Name: preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements
Uploaded: 2021-07-29T13:30:00
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Diese Arbeit wurde durch das interne NIH / NIDDK-Stipendium ZIA DK 0251041-14 an Alan N Schechter, MD, unterstützt.

Das Tierprotokoll wurde vom NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20) genehmigt. Die Tiere wurden gemäß dem aktuellen Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren behandelt und behandelt, der auf der AAALAC-Website frei verfügbar ist.
1. Sammlung von Skelettmuskeln der Ratte
<ol><li>Während eine Ratte unter tiefer Narkose steht (5% Isofluran, bestätigt durch fehlende Reaktion auf Schwanz- / Beinklemmung), beginnen Sie mit der Perfusion mit Heparin-haltiger Kochsa...

<ol>
	<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+as+a+unique+signaling+molecule+in+the+vascular+system:+a+historical+overview.">Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), 503-514 (2002).</li><li>Moncada, S., Higgs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-arginine-nitric+oxide+pathway.">The L-arginine-nitric oxide pathway.</a> New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).</li><li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthine+oxidoreductase+catalyses+the+reduction+of+nitrates+and+nitrite+to+nitric+oxide+under+hypoxic+conditions.">Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions.</a> FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).</li><li>Benjamin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomach+NO+synthesis.">Stomach NO synthesis.</a> Nature. 368 (6471), 502 (1994).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragastric+nitric+oxide+production+in+humans:+measurements+in+expelled+air.">Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air.</a> Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).</li><li>Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dietary+nitrate+on+blood+pressure+in+healthy+volunteers.">Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).</li><li>Kapil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+nitrate+supplementation+lowers+blood+pressure+in+humans:+role+for+nitrite-derived+NO.">Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO.</a> Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).</li><li>Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nitrate+supplementation+and+exercise+performance.">Dietary nitrate supplementation and exercise performance.</a> Sports Medicine. 44, 35-45 (2014).</li><li>Piknova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+as+an+endogenous+nitrate+reservoir.">Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir.</a> Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).</li><li>Wylie, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+nitrate+store:+influence+of+dietary+nitrate+supplementation+and+exercise.">Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise.</a> Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).</li><li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitrite+in+blood+samples+using+the+ferricyanide-based+hemoglobin+oxidation+assay.">Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay.</a> Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).</li><li>Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Nitrite+and+Nitrate,+Metabolites+in+the+Nitric+Oxide+Pathway,+in+Biological+Materials+using+the+Chemiluminescence+Method.">Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).</li><li>Nyakayiru, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+nitrate+ingestion+increases+skeletal+muscle+nitrate+content+in+humans.">Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans.</a> Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).</li><li>Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitrate+and+nitrite+in+biopsy-sized+muscle+samples+using+HPLC.">Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC.</a> Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).</li><li>Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+DNA-strand+co-segregation+and+asymmetric+cell+division+in+skeletal+muscle+stem+cells.">Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).</li><li>Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+type+differences+in+nitrate+and+nitrite+storage+and+nitric+oxide+signaling+in+rats.">Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Ohtake, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nitrite+supplementation+improves+insulin+resistance+in+type+2+diabetic+KKA(y)+mice.">Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice.</a> Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).</li></ol>

Um Veränderungen der NO-Metaboliten, Nitrat und Nitrit, in Abhängigkeit von physiologischen Eingriffen zu überwachen, ist es unerlässlich, die Spiegel dieser Ionen in den verschiedenen Organen zu messen, die für ihren Stoffwechsel entscheidend sind. Da Hämoglobin im Blut mit NO und seinen Metaboliten reagiert, ist es auch wichtig, Blut so schnell wie möglich aus Gewebeproben zu entfernen. So wurden die Tiere mit Kochsalzlösung perfundiert, bevor sie Skelettmuskelgewebe (Gesäß, TA, EDL, Gastrocnemius-Muskel) sam...

Stickstoffmonoxid (NO), ein kleines gasförmiges Signalmolekül, spielt eine entscheidende Rolle bei physiologischen und pathophysiologischen Prozessen1. NO kann aus L-Arginin durch endogene Enzyme der Familie der Stickstoffmonoxidsynthase (NOS) hergestellt werden, bevor es einer schnellen Oxidation zu Nitrat (NO3-) und möglicherweise Nitrit (NO2-) in Blut und Geweben 2,3 unterzogen wird. Kürzlich wurde gezeigt, dass diese Anionen in Säugetiersystemen wieder zu NO reduziert werden4. Nitrat wird in Nitrit umgewandelt, hauptsächlich durch kommensale bakterielle Nitratreduktasen in der Mundhöhle, die auf Ionen wirken, die von den Speicheldrüsen abgesondert und direkt aufgenommen werden 5, und in gewissem Maße durch Säugetierenzyme wie Xanthinoxidoreduktase 6,7. Nitrit kann durch verschiedene Mechanismen, einschließlich Desoxyhämoglobin8, Desoxymyoglobin9, molybdänhaltige Enzyme 10 und nicht-enzymatische Reduktion in Gegenwart von Protonen11,12, weiter zu NO reduziert werden.
Dieser Nitrat-Nitrit-NO-Weg wird unter hypoxischen Bedingungen verstärkt, wobei die NOS-Aktivität verringert wird, da NOS Sauerstoff für die NO-Erzeugung4 benötigt. Viele neuere Studien haben positive Auswirkungen von diätetischem Nitrat auf die Blutdruckregulierung und die Trainingsleistung berichtet, was darauf hindeutet, dass Nitratreduktionswege zur Verstärkung der NO-Signalisierung beitragen13,14,15. Frühere Studien haben gezeigt, dass einige Skelettmuskeln wahrscheinlich die wichtigsten Nitratspeicher im Körper sind16. Im Vergleich zu Blut oder anderen inneren Organen wie Leber enthält die Skelettmuskulatur (Gluteus maximus) deutlich höhere Nitratwerte und hat eine erhebliche Masse im Säugetierkörper. Es wurde gezeigt, dass Laufbandübungen die Nitratreduktion zu Nitrit und zu NO im Gesäß in einem Rattenmodell7 verstärken. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass einige Skelettmuskeln wichtige Quellen für NO durch Nitratreduktionswege in physiologischen Situationen sein könnten. Neuere Studien deuten darauf hin, dass diese Ergebnisse, einschließlich Veränderungen des Muskelnitratspiegels während des Trainings, auch beim Menschen auftreten17.
Zwei der aktuellen Autoren hatten zuvor eine Methode zur Messung des Nitrat- und Nitritspiegels in Blut und anderen flüssigen Proben etabliert18. Als jedoch die Konzentrationen dieser Anionen in Gewebehomogenaten zunächst analysiert wurden, waren detaillierte Protokolle nicht verfügbar. Um die Nitrat-Nitrit-NO-Dynamik in verschiedenen Organen zu verstehen, war es unser Ziel, eine genaue und effiziente Methode zur Messung des Nitrat- und Nitritspiegels in Säugetiergeweben einschließlich der Skelettmuskulatur zu entwickeln. In früheren Studien wurden Nagetiergewebe verwendet, um zuverlässige Homogenisierungsprozesse zu entwickeln und dann den Nitrat- und Nitritgehalt in den Homogenaten 7,16,19 zu analysieren. Die Verwendung dieser Homogenisierungsmethode wurde auf menschliche Skelettmuskelbiopsieproben ausgeweitet, wobei die Werte bestätigt wurden und vor allem die für Muskeln im Vergleich zu Blut / Plasma beobachteten Werte in ähnlichen Bereichen und Verhältnissen lagen wie bei Nagetieren17. In den letzten Jahren haben auch andere Gruppen begonnen, den Nitrat- und Nitritgehalt in Skelettmuskelhomogenaten zu messen, und berichteten über vergleichbare Werte wie die unserer Gruppe20,21.
Ziel dieses Protokollpapiers ist es, die Herstellung von Skelettmuskelhomogenaten unter Verwendung von drei verschiedenen Homogenisierungsmethoden zur anschließenden Messung des Nitrat- und Nitritgehalts detailliert zu beschreiben. Zusätzlich wurden die Auswirkungen des zur Homogenisierung verwendeten Gewebegewichts auf die Werte von Nitrat und Nitrit in Skelettmuskelproben untersucht. Wir glauben, dass diese Methoden leicht auf andere Arten von Säugetiergeweben angewendet werden können. In jüngster Zeit wurde vor allem im Bereich der Sportphysiologie auf die möglichen Unterschiede in der Nitrat/Nitrit/NO-Physiologie nach Muskelgruppen geachtet. Wir berichten auch die Mengen an Nitrat und Nitrit in vier verschiedenen Nagetiermuskeln und finden eine ungleichmäßige Verteilung beider Ionen zwischen diesen verschiedenen Muskeln; Eine Beobachtung, die weiterer Untersuchungen bedarf.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>gentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentle MACS M tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td>Length: 87 mm; Diameter: 30 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC-0409-7620-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>NDC-10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys bead homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEM; N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide analyzer</td>
			<td>GE</td>
			<td>Sievers NOA 280i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>702587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys lysing kit</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000911-LYSK0-A</td>
			<td>contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulverizer kit</td>
			<td>Cellcrusher</td>
			<td>Cellcrusher kit</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements

Nitrationen (NO3-) galten früher als inerte Endprodukte des Stickstoffmonoxid (NO)-Stoffwechsels. Frühere Studien zeigten jedoch, dass Nitrationen bei Säugetieren durch einen zweistufigen Reduktionsmechanismus wieder in NO umgewandelt werden können: Nitrat wird hauptsächlich von oralen kommensalen Bakterien zu Nitrit (NO2-) reduziert, dann wird Nitrit durch verschiedene Mechanismen, einschließlich über Häm- oder Molybdän-haltige Proteine, zu NO reduziert. Dieser reduktive Nitratweg trägt zur Verbesserung der NO-vermittelten Signalwege bei, insbesondere im Herz-Kreislauf-System und bei Muskeltraining. Der Nitratgehalt im Körper vor einer solchen Verwertung wird durch zwei verschiedene Quellen bestimmt: endogene NO-Oxidation und Nitrataufnahme über die Nahrung, hauptsächlich aus Pflanzen. Um den komplexen NO-Zyklus unter physiologischen Bedingungen aufzuklären, haben wir die Dynamik seiner Metaboliten, Nitrat- und Nitritionen, die im Vergleich zu NO relativ stabil sind, weiter untersucht. In früheren Studien wurde die Skelettmuskulatur als Hauptspeicherorgan für Nitrationen bei Säugetieren sowie als direkte Quelle von NO während des Trainings identifiziert. Daher ist die Etablierung einer zuverlässigen Methodik zur Messung des Nitrat- und Nitritspiegels in der Skelettmuskulatur wichtig und sollte hilfreich sein, um ihre Anwendung auf andere Gewebeproben auszudehnen. Dieser Artikel erläutert ausführlich die Vorbereitung von Skelettmuskelproben mit drei verschiedenen Homogenisierungsmethoden für Nitrat- und Nitritmessungen und diskutiert wichtige Fragen im Zusammenhang mit Homogenisierungsprozessen, einschließlich der Größe der Proben. Nitrat- und Nitritkonzentrationen wurden auch über vier verschiedene Muskelgruppen hinweg verglichen.

Um repräsentative Ergebnisse zu erhalten, wurde Skelettmuskelgewebe von 8 Wistar-Ratten (Männchen und Weibchen, Gewicht 250 ± 50 g) verwendet. Ratten-Skelettmuskelhomogenate (50 mg Musculus gluteus maximus für jede Methode) wurden mit drei verschiedenen Homogenisierungswerkzeugen (rotierender Homogenisator, Perlenhomogenisator und Pulverisierer) hergestellt. Die Nitrat- und Nitritgehalte dieser Homogenate wurden dann mit einem Stickstoffmonoxid-Analysator (NOA) bestimmt (Abbildung 4). Di...

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Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Wir präsentieren Protokolle für drei verschiedene Methoden zur Homogenisierung von vier verschiedenen Muskelgruppen von Ratten-Skelettmuskelgewebe, um die Nitrat- und Nitritwerte zu messen und zu vergleichen. Darüber hinaus vergleichen wir verschiedene Probengewichte, um zu untersuchen, ob die Gewebeprobengröße die Ergebnisse der Homogenisierung beeinflusst.

Herstellung von Ratten-Skelettmuskelhomogenaten für Nitrat- und Nitritmessungen

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Die Skelettmuskulatur dient als Hauptreservoir für Nitrat, das nach seiner Umwandlung in Nitrit als NO-Quelle während des Trainings dient. Hier stellen wir die Methodik vor, um diese Ionen in Muskel- und anderen Geweben zu messen. Um zu beginnen, bereiten Sie die nitratkonservierende oder stoppende Lösung vor, indem Sie 890 Millimolar Kaliumferricyanid und 118 Millimolar n-Methylmaleimid in destilliertem Wasser kombinieren, um sicherzustellen, dass keine Kristalle in Lösung verbleiben, dann fügen Sie ein nichtionisches Tensid in einem Verhältnis von 1 zu 9 hinzu und mischen Sie vorsichtig, um Schaumbildung zu vermeiden.Die Stopplösung wird im Verhältnis 1 zu 9 mit destilliertem Wasser verdünnt und die verdünnte Stopplösung in das Homogenisierungsröhrchen gegeben. Als nächstes tauen Sie das zuvor isolierte und gefrorene Rattenmuskelgewebe auf Eis auf. Sobald das Gewebe aufgetaut ist, entfernen Sie das restliche Fett und Bindegewebe aus der Skelettmuskulatur.Schneiden Sie Stücke des Skelettmuskels ab und tupfen Sie sie zum Trocknen auf eine Gaze. Wiegen Sie die entsprechende Menge Skelettmuskelgewebe ab und legen Sie dann das vorgewichtige Gewebe in die Homogenisierungsröhrchen, die die Stopplösung enthalten. Für die Homogenisierung in einem Rotationshomogenisator legen Sie das M-Typ-Röhrchen mit dem vorgewogenen Skelettmuskel und der vorgemessenen Stopplösung in die Maschine.Homogenisieren Sie jede Probe zweimal und legen Sie das Röhrchen nach jeder Homogenisierung sofort für 5 Minuten auf Eis, um abzukühlen. Nach der Homogenisierung das Röhrchen kurz zentrifugieren. Stellen Sie das Röhrchen wieder auf Eis und fügen Sie die entsprechende Menge Methanol hinzu, bevor Sie 15 Sekunden lang wirbeln.Homogenisieren Sie die Probe erneut und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis, zentrifugieren Sie dann die Probe, saugen Sie den Überstand an und fahren Sie mit der Messung des Nitrit- und Nitratgehalts fort. Für die Perlenhomogenisierung legen Sie das Skelettmuskelgewebe in ein perlenhaltiges Röhrchen und homogenisieren Sie zweimal für 45 Sekunden mit der höchsten Geschwindigkeit, die auf dem Instrument verfügbar ist. Nach jeder Homogenisierung das Röhrchen sofort für 5 Minuten auf Eis legen, um abzukühlen, dann zentrifugieren Sie das Röhrchen, legen Sie das Röhrchen wieder auf Eis und fügen Sie die entsprechende Menge Methanol hinzu, bevor Sie 15 Sekunden lang wirbeln.Homogenisieren Sie die Probe erneut für 45 Sekunden und inkubieren Sie sie dann 30 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Probe, saugen Sie den Überstand ab und fahren Sie mit der Messung des Nitrit- und Nitratgehalts fort. Für die Homogenisierung auf Pulverisatorbasis bereiten Sie Röhrchen vor, die die verdünnte Stopplösung enthalten, wiegen und notieren Sie dann das Gewicht der Röhrchen.Nachdem Sie das Pulverwerkzeug 30 Minuten lang auf Trockeneis abgekühlt haben, mit einer in flüssigem Stickstoff gekühlten Pinzette die vorgewogene Gewebeprobe in den Pulverisierer überführen und dann eine kleine Menge flüssigen Stickstoffs hinzufügen, um sicherzustellen, dass das Gewebe flüssige Stickstofftemperatur hat. Nachdem 95% des flüssigen Stickstoffs verdampft sind, legen Sie das Zerkleinerungswerkzeug auf das Gewebe und drücken Sie fest, um die Probe zu spüren, und schlagen Sie dann mit einem Hammer 3 bis 5 Mal auf das Zerkleinerungswerkzeug. Wenn die gesamte Probe mit einem flüssigen, stickstoffgekühlten Löffel und einer Pinzette pulverisiert wurde, wird das zerkleinerte Gewebe direkt in das vorgewogene Röhrchen mit der verdünnten Stopplösung überführt.Als nächstes wirbeln Sie den Schlauch für 15 Sekunden und öffnen Sie dann den Schlauch, um nach Gewebe zu suchen, das im Deckel steckt. Wenn ja, versuchen Sie, es zu entfernen, dann Wirbel wieder. Zentrifugieren Sie die Probe kurz für 2 bis 3 Sekunden.Wiegen Sie das Röhrchen erneut und berechnen Sie das Gewebegewicht, indem Sie das ursprüngliche Schlauchgewicht von diesem neuen Gewicht abziehen. Legen Sie die Röhre auf Eis. Fügen Sie ein geeignetes Volumen Methanol in das Röhrchen und wirbeln Sie das Röhrchen gründlich für 15 Sekunden durch, bevor Sie es 30 Minuten lang auf Eis inkubieren, dann zentrifugieren Sie die Probe, saugen Sie den Überstand ab und fahren Sie mit der Messung des Nitrit- und Nitratgehalts fort.Nitratgehalte und Ratten-Skelettmuskelhomogenate, die mit einem rotierenden Homogenisator, einem Perlenhomogenisator und einem Pulverisierer hergestellt wurden, waren ähnlich. Interessanterweise zeigte die von einem Pulverisierer vorbereitete Homogenatprobe für den Nitritgehalt den höchsten Wert, der sich statistisch von den beiden anderen Probenwerten unterschied. Ein Vergleich der Nitrit- und Nitratgehalte in Gluteushomogenaten, die aus 20, 50 und 200 Milligramm Gewebe mit einem Perlenhomogenisator hergestellt wurden, zeigte, dass sich weder der Nitrat- noch der Nitritgehalt zwischen den Muskelprobengrößen signifikant unterschied.Der Vergleich der Nitratwerte in verschiedenen Skelettmuskelgeweben von Nagetieren zeigte, dass der Gesäßmuskel etwa doppelt so hohe Nitratwerte aufwies als die anderen drei Muskelgewebe. Diese Unterschiede erreichten jedoch keine statistische Signifikanz. Ähnlich wie die Nitratwerte war auch die Nitratkonzentration im Gesäßmuskel höher als in den anderen drei Muskelgeweben und signifikant höher als in der Gastrocnemiusprobe.Unsere Methode ist relativ einfach und eignet sich gut für kleine Proben, während Nitrat und Nitrit während der Probenvorbereitung erhalten bleiben.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Forschung

Biologie

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Verfahren für die Ratte<em&gt; In situ</em&gt; Skeletal Muscle kontraktilen Eigenschaften

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-Schädigung der Zebrafisch Embryonale Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Tissue Triage und Einfrieren der Modelle von Skelettmuskelerkrankungen

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Mess Nitrit und Nitrat, Metabolite in der Stickoxid-Bahn, in biologischen Materialien der Chemilumineszenz-Methode unter Verwendung von

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung von fibro-adipogenen Vorläufern (FAPs) und myogenen Vorläufern (MPs) in der Skelettmuskulatur der Ratte

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...