Name: preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements
Uploaded: 2021-07-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door intramurale NIH/NIDDK subsidie ZIA DK 0251041-14 aan Alan N Schechter, MD.

Het dierprotocol is goedgekeurd door NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20). Dieren werden behandeld en behandeld volgens de huidige gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren die vrij beschikbaar is op de AAALAC-website.
1. Rattenskeletspier collectie
<ol><li>Terwijl een rat onder diepe anesthesie is (5% isofluraan, bevestigd door afwezige reactie op staart/ beenknijpen), begint u perfusie met zoutoplossing met heparine door een naald van 19 G in een top van de li...

<ol>
	<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+as+a+unique+signaling+molecule+in+the+vascular+system:+a+historical+overview.">Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), 503-514 (2002).</li><li>Moncada, S., Higgs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-arginine-nitric+oxide+pathway.">The L-arginine-nitric oxide pathway.</a> New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).</li><li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+lifetime+of+nitric+oxide:+implications+for+the+perivascular+dynamics+of+NO+and+O2.">The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics.">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).</li><li>Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+in+plasma+nitrite+after+a+dietary+nitrate+load+is+markedly+attenuated+by+an+antibacterial+mouthwash.">The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash.</a> Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).</li><li>Jansson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+functional+nitrate+reductase+that+regulates+nitrite+and+nitric+oxide+homeostasis.">A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis.</a> Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).</li><li>Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+as+a+source+of+nitrite+and+nitric+oxide+during+exercise+hyperemia+in+rat+skeletal+muscle.">Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle.</a> Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).</li><li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation.">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li><li>Shiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxymyoglobin+is+a+nitrite+reductase+that+generates+nitric+oxide+and+regulates+mitochondrial+respiration.">Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration.</a> Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).</li><li>Millar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthine+oxidoreductase+catalyses+the+reduction+of+nitrates+and+nitrite+to+nitric+oxide+under+hypoxic+conditions.">Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions.</a> FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).</li><li>Benjamin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomach+NO+synthesis.">Stomach NO synthesis.</a> Nature. 368 (6471), 502 (1994).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragastric+nitric+oxide+production+in+humans:+measurements+in+expelled+air.">Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air.</a> Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).</li><li>Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dietary+nitrate+on+blood+pressure+in+healthy+volunteers.">Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).</li><li>Kapil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+nitrate+supplementation+lowers+blood+pressure+in+humans:+role+for+nitrite-derived+NO.">Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO.</a> Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).</li><li>Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nitrate+supplementation+and+exercise+performance.">Dietary nitrate supplementation and exercise performance.</a> Sports Medicine. 44, 35-45 (2014).</li><li>Piknova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+as+an+endogenous+nitrate+reservoir.">Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir.</a> Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).</li><li>Wylie, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+nitrate+store:+influence+of+dietary+nitrate+supplementation+and+exercise.">Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise.</a> Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).</li><li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitrite+in+blood+samples+using+the+ferricyanide-based+hemoglobin+oxidation+assay.">Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay.</a> Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).</li><li>Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Nitrite+and+Nitrate,+Metabolites+in+the+Nitric+Oxide+Pathway,+in+Biological+Materials+using+the+Chemiluminescence+Method.">Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).</li><li>Nyakayiru, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+nitrate+ingestion+increases+skeletal+muscle+nitrate+content+in+humans.">Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans.</a> Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).</li><li>Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitrate+and+nitrite+in+biopsy-sized+muscle+samples+using+HPLC.">Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC.</a> Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).</li><li>Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+DNA-strand+co-segregation+and+asymmetric+cell+division+in+skeletal+muscle+stem+cells.">Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).</li><li>Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+type+differences+in+nitrate+and+nitrite+storage+and+nitric+oxide+signaling+in+rats.">Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Ohtake, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nitrite+supplementation+improves+insulin+resistance+in+type+2+diabetic+KKA(y)+mice.">Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice.</a> Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).</li></ol>

Om veranderingen in de NO-metabolieten, nitraat en nitriet te volgen, als functie van fysiologische interventies, is het noodzakelijk om de niveaus van deze ionen in de verschillende organen te meten die cruciaal zijn in hun metabolisme. Omdat hemoglobine in het bloed zal reageren met NO en zijn metabolieten, is het ook belangrijk om bloed zo snel mogelijk uit weefselmonsters te verwijderen. Zo werden dieren doordrenkt met zoutoplossing voordat ze skeletspierweefsels verzamelden (gluteus, TA, EDL, gastrocnemiusspier) en ...

Stikstofmonoxide (NO), een klein gasvormig signaalmolecuul, speelt een cruciale rol in fysiologische en pathofysiologische processen1. NO kan worden geproduceerd uit L-arginine door endogene enzymen van de stikstofmonoxidesynthase (NOS) familie alvorens een snelle oxidatie tot nitraat (NO3-) en eventueel nitriet (NO2-) in bloed en weefselste ondergaan 2,3. Onlangs is aangetoond dat deze anionen weer zijn teruggebracht tot NO in zoogdiersystemen4. Nitraat wordt omgezet in nitriet, voornamelijk door commensale bacteriële nitraatreductasen in de mondholte die inwerken op ionen die door de speekselklieren worden uitgescheiden en direct worden ingenomen 5, en tot op zekere hoogte door zoogdierenzymen zoals xanthineoxidoreductase 6,7. Nitriet kan verder worden gereduceerd tot NO door verschillende mechanismen, waaronder deoxyhemoglobine8, deoxymyoglobine9, molybdeenbevattende enzymen10 en niet-enzymatische reductie in de aanwezigheid van protonen11,12.
Deze nitraat-nitriet-NO-route wordt versterkt onder hypoxische omstandigheden waarin de NOS-activiteit wordt verminderd omdat NOS zuurstof nodig heeft voor NO-generatie4. Veel recente studies hebben gunstige effecten van voedingsnitraat op bloeddrukregulatie en trainingsprestaties gemeld, wat suggereert dat nitraatreductieroutes bijdragen aan de toename van NO-signalering 13,14,15. Eerdere studies hebben aangetoond dat sommige skeletspieren waarschijnlijk de belangrijkste nitraatopslagplaatsen in het lichaam zijn16. In vergelijking met bloed of andere inwendige organen zoals lever, bevat de skeletspieren (gluteus maximus) significant hogere niveaus van nitraat en hebben ze een aanzienlijke massa in het lichaam van zoogdieren. Loopbandoefeningen bleken de nitraatreductie tot nitriet en tot NO in gluteus te verbeteren in een ratmodel7. Deze resultaten impliceren dat sommige skeletspieren belangrijke bronnen voor NO kunnen zijn via nitraatreductieroutes in fysiologische situaties. Meer recente studies suggereren dat deze bevindingen, inclusief veranderingen in spiernitraatniveaus tijdens inspanning, ook voorkomen bij mensen17.
Twee van de huidige auteurs hadden eerder een methode vastgesteld om het nitraat- en nitrietgehalte in bloed en andere vloeibare monsters te meten18. Toen de niveaus van deze anionen in weefselhomogenaten echter aanvankelijk werden geanalyseerd, waren er geen gedetailleerde protocollen beschikbaar. Om de nitraat-nitriet-NO-dynamiek in verschillende organen te begrijpen, was ons doel om een nauwkeurige en efficiënte methode te ontwikkelen om nitraat- en nitrietniveaus in zoogdierweefsels, waaronder skeletspieren, te meten. In eerdere studies werden knaagdierweefsels gebruikt om betrouwbare homogenisatieprocessen te ontwikkelen en vervolgens het nitraat- en nitrietgehalte in die homogenatente analyseren 7,16,19. Het gebruik van deze homogenisatiemethode werd uitgebreid tot menselijke skeletspierbiopsiemonsters, waarbij de waarden werden bevestigd, en belangrijker nog, de waargenomen waarden voor spieren in vergelijking met bloed / plasma waren in vergelijkbare bereiken en verhoudingen als die waargenomen bij knaagdieren17. In de afgelopen jaren zijn andere groepen ook begonnen met het meten van nitraat- en nitrietniveaus in skeletspierhomogenaten, waarbij vergelijkbare waarden werden gerapporteerd als die gerapporteerd door onze groep20,21.
Het doel van dit protocolartikel is om in detail de bereiding van skeletspierhomogenaten te beschrijven met behulp van drie verschillende homogenisatiemethoden voor latere metingen van nitraat- en nitrietniveaus. Bovendien werden de effecten van weefselgewicht dat wordt gebruikt voor homogenisatie op waarden van nitraat en nitriet in skeletspiermonsters onderzocht. Wij geloven dat deze methoden gemakkelijk kunnen worden toegepast op andere soorten weefsels van zoogdieren. Recent, vooral op het gebied van inspanningsfysiologie, was aandacht besteed aan de mogelijke verschillen in nitraat/nitriet/NO-fysiologie volgens spiergroepen. We rapporteren ook de hoeveelheden nitraat en nitriet in vier verschillende knaagdierspieren en vinden een niet-uniforme verdeling van beide ionen over deze verschillende spieren; een constatering die nader onderzoek vereist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>gentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentle MACS M tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td>Length: 87 mm; Diameter: 30 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC-0409-7620-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>NDC-10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys bead homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEM; N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide analyzer</td>
			<td>GE</td>
			<td>Sievers NOA 280i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>702587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys lysing kit</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000911-LYSK0-A</td>
			<td>contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulverizer kit</td>
			<td>Cellcrusher</td>
			<td>Cellcrusher kit</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements

Nitraationen (NO3-) werden ooit beschouwd als inerte eindproducten van stikstofmonoxide (NO) metabolisme. Eerdere studies toonden echter aan dat nitraationen bij zoogdieren kunnen worden omgezet in NO via een reductiemechanisme in twee stappen: nitraat wordt gereduceerd tot nitriet (NO2-), meestal door orale commensale bacteriën, waarna nitriet wordt gereduceerd tot NO door verschillende mechanismen, waaronder via heem- of molybdeenbevattende eiwitten. Deze reductieve nitraatroute draagt bij aan het verbeteren van NO-gemedieerde signaalroutes, met name in het cardiovasculaire systeem en tijdens spieroefeningen. De niveaus van nitraat in het lichaam vóór een dergelijk gebruik worden bepaald door twee verschillende bronnen: endogene NO-oxidatie en voedingsnitraatinname, voornamelijk van planten. Om de complexe NO-cyclus in fysiologische omstandigheden op te helderen, hebben we de dynamiek van zijn metabolieten, nitraat- en nitritionen, die relatief stabiel zijn in vergelijking met NO, verder onderzocht. In eerdere studies werd skeletspieren geïdentificeerd als een belangrijk opslagorgaan voor nitraationen bij zoogdieren, evenals een directe bron van NO tijdens inspanning. Daarom is het belangrijk om een betrouwbare methodologie vast te stellen voor het meten van nitraat- en nitrietniveaus in skeletspieren en zou het nuttig moeten zijn om de toepassing ervan uit te breiden naar andere weefselmonsters. Dit artikel legt in detail de voorbereiding van skeletspiermonsters uit, met behulp van drie verschillende homogenisatiemethoden, voor nitraat- en nitrietmetingen en bespreekt belangrijke kwesties met betrekking tot homogenisatieprocessen, waaronder de grootte van de monsters. Nitraat- en nitrietconcentraties zijn ook vergeleken in vier verschillende spiergroepen.

Om representatieve resultaten te verkrijgen, werden skeletspierweefsels van 8 Wistar-ratten (mannetjes en vrouwtjes, gewicht 250 ± 50 g) gebruikt. Rat skeletspieren homogenaten (50 mg gluteus maximus spier voor elke methode) werden bereid door drie verschillende homogenisatie-instrumenten (roterende homogenisator, kraalhomogenisator en vergruizer). Het nitraat- en nitrietgehalte van deze homogenaten werd vervolgens bepaald met behulp van een stikstofmonoxideanalysator (NOA) (figuur 4). De n...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements at JoVE.com

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

We presenteren protocollen voor drie verschillende methoden voor de homogenisatie van vier verschillende spiergroepen van rattenskeletspierweefsel om de niveaus van nitraat en nitriet te meten en te vergelijken. Verder vergelijken we verschillende monstergewichten om te onderzoeken of de grootte van het weefselmonster de resultaten van homogenisatie beïnvloedt.

Bereiding van ratskeletspieren homogenaten voor nitraat- en nitrietmetingen

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Skeletspieren dienen als een belangrijk reservoir van nitraat dat, na de omzetting in nitriet, dient als een bron van NO tijdens het sporten. Hier presenteren we methodologie om deze ionen in spieren en andere weefsels te meten. Bereid om te beginnen de nitraatconserverende of stopoplossing door 890 millimolair kaliumfercyanide en 118 millimolair n-methylmaleimide in gedestilleerd water te combineren, ervoor te zorgen dat er geen kristallen in oplossing achterblijven, voeg vervolgens een niet-ionische oppervlakteactieve stof toe in een verhouding van 1 op 9 en meng voorzichtig om schuimvorming te voorkomen.Verdun de stopoplossing in een verhouding van 1 op 9 met gedestilleerd water en voeg de verdunde stopoplossing toe aan de homogenisatiebuis. Ontdooi vervolgens het vorige geïsoleerde en bevroren rattenspierweefsel op ijs. Zodra het weefsel is ontdooid, verwijdert u het resterende vet en bindweefsel uit de skeletspieren.Snijd stukjes van de skeletspieren af en dep ze op een gaasje om te drogen. Weeg de juiste hoeveelheid skeletspierweefsel af en plaats vervolgens het pre-gewichtsweefsel in de homogenisatiebuizen met de stopoplossing. Voor homogenisatie in een roterende homogenisator plaatst u de M-type buis met de vooraf gewogen skeletspieren en de vooraf gemeten stopoplossing in de machine.Homogeniseer elk monster tweemaal en plaats na elke homogenisatie de buis onmiddellijk gedurende 5 minuten op ijs om af te koelen. Na homogenisatie, centrifugeer de buis kort. Plaats de buis terug op ijs en voeg het juiste volume methanol toe voordat u gedurende 15 seconden vortext.Homogeniseer het monster opnieuw en incubeer het gedurende 30 minuten op ijs, centrifugeer vervolgens het monster, adem het supernatant op en ga verder met het meten van het nitriet- en nitraatgehalte. Voor kraalhomogenisatie plaatst u het skeletspierweefsel in een kraalbevattende buis en homogeniseert u tweemaal gedurende 45 seconden met de hoogste snelheid die beschikbaar is op het instrument. Plaats na elke homogenisatie de buis onmiddellijk gedurende 5 minuten op ijs om af te koelen, centrifugeer vervolgens de buis, plaats de buis terug op ijs en voeg het juiste volume methanol toe voordat u gedurende 15 seconden vortext.Homogeniseer het monster opnieuw gedurende 45 seconden en incubeer het vervolgens gedurende 30 minuten op ijs. Centrifugeer het monster, zuig het supernatant aan en ga verder met het meten van het nitriet- en nitraatgehalte. Voor homogenisatie op basis van verpulverizer bereidt u buizen voor die de verdunde stopoplossing bevatten en weegt u vervolgens het gewicht van de buizen en registreert u het.Na het koelen van het verpulverizergereedschap op droogijs gedurende 30 minuten, met behulp van een pincet gekoeld in vloeibare stikstof, brengt u het vooraf gewogen weefselmonster over naar de vergruizer en voegt u vervolgens een kleine hoeveelheid vloeibare stikstof toe om ervoor te zorgen dat het weefsel op vloeibare stikstoftemperatuur is. Nadat 95% van de vloeibare stikstof is verdampt, plaatst u het breekgereedschap op het weefsel en drukt u stevig om het monster te voelen verpletteren, en vervolgens met behulp van een hamer, sla het breekgereedschap 3 tot 5 keer. Wanneer het hele monster is verpulverd, breng je met behulp van een vloeibare stikstofgekoelde lepel en pincet het gemalen weefsel rechtstreeks over in de vooraf gewogen buis met de verdunde stopoplossing.Vortex vervolgens de buis gedurende 15 seconden en open vervolgens de buis om te controleren op weefsel dat vastzit in het deksel. Als dat het geval is, probeer het dan los te maken en vortex opnieuw. Centrifugeer het monster kort gedurende 2 tot 3 seconden.Weeg de buis opnieuw en bereken het weefselgewicht door het oorspronkelijke buisgewicht van dit nieuwe gewicht af te trekken. Plaats de tube op ijs. Voeg een geschikt volume methanol toe aan de buis en vortex de buis grondig gedurende 15 seconden voordat u het gedurende 30 minuten op ijs incubeert, centrifugeer vervolgens het monster, adem het supernatant op en ga verder met het meten van de nitriet- en nitraatniveaus.Nitraatniveaus en spierhomogenaten van rattenskeleten bereid met behulp van een roterende homogenisator, kraalhomogenisator en vergruizer waren vergelijkbaar. Interessant is dat voor nitrietniveaus het homogenaatmonster bereid door een vergruizer de hoogste waarde vertoonde, die statistisch verschilde van de andere twee monsterwaarden. Een vergelijking van nitriet- en nitraatniveaus in gluteushomogenaten bereid uit 20, 50 en 200 milligram weefsel met behulp van een kraalhomogenisator toonde aan dat noch de nitraat- noch nitrietniveaus significant verschilden tussen de spiermonstergroottes.Het vergelijken van nitraatniveaus in verschillende knaagdierbeenskeletspierweefsels onthulde dat de gluteusspier ongeveer twee keer hogere nitraatniveaus had dan de andere drie spierweefsels. Deze verschillen bereikten echter geen statistische significantie. Net als bij de nitraatspiegels was de nitraatconcentratie in de gluteusspier ook hoger dan die in de andere drie spierweefsels en significant hoger dan die in het gastrocnemiusmonster.Onze methode is relatief eenvoudig en goed geschikt voor kleine monsters met behoud van nitraat en nitriet tijdens de monstervoorbereiding.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures voor Rat<em&gt; In situ</em&gt; Skeletspier contractiele eigenschappen

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser toegebrachte schade van zebravis Embryonale skeletspier

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolatie en Cultuur van individuele myovezels en hun satelliet cellen van volwassen skeletspier

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolatie van bloedvatgeassocieerde afgeleid Multipotente Voorlopers van Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Tissue Triage en Invriezen Modellen van Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Het meten van nitriet en nitraat, metabolieten in de stikstofoxide pathway, in biologische materialen met behulp van de chemoluminescentiemethode

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolatie van Intact Mitochondriën zijn van skeletspieren door differentiële centrifugatie voor High-resolution respirometrietest Metingen

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Identificatie, isolatie en karakterisering van fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) en myogene voorlopercellen (MP's) in skeletspieren bij de rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...