxide+Pathway,+in+Biological+Materials+using+the+Chemiluminescence+Method.">Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).</li><li>Nyakayiru, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+nitrate+ingestion+increases+skeletal+muscle+nitrate+content+in+humans.">Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans.</a> Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).</li><li>Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitrate+and+nitrite+in+biopsy-sized+muscle+samples+using+HPLC.">Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC.</a> Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).</li><li>Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+DNA-strand+co-segregation+and+asymmetric+cell+division+in+skeletal+muscle+stem+cells.">Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).</li><li>Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+type+differences+in+nitrate+and+nitrite+storage+and+nitric+oxide+signaling+in+rats.">Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Ohtake, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nitrite+supplementation+improves+insulin+resistance+in+type+2+diabetic+KKA(y)+mice.">Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice.</a> Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).</li></ol>

For at overvåge ændringer i NO-metabolitter, nitrat og nitrit som en funktion af fysiologiske interventioner er det bydende nødvendigt at måle niveauerne af disse ioner i de forskellige organer, der er kritiske i deres metabolisme. Da hæmoglobin i blod vil reagere med NO og dets metabolitter, er det også vigtigt at fjerne blod hurtigt fra vævsprøver så meget som muligt. Således blev dyr perfunderet med saltvand, før de opsamlede skeletmuskelvæv (gluteus, TA, EDL, gastrocnemius muskel), og bindevæv og fedt om...

Nitrogenoxid (NO), et lille gasformigt signalmolekyle, spiller en kritisk rolle i fysiologiske og patofysiologiske processer1. NO kan fremstilles af L-arginin ved hjælp af endogene enzymer af nitrogenoxidsyntase (NOS) familien, før de undergår hurtig oxidation til nitrat (NO 3-) og muligvis nitrit (NO 2-) i blod og væv 2,3. For nylig har disse anioner vist sig at være reduceret tilbage til NO i pattedyrsystemer4. Nitrat omdannes til nitrit, hovedsagelig ved hjælp af kommensale bakterielle nitratreduktaser i mundhulen, der virker på ioner, der udskilles af spytkirtlerne og direkte indtages 5, og til en vis grad af pattedyrenzymer såsom xanthinoxidoreduktase 6,7. Nitrit kan reduceres yderligere til NO ved flere mekanismer, herunder deoxyhemoglobin8, deoxymyoglobin9, molybdænholdige enzymer 10 og ikke-enzymatisk reduktion i tilstedeværelsen af protoner11,12.
Denne nitrat-nitrit-NO-vej forbedres under hypoxiske forhold, hvor NOS-aktiviteten mindskes, fordi NOS kræver ilt til INGEN generation4. Mange nylige undersøgelser har rapporteret gavnlige virkninger af diætnitrat på blodtryksregulering og træningsevne, hvilket tyder på, at nitratreduktionsveje bidrager til forøgelsen af NO-signalering13,14,15. Tidligere undersøgelser har vist, at nogle skeletmuskler sandsynligvis er de største nitratopbevaringssteder i kroppen16. Sammenlignet med blod eller andre indre organer såsom lever indeholder skeletmuskulatur (gluteus maximus) signifikant højere niveauer af nitrat og har en betydelig masse i pattedyrkroppen. Løbebåndsøvelse viste sig at øge nitratreduktionen til nitrit og til NO i gluteus i en rotte model7. Disse resultater indebærer, at nogle skeletmuskler kan være vigtige kilder til NO gennem nitratreduktionsveje i fysiologiske situationer. Nyere undersøgelser tyder på, at disse resultater, herunder ændringer i muskelnitratniveauer under træning, også forekommer hos mennesker17.
To af de nuværende forfattere havde tidligere etableret en metode til måling af nitrat- og nitritniveauer i blod og andre væskeprøver18. Men da niveauerne af disse anioner i vævshomogenater oprindeligt blev analyseret, var detaljerede protokoller ikke tilgængelige. For at forstå nitrat-nitrit-NO-dynamikken i flere forskellige organer var vores mål at udvikle en nøjagtig og effektiv metode til at måle nitrat- og nitritniveauer i pattedyrvæv, herunder skeletmuskulatur. I tidligere undersøgelser blev gnavervæv brugt til at udvikle pålidelige homogeniseringsprocesser og derefter analysere nitrat- og nitritindhold i disse homogenater 7,16,19. Anvendelsen af denne homogeniseringsmetode blev udvidet til humane skeletmuskelbiopsiprøver, hvorved værdierne blev bekræftet, og vigtigst af alt var de observerede værdier for muskler sammenlignet med blod / plasma i lignende intervaller og forhold som dem, der blev observeret hos gnavere17. I de senere år er andre grupper også begyndt at måle nitrat- og nitritniveauer i skeletmuskelhomogenater og rapportere sammenlignelige værdier med dem, der er rapporteret af vores gruppe20,21.
Formålet med dette protokolpapir er i detaljer at beskrive fremstillingen af skeletmuskelhomogenater ved hjælp af tre forskellige homogeniseringsmetoder til efterfølgende måling af nitrat- og nitritniveauer. Derudover blev virkningerne af vævsvægt, der blev anvendt til homogenisering på værdier af nitrat og nitrit i skeletmuskelprøver, undersøgt. Vi mener, at disse metoder let kan anvendes på andre typer pattedyrvæv. For nylig, især inden for træningsfysiologi, var der blevet lagt vægt på de mulige forskelle i nitrat / nitrit / INGEN fysiologi i henhold til muskelgrupper. Vi rapporterer også mængderne af nitrat og nitrit i fire forskellige gnavermuskler og finder en uensartet fordeling af begge ioner mellem disse forskellige muskler; en observation, der kræver yderligere undersøgelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>gentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentle MACS M tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td>Length: 87 mm; Diameter: 30 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC-0409-7620-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>NDC-10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys bead homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEM; N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide analyzer</td>
			<td>GE</td>
			<td>Sievers NOA 280i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>702587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys lysing kit</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000911-LYSK0-A</td>
			<td>contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulverizer kit</td>
			<td>Cellcrusher</td>
			<td>Cellcrusher kit</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements

Nitrationer (NO3-) blev engang anset for at være inerte slutprodukter af nitrogenoxid (NO) metabolisme. Tidligere undersøgelser viste imidlertid, at nitrationer kan omdannes tilbage til NO hos pattedyr gennem en totrinsreduktionsmekanisme: nitrat reduceres til nitrit (NO2-) hovedsagelig af orale kommensale bakterier, hvorefter nitrit reduceres til NO ved flere mekanismer, herunder via hæm- eller molybdænholdige proteiner. Denne reduktive nitratvej bidrager til at forbedre NO-medierede signalveje, især i det kardiovaskulære system og under muskeltræning. Niveauerne af nitrat i kroppen før en sådan udnyttelse bestemmes af to forskellige kilder: endogen NO-oxidation og nitratindtag i kosten, hovedsageligt fra planter. For at belyse den komplekse NO-cyklus under fysiologiske omstændigheder har vi yderligere undersøgt dynamikken i dets metabolitter, nitrat og nitritioner, som er relativt stabile sammenlignet med NO. I tidligere undersøgelser blev skeletmuskulatur identificeret som et vigtigt opbevaringsorgan for nitrationer hos pattedyr samt en direkte kilde til NO under træning. Derfor er det vigtigt at etablere en pålidelig metode til måling af nitrat- og nitritniveauer i skeletmuskulaturen, og det bør være nyttigt at udvide dets anvendelse til andre vævsprøver. Dette papir forklarer detaljeret forberedelsen af skeletmuskelprøver ved hjælp af tre forskellige homogeniseringsmetoder til nitrat- og nitritmålinger og diskuterer vigtige spørgsmål relateret til homogeniseringsprocesser, herunder størrelsen af prøverne. Nitrat- og nitritkoncentrationer er også blevet sammenlignet på tværs af fire forskellige muskelgrupper.

For at opnå repræsentative resultater blev skeletmuskelvæv fra 8 Wistar-rotter (mænd og kvinder, vægt 250 ± 50 g) brugt. Rotte skeletmuskelhomogenater (50 mg gluteus maximus muskel for hver metode) blev fremstillet af tre forskellige homogeniseringsværktøjer (roterende homogenisator, perlehomogenisator og pulverisator). Nitrat- og nitritindholdet i disse homogenater blev derefter bestemt ved hjælp af en nitrogenoxidanalysator (NOA) (figur 4). Nitratniveauerne (f...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements at JoVE.com

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Vi præsenterer protokoller for tre forskellige metoder til homogenisering af fire forskellige muskelgrupper af rotteskeletmuskelvæv for at måle og sammenligne niveauerne af nitrat og nitrit. Desuden sammenligner vi forskellige prøvevægte for at undersøge, om vævsprøvestørrelse påvirker resultaterne af homogenisering.

Forberedelse af rotteskeletmuskelhomogenater til nitrat- og nitritemålinger

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Skeletmuskulatur tjener som et stort reservoir af nitrat, som efter dets omdannelse til nitrit tjener som en kilde til NO under træning. Her præsenterer vi metode til at måle disse ioner i muskler og andre væv. Til at begynde med fremstilles nitratkonserverings- eller stopopløsningen ved at kombinere 890 millimolar kaliumferricyanid og 118 millimolar n-methylmaleimid i destilleret vand, hvilket sikrer, at der ikke forbliver krystaller i opløsning, tilsæt derefter et ikke-ionisk overfladeaktivt stof i forholdet 1 til 9 og bland forsigtigt for at undgå skumdannelse.Fortynd stopopløsningen i forholdet 1 til 9 med destilleret vand, og tilsæt den fortyndede stopopløsning til homogeniseringsrøret. Optø derefter det tidligere isolerede og frosne rottemuskelvæv på is. Når vævet er optøet, skal du fjerne det resterende fedt og bindevæv fra skeletmuskulaturen.Skær stykker af skeletmuskulaturen af og blotte dem på en gasbind for at tørre. Vej den passende mængde skeletmuskelvæv, og anbring derefter det forvægtede væv i homogeniseringsrørene, der indeholder stopopløsningen. Til homogenisering i en roterende homogenisator anbringes M-type røret, der indeholder den forvejede skeletmuskel og den forudmålte stopopløsning, i maskinen.Homogeniser hver prøve to gange, og efter hver homogenisering placeres røret straks på is i 5 minutter for at køle ned. Efter homogenisering centrifugeres røret kort. Læg røret tilbage på is, og tilsæt det passende volumen methanol inden hvirvel i 15 sekunder.Homogeniser prøven igen og inkuber den på is i 30 minutter, centrifuger derefter prøven, aspirer supernatanten, og fortsæt med at måle nitrit- og nitratniveauerne. For perlehomogenisering skal skeletmuskelvævet placeres i et perleholdigt rør og homogeniseres to gange i 45 sekunder ved den højeste hastighed, der er tilgængelig på instrumentet. Efter hver homogenisering skal du straks placere røret på is i 5 minutter for at køle ned, centrifugere derefter røret, placere røret tilbage på is og tilsæt det passende volumen methanol inden hvirvel i 15 sekunder.Homogeniser prøven igen i 45 sekunder, og inkuber den derefter på is i 30 minutter. Centrifuger prøven, aspirer supernatanten, og fortsæt med at måle nitrit- og nitratniveauerne. Til pulverisatorbaseret homogenisering fremstilles rør indeholdende den fortyndede stopopløsning, og derefter vejes og registreres rørets vægt.Efter afkøling af pulverisværktøjet på tøris i 30 minutter ved hjælp af pincet kølet i flydende nitrogen overføres den forvejede vævsprøve til pulverisatoren og tilsættes derefter en lille mængde flydende nitrogen for at sikre, at vævet har flydende nitrogentemperatur. Når 95% af det flydende nitrogen er fordampet, skal du placere knuseværktøjet oven på vævet og trykke fast for at føle prøven knuse, og derefter ved hjælp af en hammer slå knuseværktøjet 3 til 5 gange. Når hele prøven er blevet pulveriseret ved hjælp af en flydende nitrogenkølet ske og pincet, overføres det knuste væv direkte til det forvejede rør indeholdende den fortyndede stopopløsning.Derefter skal du pakke røret i 15 sekunder og derefter åbne røret for at kontrollere, om der sidder fast i låget. Hvis der er, så prøv at løsne det, så hvirvel igen. Prøven centrifugeres kortvarigt i 2 til 3 sekunder.Rør vejes igen, og vævsvægten beregnes ved at trække den oprindelige rørvægt fra denne nye vægt. Placer røret på is. Tilsæt et passende volumen methanol til røret, og hvirvel røret grundigt i 15 sekunder, før det inkuberes på is i 30 minutter, centrifugerer derefter prøven, aspirer supernatanten, og fortsæt med at måle nitrit- og nitratniveauerne.Nitratniveauer og rotteskeletmuskelhomogenater fremstillet ved hjælp af en roterende homogenisator, perlehomogenisator og pulverisator var ens. Interessant nok viste homogenatprøven fremstillet af en pulverisator for nitritniveauer den højeste værdi, som var statistisk forskellig fra de to andre prøveværdier. En sammenligning af nitrit- og nitratniveauer i gluteushomogenater fremstillet ud fra 20, 50 og 200 milligram væv ved hjælp af en perlehomogenisator viste, at hverken nitrat- eller nitritniveauerne var signifikant forskellige mellem muskelprøvestørrelserne.Sammenligning af nitratniveauer i forskellige gnaverbenskeletmuskelvæv afslørede, at gluteusmusklen havde cirka to gange højere nitratniveauer end de tre andre muskelvæv. Disse forskelle nåede imidlertid ikke statistisk signifikans. I lighed med nitratniveauerne var nitratkoncentrationen i gluteusmusklen også højere end i de tre andre muskelvæv og var signifikant højere end i gastrocnemiusprøven.Vores metode er relativt enkel og velegnet til små prøver, samtidig med at nitrat og nitrit bevares under prøveforberedelsen.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-Påført skade af zebrafisk Embryonale skeletmuskulatur

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolering og dyrkning af individuelle myofibre og deres satellit celler fra voksne skeletmuskler

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolering af blod-fartøj-afledt Multipotente Forstadier fra human skeletmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Tissue Triage og Frysning af modeller af Skeletmuskel Sygdom

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolering af mitokondrier fra minimale mængder af Mouse Skeletmuskel for High Throughput Microplate Respiratory Målinger

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Måling nitrit og nitrat, metabolitter i Nitrogenoxid Pathway, i biologisk materiale ved hjælp af Chemiluminescence Method

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolering af Intakt Mitokondrier fra Skeletal Muscle ved differentialcentrifugering for høj opløsning respirometri Målinger

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Identifikation, isolation og karakterisering af fibro-adipogenic stamfaderer (FAPs) og myogene forfædre (parlamentsmedlemmer) i skeletmuskulatur i rotten

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...