Name: preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements
Uploaded: 2021-07-29T13:30:00
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이 작업은 교내 NIH / NIDDK 보조금 ZIA DK 0251041-14에서 Alan N Schechter, MD에게 지원되었습니다.

동물 프로토콜은 NIDDK 동물 관리 및 사용 위원회(ASP K049-MMB-20)에 의해 승인되었다. 동물은 AAALAC 웹사이트에서 무료로 제공되는 현재 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 취급 및 처리되었습니다.
1. 쥐 골격근 수집
<ol><li>쥐가 깊은 마취 (5 % 이소 플루 란, 꼬리 / 다리 꼬집음에 반응이없는 것으로 확인)에있는 동안 19G 바늘을 좌심실의 정점에 놓고 우심방에 흠집을 만들?...

<ol>
	<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+as+a+unique+signaling+molecule+in+the+vascular+system:+a+historical+overview.">Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), 503-514 (2002).</li><li>Moncada, S., Higgs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-arginine-nitric+oxide+pathway.">The L-arginine-nitric oxide pathway.</a> New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).</li><li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+lifetime+of+nitric+oxide:+implications+for+the+perivascular+dynamics+of+NO+and+O2.">The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics.">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).</li><li>Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+in+plasma+nitrite+after+a+dietary+nitrate+load+is+markedly+attenuated+by+an+antibacterial+mouthwash.">The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash.</a> Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).</li><li>Jansson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+functional+nitrate+reductase+that+regulates+nitrite+and+nitric+oxide+homeostasis.">A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis.</a> Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).</li><li>Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+as+a+source+of+nitrite+and+nitric+oxide+during+exercise+hyperemia+in+rat+skeletal+muscle.">Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle.</a> Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).</li><li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation.">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li><li>Shiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxymyoglobin+is+a+nitrite+reductase+that+generates+nitric+oxide+and+regulates+mitochondrial+respiration.">Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration.</a> Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).</li><li>Millar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthine+oxidoreductase+catalyses+the+reduction+of+nitrates+and+nitrite+to+nitric+oxide+under+hypoxic+conditions.">Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions.</a> FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).</li><li>Benjamin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomach+NO+synthesis.">Stomach NO synthesis.</a> Nature. 368 (6471), 502 (1994).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragastric+nitric+oxide+production+in+humans:+measurements+in+expelled+air.">Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air.</a> Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).</li><li>Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dietary+nitrate+on+blood+pressure+in+healthy+volunteers.">Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).</li><li>Kapil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+nitrate+supplementation+lowers+blood+pressure+in+humans:+role+for+nitrite-derived+NO.">Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO.</a> Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).</li><li>Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nitrate+supplementation+and+exercise+performance.">Dietary nitrate supplementation and exercise performance.</a> Sports Medicine. 44, 35-45 (2014).</li><li>Piknova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+as+an+endogenous+nitrate+reservoir.">Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir.</a> Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).</li><li>Wylie, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+nitrate+store:+influence+of+dietary+nitrate+supplementation+and+exercise.">Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise.</a> Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).</li><li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitrite+in+blood+samples+using+the+ferricyanide-based+hemoglobin+oxidation+assay.">Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay.</a> Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).</li><li>Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Nitrite+and+Nitrate,+Metabolites+in+the+Nitric+Oxide+Pathway,+in+Biological+Materials+using+the+Chemiluminescence+Method.">Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).</li><li>Nyakayiru, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+nitrate+ingestion+increases+skeletal+muscle+nitrate+content+in+humans.">Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans.</a> Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).</li><li>Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitrate+and+nitrite+in+biopsy-sized+muscle+samples+using+HPLC.">Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC.</a> Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).</li><li>Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+DNA-strand+co-segregation+and+asymmetric+cell+division+in+skeletal+muscle+stem+cells.">Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).</li><li>Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+type+differences+in+nitrate+and+nitrite+storage+and+nitric+oxide+signaling+in+rats.">Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Ohtake, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nitrite+supplementation+improves+insulin+resistance+in+type+2+diabetic+KKA(y)+mice.">Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice.</a> Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).</li></ol>

생리적 개입의 기능으로 NO 대사 산물, 질산염 및 아질산염의 변화를 모니터링하려면 신진 대사에 중요한 여러 기관에서 이러한 이온의 수준을 측정하는 것이 필수적입니다. 혈액 내의 헤모글로빈은 NO 및 그 대사 산물과 반응하므로 가능한 한 조직 샘플에서 혈액을 신속하게 제거하는 것도 중요합니다. 따라서 골격근 조직 (대둔근, TA, EDL, 비복근)을 수집하기 전에 동물을 식염수로 관류시키고 표?...

작은 기체 신호 분자인 산화질소(NO)는 생리학적 및 병리생리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다1. NO는 질산염 (NO 3-) 및 아마도 혈액 및 조직에서 아질산염 (NO2-)으로 빠르게 산화되기 전에 산화 질소 합성 효소 (NOS) 계열의 내인성 효소에 의해 L- 아르기닌으로부터 생성 될 수있다 2,3. 최근에, 이들 음이온은 포유류 시스템4에서 NO로 다시 환원되는 것으로 나타났다. 질산염은 주로 타액선에서 분비되고 직접 섭취되는 이온에 작용하는 구강 내 공생 박테리아 질산염 환원 효소 5에 의해 아질산염으로 전환되며, 어느 정도는 크 산틴 산화 환원 효소 6,7과 같은 포유류 효소에 의해 전환됩니다. 아질산염은 데옥시헤모글로빈8, 데옥시미오글로빈9, 몰리브덴 함유 효소(10) 및 양성자의 존재 하에서의 비효소적 환원(11,12)을 포함하는 여러 메커니즘에 의해 NO로 더 감소될 수 있다.
이 질산염-아질산염-NO 경로는 NOS가 NO 생성4에 산소를 필요로하기 때문에 NOS 활성이 감소하는 저산소 조건 하에서 강화됩니다. 최근의 많은 연구에서는 식이 질산염이 혈압 조절 및 운동 수행에 유익한 효과를 보고했으며, 이는 질산염 감소 경로가 NO 신호 전달13,14,15의 증가에 기여한다는 것을 시사합니다. 이전의 연구는 일부 골격근이 신체의 주요 질산염 저장 장소 일 가능성이 있음을 보여주었습니다16. 혈액이나 간과 같은 다른 내부 장기와 비교할 때 골격근 (대둔근)은 상당히 높은 수준의 질산염을 함유하고 포유류 신체에 상당한 질량을 가지고 있습니다. 트레드밀 운동은 쥐 모델7에서 아질산염과 둔근의 NO로의 질산염 감소를 향상시키는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 일부 골격근이 생리적 상황에서 질산염 환원 경로를 통해 NO의 중요한 공급원이 될 수 있음을 의미합니다. 보다 최근의 연구에 따르면 운동 중 근육 질산염 수준의 변화를 포함한 이러한 발견은 인간에서도 발생합니다17.
현재 저자 중 두 명은 이전에 혈액 및 기타 액체 샘플에서 질산염 및 아질산염 수준을 측정하는 방법을 확립했습니다18. 그러나 조직 균질액에서 이러한 음이온의 수준을 처음 분석했을 때 자세한 프로토콜을 사용할 수 없었습니다. 여러 기관에서 질산염-아질산염-NO 역학을 이해하기 위해 우리의 목표는 골격근을 포함한 포유류 조직에서 질산염 및 아질산염 수준을 측정하는 정확하고 효율적인 방법을 개발하는 것이 었습니다. 초기 연구에서, 설치류 조직은 신뢰할 수있는 균질화 공정을 개발 한 다음 이들 균질 물 7,16,19에서 질산염 및 아질산염 함량을 분석하는 데 사용되었다. 이 균질화 방법의 사용은 인간 골격근 생검 샘플로 확장되어 값이 확인되었으며, 중요한 것은 혈액/혈장과 비교하여 근육에 대해 관찰된 값이 설치류17에서 관찰된 값과 유사한 범위 및 비율에 있다는 것입니다. 최근 몇 년 동안 다른 그룹도 골격근 균질 액에서 질산염과 아질산염 수준을 측정하기 시작하여 우리 그룹20,21에서보고 한 것과 비슷한 값을보고했습니다.
이 프로토콜 논문의 목적은 질산염 및 아질산염 수준의 후속 측정을 위해 세 가지 다른 균질화 방법을 사용하여 골격근 균질액의 제조를 자세히 설명하는 것입니다. 또한, 골격근 샘플에서 질산염 및 아질산염 값에 대한 균질화에 사용 된 조직 중량의 영향을 조사했다. 우리는 이러한 방법이 다른 유형의 포유류 조직에 쉽게 적용될 수 있다고 믿습니다. 최근 특히 운동 생리학 분야에서는 근육 그룹에 따른 질산염 / 아질산염 / NO 생리학의 가능한 차이에주의를 기울였습니다. 우리는 또한 네 개의 다른 설치류 근육에서 질산염과 아질산염의 양을보고하고 이러한 다른 근육 사이에서 두 이온의 불균일 한 분포를 찾습니다. 추가 연구가 필요한 관찰.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>gentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentle MACS M tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td>Length: 87 mm; Diameter: 30 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC-0409-7620-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>NDC-10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys bead homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEM; N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide analyzer</td>
			<td>GE</td>
			<td>Sievers NOA 280i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>702587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys lysing kit</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000911-LYSK0-A</td>
			<td>contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulverizer kit</td>
			<td>Cellcrusher</td>
			<td>Cellcrusher kit</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements

질산염 이온 (NO3-)은 한때 산화 질소 (NO) 대사의 불활성 최종 생성물로 생각되었습니다. 그러나 이전의 연구는 질산염 이온이 2 단계 환원 메커니즘을 통해 포유류에서 NO로 다시 전환 될 수 있음을 입증했다 : 질산염은 주로 경구 공생 박테리아에 의해 아질산염 (NO2-)으로 환원되고, 아질산염은 헴 또는 몰리브덴 함유 단백질을 포함한 여러 메커니즘에 의해 NO로 환원된다. 이 환원성 질산염 경로는 특히 심혈관계 및 근육 운동 중에 NO 매개 신호 전달 경로를 향상시키는 데 기여합니다. 이러한 활용 전에 신체의 질산염 수준은 주로 식물에서 내인성 NO 산화 및식이 질산염 섭취의 두 가지 다른 원인에 의해 결정됩니다. 생리적 환경에서 복잡한 NO 순환을 설명하기 위해 우리는 NO에 비해 상대적으로 안정적인 대사 산물, 질산염 및 아질산염 이온의 역학을 추가로 조사했습니다. 이전 연구에서 골격근은 포유류에서 질산염 이온의 주요 저장 기관이자 운동 중 NO의 직접적인 공급원으로 확인되었습니다. 따라서 골격근에서 질산염 및 아질산염 수준을 측정하기 위한 신뢰할 수 있는 방법론을 수립하는 것이 중요하며 다른 조직 샘플로 적용을 확장하는 데 도움이 되어야 합니다. 이 논문은 질산염 및 아질산염 측정을 위해 세 가지 다른 균질화 방법을 사용하여 골격근 샘플의 준비를 자세히 설명하고 샘플의 크기를 포함하여 균질화 과정과 관련된 중요한 문제에 대해 논의합니다. 질산염과 아질산염 농도는 또한 4 개의 다른 근육 그룹에서 비교되었습니다.

대표적인 결과를 얻기 위해, 8마리의 Wistar 쥐(수컷 및 암컷, 체중 250 ± 50g)로부터의 골격근 조직을 사용하였다. 래트 골격근 균질물(각 방법에 대해 대둔근 50mg)을 3개의 상이한 균질화 도구(회전 균질화기, 비드 균질화기 및 분쇄기)에 의해 제조하였다. 그런 다음 이러한 균질액의 질산염 및 아질산염 함량을 산화질소 분석기(NOA)를 사용하여 측정했습니다(그림 4). 이 세 가지 ?...

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Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

우리는 질산염과 아질산염의 수준을 측정하고 비교하기 위해 쥐 골격근 조직의 4 가지 근육 그룹의 균질화를위한 세 가지 다른 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다. 또한 조직 샘플 크기가 균질화 결과에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 다양한 샘플 가중치를 비교합니다.

질산염 및 아질산염 측정을 위한 쥐 골격근 균질액의 제조

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

골격근은 질산염으로 전환 된 후 운동 중에 NO의 원천 역할을하는 질산염의 주요 저장소 역할을합니다. 여기에서는 근육과 다른 조직에서 이러한 이온을 측정하는 방법론을 제시합니다. 시작하려면 증류수에 890 밀리몰 칼륨 페리시안화물과 118 밀리몰 n- 메틸 말레이 미드를 결합하여 질산염 보존 또는 정지 용액을 준비하고 용액에 결정이 남아 있지 않은지 확인한 다음 비이 온성 계면 활성제를 1 대 9 비율로 첨가하고 거품을 피하기 위해 부드럽게 혼합하십시오.정지 용액을 증류수로 1 대 9 비율로 희석하고 희석 된 정지 용액을 균질화 튜브에 첨가하십시오. 다음으로, 이전에 분리되고 얼어 붙은 쥐 근육 조직을 얼음 위에서 해동하십시오. 조직이 해동되면 골격근에서 남은 지방과 결합 조직을 제거합니다.골격근 조각을 잘라 내고 거즈로 닦아서 말립니다. 적절한 양의 골격근 조직의 무게를 측정한 다음 정지 용액이 포함된 균질화 튜브에 사전 중량 조직을 넣습니다. 회전식 균질화기에서 균질화를 위해 미리 계량된 골격근과 미리 측정된 정지 용액이 포함된 M형 튜브를 기계에 넣습니다.각 샘플을 두 번 균질화하고 각 균질화 후 튜브를 즉시 얼음 위에 놓고 5 분 동안 식힌다. 균질화 후 튜브를 짧게 원심 분리하십시오. 튜브를 얼음 위에 다시 놓고 15초 동안 볼텍싱하기 전에 적절한 양의 메탄올을 추가합니다.샘플을 다시 균질화하고 얼음에서 30 분 동안 배양 한 다음 샘플을 원심 분리하고 상청액을 흡입하고 아질산염 및 질산염 수준을 측정합니다. 비드 균질화를 위해 골격근 조직을 비드 함유 튜브에 넣고 기기에서 사용할 수 있는 최고 속도로 45초 동안 두 번 균질화합니다. 각 균질화 후 즉시 튜브를 얼음에 5분 동안 놓아 식힌 다음 튜브를 원심분리하고 튜브를 얼음 위에 다시 놓고 15초 동안 소용돌이치기 전에 적절한 양의 메탄올을 추가합니다.샘플을 다시 한 번 45초 동안 균질화한 다음 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 샘플을 원심분리하고 상청액을 흡입하고 아질산염 및 질산염 수준 측정을 진행합니다. 분쇄기 기반 균질화의 경우 희석된 정지 용액이 포함된 튜브를 준비한 다음 튜브의 무게를 측정하고 기록합니다.드라이 아이스에서 분쇄기 도구를 30 분 동안 냉각 한 후 액체 질소로 식힌 핀셋을 사용하여 미리 계량 된 조직 샘플을 분쇄기로 옮긴 다음 소량의 액체 질소를 추가하여 조직이 액체 질소 온도에 있는지 확인합니다. 액체 질소의 95%가 기화된 후 분쇄 도구를 조직 위에 놓고 단단히 눌러 샘플 분쇄를 느낀 다음 망치를 사용하여 분쇄 도구를 3-5회 칩니다. 전체 샘플이 분쇄되면 액체 질소 냉각 스푼과 핀셋을 사용하여 분쇄 된 조직을 희석 된 정지 용액이 들어있는 사전 칭량 튜브로 직접 옮깁니다.그런 다음 튜브를 15초 동안 휘젓고 튜브를 열어 뚜껑에 붙어 있는 조직이 있는지 확인합니다. 있다면, 그것을 제거 한 다음 다시 소용돌이치십시오. 샘플을 2-3초 동안 간단히 원심분리합니다.튜브의 무게를 다시 측정하고 이 새 무게에서 원래 튜브 무게를 공제하여 조직 무게를 계산합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 튜브에 적절한 양의 메탄올을 넣고 15 초 동안 튜브를 완전히 와동시킨 다음 얼음에서 30 분 동안 배양 한 다음 샘플을 원심 분리하고 상청액을 흡인하고 아질산염 및 질산염 수준을 측정합니다.질산염 수준 및 회전식 균질화기, 비드 균질화기 및 분쇄기를 사용하여 제조된 래트 골격근 균질물은 유사하였다. 흥미롭게도, 아질산염 수준의 경우, 분쇄기에 의해 제조 된 균질 액 샘플이 가장 높은 값을 나타 냈으며, 이는 다른 두 샘플 값과 통계적으로 달랐다. 비드 균질화를 사용하여 20, 50 및 200 밀리그램의 조직으로부터 제조 된 둔근 균질 액의 아질산염과 질산염 수준의 비교는 질산염 또는 아질산염 수준이 근육 샘플 크기간에 유의하게 다르지 않은 것으로 나타났다.다른 설치류 다리 골격근 조직에서 질산염 수준을 비교한 결과 둔근이 다른 세 근육 조직보다 질산염 수치가 약 2배 더 높은 것으로 나타났습니다. 그러나 이러한 차이는 통계적 유의성에 도달하지 못했습니다. 질산염 수준과 유사하게, 둔근의 질산염 농도도 다른 세 근육 조직보다 높았으며 비복근 샘플보다 훨씬 높았습니다.당사의 방법은 비교적 간단하고 샘플 준비 중에 질산염과 아질산염을 보존하면서 작은 샘플에 적합합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

연구

생물학

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

쥐 절차<em&gt; 현장에서</em&gt; 골격근 수축 등록

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

조직의 우선 순위 구분과 골격근 질환 모델에 대한 동결

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

화학 발광 법을 사용하여 생체 물질에서 산화 질소 통로에서 아질산염과 질산염, 대사 산물을 측정

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

쥐의 골격 근육에서 섬유 선화 (FAP) 및 근생 전구자 (의원)의 식별, 격리 및 특성화

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...