Name: preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements
Uploaded: 2021-07-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH / NIDDK פנימי ZIA DK 0251041-14 לאלן נ שכטר, MD.

פרוטוקול בעלי חיים אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של NIDDK (ASP K049-MMB-20). בעלי חיים טופלו וטופלו על פי המדריך הנוכחי לטיפול ושימוש בחיות מעבדה הזמין באופן חופשי באתר AAALAC.
1. אוסף שרירי שלד עכברושים
<ol><li>בזמן שחולדה נמצאת תחת הרדמה עמוקה (5% איזופלורן, שאושר על ידי תגובה ...

<ol>
	<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+as+a+unique+signaling+molecule+in+the+vascular+system:+a+historical+overview.">Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), 503-514 (2002).</li><li>Moncada, S., Higgs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-arginine-nitric+oxide+pathway.">The L-arginine-nitric oxide pathway.</a> New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).</li><li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+lifetime+of+nitric+oxide:+implications+for+the+perivascular+dynamics+of+NO+and+O2.">The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics.">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).</li><li>Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+in+plasma+nitrite+after+a+dietary+nitrate+load+is+markedly+attenuated+by+an+antibacterial+mouthwash.">The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash.</a> Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).</li><li>Jansson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+functional+nitrate+reductase+that+regulates+nitrite+and+nitric+oxide+homeostasis.">A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis.</a> Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).</li><li>Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+as+a+source+of+nitrite+and+nitric+oxide+during+exercise+hyperemia+in+rat+skeletal+muscle.">Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle.</a> Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).</li><li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation.">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li><li>Shiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxymyoglobin+is+a+nitrite+reductase+that+generates+nitric+oxide+and+regulates+mitochondrial+respiration.">Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration.</a> Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).</li><li>Millar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthine+oxidoreductase+catalyses+the+reduction+of+nitrates+and+nitrite+to+nitric+oxide+under+hypoxic+conditions.">Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions.</a> FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).</li><li>Benjamin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomach+NO+synthesis.">Stomach NO synthesis.</a> Nature. 368 (6471), 502 (1994).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragastric+nitric+oxide+production+in+humans:+measurements+in+expelled+air.">Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air.</a> Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).</li><li>Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dietary+nitrate+on+blood+pressure+in+healthy+volunteers.">Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).</li><li>Kapil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+nitrate+supplementation+lowers+blood+pressure+in+humans:+role+for+nitrite-derived+NO.">Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO.</a> Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).</li><li>Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nitrate+supplementation+and+exercise+performance.">Dietary nitrate supplementation and exercise performance.</a> Sports Medicine. 44, 35-45 (2014).</li><li>Piknova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+as+an+endogenous+nitrate+reservoir.">Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir.</a> Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).</li><li>Wylie, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+nitrate+store:+influence+of+dietary+nitrate+supplementation+and+exercise.">Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise.</a> Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).</li><li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitrite+in+blood+samples+using+the+ferricyanide-based+hemoglobin+oxidation+assay.">Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay.</a> Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).</li><li>Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Nitrite+and+Nitrate,+Metabolites+in+the+Nitric+Oxide+Pathway,+in+Biological+Materials+using+the+Chemiluminescence+Method.">Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).</li><li>Nyakayiru, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+nitrate+ingestion+increases+skeletal+muscle+nitrate+content+in+humans.">Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans.</a> Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).</li><li>Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitrate+and+nitrite+in+biopsy-sized+muscle+samples+using+HPLC.">Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC.</a> Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).</li><li>Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+DNA-strand+co-segregation+and+asymmetric+cell+division+in+skeletal+muscle+stem+cells.">Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).</li><li>Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+type+differences+in+nitrate+and+nitrite+storage+and+nitric+oxide+signaling+in+rats.">Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Ohtake, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nitrite+supplementation+improves+insulin+resistance+in+type+2+diabetic+KKA(y)+mice.">Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice.</a> Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).</li></ol>

כדי לעקוב אחר שינויים במטבוליטים NO, חנקות וניטריט, כפונקציה של התערבויות פיזיולוגיות, זה הכרחי כדי למדוד את רמות יונים אלה באיברים השונים כי הם קריטיים בחילוף החומרים שלהם. כמו המוגלובין בדם יגיב עם NO ואת המטבוליטים שלה, חשוב גם להסיר את הדם במהירות מדגימות רקמות ככל האפשר. לפיכך, בעלי חיים...

תחמוצת החנקן (NO), מולקולת איתות גזית קטנה, ממלאת תפקיד קריטי בתהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים1. לא ניתן לייצר NO מ-L-ארגינין על-ידי אנזימים אנדוגניים ממשפחת הסינתאז של תחמוצת החנקן (NOS) לפני שהוא עובר חמצון מהיר לחנקות (NO 3-) וייתכן שגם ניטריט (NO 2-) בדם וברקמות 2,3. לאחרונה הוכח כי אניונים אלה מופחתים בחזרה ל-NO במערכות יונקים4. חנקה מומרת לניטריט, בעיקר על ידי רדוקטזות של חיידקים חנקתיים בחלל הפה הפועלות על יונים המופרשים על ידי בלוטות הרוק ונבלעים ישירות 5, ובמידה מסוימת, על ידי אנזימים של יונקים כגון קסנטין אוקסידורדוקטאז 6,7. ניטריט יכול להיות מופחת עוד יותר ל-NO על ידי מספר מנגנונים, כולל דאוקסיהמוגלובין8, דאוקסימיוגלובין9, אנזימים המכילים מוליבדן 10, והפחתה לא אנזימטית בנוכחות פרוטונים11,12.
מסלול ניטריט-ניטריט-NO זה משופר בתנאים היפוקסיים שבהם פעילות ה-NOS פוחתת מכיוון ש-NOS דורש חמצן עבור NO דור4. מחקרים רבים שנערכו לאחרונה דיווחו על השפעות מועילות של חנקות תזונתיות על ויסות לחץ הדם ועל הביצועים הגופניים, מה שמצביע על כך שמסלולי הפחתת חנקות תורמים להגברת האיתות NO13,14,15. מחקרים קודמים הראו כי חלק משרירי השלד הם ככל הנראה מקומות אחסון החנקות העיקריים בגוף16. בהשוואה לדם או לאיברים פנימיים אחרים כגון כבד, שרירי השלד (gluteus maximus) מכילים רמות גבוהות משמעותית של חנקות ויש להם מסה משמעותית בגוף היונקים. הודגם כי תרגיל הליכון משפר את הפחתת החנקות לניטריט ול-NO בגלוטאוס בחולדה מדגם7. תוצאות אלה מרמזות על כך ששרירי שלד מסוימים עשויים להיות מקורות חשובים ל-NO באמצעות מסלולי הפחתת חנקות במצבים פיזיולוגיים. מחקרים עדכניים יותר מצביעים על כך שממצאים אלה, כולל שינויים ברמות החנקות בשרירים במהלך פעילות גופנית, מתרחשים גם בבני אדם17.
שניים מהמחברים הנוכחיים ביססו בעבר שיטה למדידת רמות חנקות וניטריט בדם ובדגימות נוזליות אחרות18. עם זאת, כאשר הרמות של אניונים אלה בהומוגנטים רקמה נותחו בתחילה, פרוטוקולים מפורטים לא היו זמינים. כדי להבין את הדינמיקה של ניטרט-ניטריט-NO בכמה איברים שונים, המטרה שלנו הייתה לפתח שיטה מדויקת ויעילה למדידת רמות החנקות והניטריטים ברקמות יונקים, כולל שרירי השלד. במחקרים קודמים, רקמות מכרסמים שימשו לפיתוח תהליכי הומוגניזציה אמינים ולאחר מכן לניתוח תכולת חנקות וניטריטים באותם הומוגנטים 7,16,19. השימוש בשיטת הומוגניזציה זו הורחב לדגימות ביופסיה של שרירי שלד אנושיים, לפיהן אושרו הערכים, וחשוב מכך, הערכים שנצפו עבור שריר בהשוואה לדם/פלזמה היו בטווחים ויחסים דומים לאלה שנצפו במכרסמים17. בשנים האחרונות, גם קבוצות אחרות החלו למדוד את רמות החנקות והניטריטים אצל הומוגנאטים בשרירי השלד, ודיווחו על ערכים דומים לאלה שדווחו על ידי הקבוצה שלנו20,21.
מטרת מאמר פרוטוקול זה היא לתאר בפירוט את הכנת הומוגנאטים בשרירי השלד באמצעות שלוש שיטות הומוגניזציה שונות למדידה עוקבת של רמות חנקות וניטריטים. בנוסף, נבדקו ההשפעות של משקל הרקמה המשמש להומוגניזציה על ערכים של חנקות וניטריט בדגימות שרירי השלד. אנו מאמינים כי ניתן ליישם שיטות אלה בקלות על סוגים אחרים של רקמות יונקים. לאחרונה, במיוחד בתחום הפיזיולוגיה של האימון, הוקדשה תשומת לב להבדלים האפשריים בפיזיולוגיה של ניטריט/ניטריט/NO בהתאם לקבוצות שרירים. אנו מדווחים גם על כמויות הניטראט והניטריט בארבעה שרירי מכרסמים שונים ומוצאים התפלגות לא אחידה של שני היונים בין השרירים השונים האלה; תצפית הדורשת מחקר נוסף.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>gentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentle MACS M tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td>Length: 87 mm; Diameter: 30 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC-0409-7620-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>NDC-10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys bead homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEM; N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide analyzer</td>
			<td>GE</td>
			<td>Sievers NOA 280i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>702587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys lysing kit</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000911-LYSK0-A</td>
			<td>contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulverizer kit</td>
			<td>Cellcrusher</td>
			<td>Cellcrusher kit</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements

יונים חנקתיים (NO3-) נחשבו בעבר לתוצרים סופיים אינרטיים של חילוף החומרים של תחמוצת החנקן (NO). עם זאת, מחקרים קודמים הראו כי יונים חנקתיים יכולים להיות מומרים בחזרה ל-NO ביונקים באמצעות מנגנון הפחתה דו-שלבי: ניטרט מופחת לניטריט (NO2-) בעיקר על ידי חיידקי קומנסל דרך הפה, ואז ניטריט מופחת ל-NO על ידי מספר מנגנונים, כולל באמצעות חלבונים המכילים הם או מוליבדן. מסלול חנקתי רדוקטיבי זה תורם לשיפור מסלולי איתות ללא תיווך, במיוחד במערכת הלב וכלי הדם ובמהלך פעילות גופנית. רמות החנקות בגוף לפני ניצול כזה נקבעות על ידי שני מקורות שונים: חמצון NO אנדוגני וצריכת חנקות תזונתית, בעיקר מצמחים. כדי להבהיר את מחזור ה-NO המורכב בנסיבות פיזיולוגיות, בחנו עוד יותר את הדינמיקה של המטבוליטים, יוני החנקות והניטריטים שלו, שהם יציבים יחסית בהשוואה ל-NO. במחקרים קודמים זוהה שריר השלד כאיבר אחסון מרכזי ליוני חנקות ביונקים, וכן כמקור ישיר של NO במהלך פעילות גופנית. לכן, קביעת מתודולוגיה אמינה למדידת רמות החנקות והניטריטים בשרירי השלד חשובה ואמורה לסייע בהרחבת יישומה לדגימות רקמות אחרות. מאמר זה מסביר בפירוט את הכנת דגימות שרירי השלד, תוך שימוש בשלוש שיטות הומוגניות שונות, למדידות ניטראט וניטריט ודן בנושאים חשובים הקשורים לתהליכי הומוגניזציה, כולל גודל הדגימות. ריכוזי ניטראט וניטריט הושוו גם בארבע קבוצות שרירים שונות.

כדי להשיג תוצאות מייצגות, רקמות שריר השלד מ 8 חולדות Wistar (זכרים ונקבות, משקל 250 ± 50 גרם) שימשו. הומוגנאטים של שרירי שלד חולדה (50 מ"ג של שריר גלוטאוס מקסימוס לכל שיטה) הוכנו על ידי שלושה כלי הומוגניזציה שונים (הומוגנייזר סיבובי, הומוגנייזר חרוזים ופולברייזר). לאחר מכן, תכולת החנקות והניטריטים של...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements at JoVE.com

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

אנו מציגים פרוטוקולים לשלוש שיטות שונות להומוגניזציה של ארבע קבוצות שרירים שונות של רקמת שריר שלד חולדה כדי למדוד ולהשוות את רמות החנקות והניטריט. יתר על כן, אנו משווים משקלים שונים של דגימות כדי לחקור אם גודל דגימת הרקמה משפיע על תוצאות ההומוגניזציה.

הכנת הומוגנטים של שרירי שלד חולדה למדידות חנקות וניטריט

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

שרירי השלד משמשים כמאגר מרכזי של חנקות אשר, לאחר הפיכתו לניטריט, משמש כמקור של NO במהלך פעילות גופנית. כאן אנו מציגים מתודולוגיה למדידת יונים אלה בשרירים וברקמות אחרות. כדי להתחיל, הכינו את תמיסת שימור החנקות או עצרו אותה על ידי שילוב של 890 מילימולאר אשלגן פריציאניד ו-118 מילימולאר n-מתיל-מאלימיד במים מזוקקים, כדי להבטיח שלא יישארו גבישים בתמיסה, ואז הוסיפו חומר פעיל שטח לא יוני ביחס של 1 ל-9 וערבבו בעדינות כדי למנוע קצף.דלל את תמיסת העצירה ביחס של 1 ל-9 עם מים מזוקקים והוסף את תמיסת העצירה המדוללת לצינור ההומוגניזציה. לאחר מכן, הפשירו את רקמת השריר הקודמת של החולדה המבודדת והקפואה על הקרח. לאחר שהרקמה הפשירה, הסר את השומן ורקמת החיבור הנותרים משרירי השלד.חותכים חתיכות של שריר השלד ומכתימים אותם על גזה לייבוש. שקלו את הכמות המתאימה של רקמת שריר השלד, ולאחר מכן הניחו את הרקמה שלפני המשקל בצינורות ההומוגניזציה המכילים את תמיסת העצירה. עבור הומוגניזציה בהומוגנייזר סיבובי, הנח את הצינור מסוג M המכיל את שריר השלד שנשקל מראש ותמיסת עצירה שנמדדה מראש לתוך המכונה.הומוגניות כל דגימה פעמיים, ולאחר כל הומוגניזציה, מניחים את הצינור על הקרח מיד למשך 5 דקות כדי להתקרר. לאחר הומוגניזציה, צנטריפוגה את הצינור לזמן קצר. החזירו את הצינור לקרח והוסיפו את הנפח המתאים של מתנול לפני המערבולת במשך 15 שניות.הומוגניזציה של הדגימה שוב ודגירה שלה על קרח במשך 30 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה של הדגימה, לשאוף את supernatant, ולהמשיך למדוד את רמות ניטריט וניטרט. עבור הומוגניזציה של חרוזים, מניחים את רקמת שריר השלד בצינור המכיל חרוזים והומוגניים פעמיים למשך 45 שניות במהירות הגבוהה ביותר הקיימת במכשיר. לאחר כל הומוגניזציה, מיד להניח את הצינור על קרח במשך 5 דקות כדי להתקרר, ולאחר מכן צנטריפוגה את הצינור, להניח את הצינור בחזרה על קרח, ולהוסיף את הנפח המתאים של מתנול לפני מערבולת במשך 15 שניות.הומוגניזציה של הדגימה שוב למשך 45 שניות ואז דגירה על קרח במשך 30 דקות. צנטריפוגה של הדגימה, לשאוף את supernatant, ולהמשיך למדוד את רמות ניטריט וניטרט. עבור הומוגניזציה מבוססת pulverizer, להכין צינורות המכילים את תמיסת עצירה מדולל, ולאחר מכן לשקול ולרשום את המשקל של הצינורות.לאחר קירור כלי הפולברייזר על קרח יבש למשך 30 דקות, באמצעות פינצטה מקוררת בחנקן נוזלי, מעבירים את דגימת הרקמה שנשקלה מראש לפולברייזר, ואז מוסיפים כמות קטנה של חנקן נוזלי כדי להבטיח שהרקמה נמצאת בטמפרטורת חנקן נוזלי. לאחר ש-95% מהחנקן הנוזלי התאדה, הניחו את כלי הריסוק על גבי הרקמה ולחצו בחוזקה כדי להרגיש את ריסוק הדגימה, ואז באמצעות מאלט, היכו בכלי הריסוק 3 עד 5 פעמים. כאשר כל הדגימה כבר pulverized, באמצעות כף נוזלית מקורר חנקן פינצטה, ישירות להעביר את הרקמה המרוסקת לתוך צינור ששקל מראש המכיל את תמיסת עצירה מדולל.לאחר מכן, מערבל את הצינור במשך 15 שניות, ולאחר מכן לפתוח את הצינור כדי לבדוק אם כל רקמה תקועה במכסה. אם יש, נסה להיפטר ממנו, ואז מערבולת שוב. צנטריפוגה קצרה של הדגימה למשך 2 עד 3 שניות.שקלו שוב את הצינור וחשבו את משקל הרקמה על ידי ניכוי משקל הצינור המקורי ממשקל חדש זה. מניחים את הצינור על קרח. הוסיפו נפח מתאים של מתנול לצינור ומערבבים את הצינור ביסודיות למשך 15 שניות לפני הדגירה שלו על קרח למשך 30 דקות, ואז עשו צנטריפוגה לדגימה, שאפו את הסופר-נטנט והמשיכו למדידת רמות הניטריט והחנקה.רמות החנקות וההומוגנטים בשרירי השלד של חולדות שהוכנו באמצעות הומוגנייזר סיבובי, הומוגנייזר חרוזים ופולברייזר היו דומים. באופן מעניין, עבור רמות ניטריט, הדגימה ההומוגנית שהוכנה על ידי pulverizer הראתה את הערך הגבוה ביותר, שהיה שונה סטטיסטית משני ערכי המדגם האחרים. השוואה של רמות ניטריט וניטרט בהומוגנטים של גלוטאוס שהוכנו מ-20, 50 ו-200 מיליגרם של רקמה באמצעות הומוגנייזר חרוזים הראתה כי רמות הניטראט או הניטריט לא היו שונות באופן משמעותי בין גודל דגימת השריר.השוואת רמות החנקות ברקמות שונות של שרירי שלד ברגליים של מכרסמים גילתה כי בשריר הגלוטאוס היו רמות חנקה גבוהות בערך פי שניים משלוש רקמות השריר האחרות. עם זאת, הבדלים אלה לא הגיעו למובהקות סטטיסטית. בדומה לרמות החנקות, גם ריכוז החנקות בשריר הגלוטאוס היה גבוה מזה שבשלוש רקמות השריר האחרות והיה גבוה משמעותית מזה שבדגימה של גסטרוקנמיוס.השיטה שלנו פשוטה יחסית ומתאימה לדגימות קטנות תוך שמירה על ניטראט וניטריט במהלך הכנת הדגימה.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

נהלים לעכברוש<em&gt; באתר</em&gt; מאפייני התכווצות שרירי שלד

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

פגיעת הליזר הביא על שריר שלד עוברי דג זברה

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Triage רקמות ומקפיאים למודלים של מחלות שרירי שלד

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

מדידת הניטריט ו חנקתי, מטבוליטים במסלול תחמוצת החנקן, חומרים ביולוגיים באמצעות שיטה chemiluminescence

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

זיהוי, בידוד ואפיון של אבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs) ואבעות מיוגניים (חברי פרלמנט) בשריר השלד בחולדה

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...