Name: preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements
Uploaded: 2021-07-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av intramural NIH / NIDDK stipend ZIA DK 0251041-14 til Alan N Schechter, MD.

Dyreprotokollen ble godkjent av NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20). Dyr ble håndtert og behandlet i henhold til gjeldende Veiledning for pleie og bruk av forsøksdyr fritt tilgjengelig på AAALAC nettside.
1. Samling av skjelettmuskler fra rotter
<ol><li>Mens en rotte er under dyp anestesi (5 % isofluran, bekreftet ved manglende reaksjon på hale/benklemme), start perfusjon med saltvann som inneholder heparin ved å plassere en 19 G nål i en apex av venstre ventrikkel og...

<ol>
	<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+as+a+unique+signaling+molecule+in+the+vascular+system:+a+historical+overview.">Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), 503-514 (2002).</li><li>Moncada, S., Higgs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-arginine-nitric+oxide+pathway.">The L-arginine-nitric oxide pathway.</a> New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).</li><li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+lifetime+of+nitric+oxide:+implications+for+the+perivascular+dynamics+of+NO+and+O2.">The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics.">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).</li><li>Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+in+plasma+nitrite+after+a+dietary+nitrate+load+is+markedly+attenuated+by+an+antibacterial+mouthwash.">The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash.</a> Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).</li><li>Jansson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+functional+nitrate+reductase+that+regulates+nitrite+and+nitric+oxide+homeostasis.">A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis.</a> Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).</li><li>Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+as+a+source+of+nitrite+and+nitric+oxide+during+exercise+hyperemia+in+rat+skeletal+muscle.">Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle.</a> Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).</li><li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation.">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li><li>Shiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxymyoglobin+is+a+nitrite+reductase+that+generates+nitric+oxide+and+regulates+mitochondrial+respiration.">Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration.</a> Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).</li><li>Millar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthine+oxidoreductase+catalyses+the+reduction+of+nitrates+and+nitrite+to+nitric+oxide+under+hypoxic+conditions.">Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions.</a> FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).</li><li>Benjamin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomach+NO+synthesis.">Stomach NO synthesis.</a> Nature. 368 (6471), 502 (1994).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragastric+nitric+oxide+production+in+humans:+measurements+in+expelled+air.">Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air.</a> Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).</li><li>Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dietary+nitrate+on+blood+pressure+in+healthy+volunteers.">Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).</li><li>Kapil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+nitrate+supplementation+lowers+blood+pressure+in+humans:+role+for+nitrite-derived+NO.">Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO.</a> Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).</li><li>Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nitrate+supplementation+and+exercise+performance.">Dietary nitrate supplementation and exercise performance.</a> Sports Medicine. 44, 35-45 (2014).</li><li>Piknova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+as+an+endogenous+nitrate+reservoir.">Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir.</a> Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).</li><li>Wylie, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+nitrate+store:+influence+of+dietary+nitrate+supplementation+and+exercise.">Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise.</a> Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).</li><li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitrite+in+blood+samples+using+the+ferricyanide-based+hemoglobin+oxidation+assay.">Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay.</a> Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).</li><li>Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Nitrite+and+Nitrate,+Metabolites+in+the+Nitric+Oxide+Pathway,+in+Biological+Materials+using+the+Chemiluminescence+Method.">Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).</li><li>Nyakayiru, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+nitrate+ingestion+increases+skeletal+muscle+nitrate+content+in+humans.">Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans.</a> Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).</li><li>Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitrate+and+nitrite+in+biopsy-sized+muscle+samples+using+HPLC.">Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC.</a> Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).</li><li>Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+DNA-strand+co-segregation+and+asymmetric+cell+division+in+skeletal+muscle+stem+cells.">Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).</li><li>Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+type+differences+in+nitrate+and+nitrite+storage+and+nitric+oxide+signaling+in+rats.">Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Ohtake, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nitrite+supplementation+improves+insulin+resistance+in+type+2+diabetic+KKA(y)+mice.">Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice.</a> Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).</li></ol>

For å overvåke endringer i NO-metabolitter, nitrat og nitritt, som en funksjon av fysiologiske inngrep, er det viktig å måle nivåene av disse ionene i de forskjellige organene som er kritiske i deres metabolisme. Siden hemoglobin i blod vil reagere med NO og dets metabolitter, er det også viktig å fjerne blod raskt fra vevsprøver så mye som mulig. Dermed ble dyrene perfundert med saltvann før de samlet skjelettmuskelvev (gluteus, TA, EDL, gastrocnemius muskel), og bindevev og fett rundt målmuskelen ble umiddel...

Nitrogenoksid (NO), et lite gassformig signalmolekyl, spiller en kritisk rolle i fysiologiske og patofysiologiske prosesser1. NO kan produseres fra L-arginin av endogene enzymer i nitrogenoksidsyntasefamilien (NOS) før den gjennomgår rask oksidasjon til nitrat (NO 3-) og muligens nitritt (NO 2-) i blod og vev 2,3. Nylig har disse anionene vist seg å være redusert tilbake til NO i pattedyrsystemer4. Nitrat omdannes til nitritt, hovedsakelig ved kommensale bakterielle nitratreduktaser i munnhulen som virker på ioner utskilt av spyttkjertlene og direkte inntatt 5, og til en viss grad av pattedyrenzymer som xantinoksidoreduktase 6,7. Nitritt kan reduseres ytterligere til NO ved flere mekanismer, inkludert deoksyhemoglobin8, deoksymyoglobin9, molybdenholdige enzymer 10 og ikke-enzymatisk reduksjon i nærvær av protoner11,12.
Denne nitrat-nitritt-NO-banen forbedres under hypoksiske forhold der NOS-aktiviteten reduseres fordi NOS krever oksygen for NO-generasjon4. Mange nyere studier har rapportert gunstige effekter av diettnitrat på blodtrykksregulering og treningsytelse, noe som tyder på at nitratreduksjonsveier bidrar til økt NO-signalering13,14,15. Tidligere studier har vist at noen skjelettmuskler sannsynligvis er de viktigste nitratlagringsstedene i kroppen16. Sammenlignet med blod eller andre indre organer som lever, inneholder skjelettmuskulatur (gluteus maximus) betydelig høyere nivåer av nitrat og har en betydelig masse i pattedyrkroppen. Tredemølleøvelse ble vist å øke nitratreduksjonen til nitritt og til NO i gluteus i en rottemodell7. Disse resultatene antyder at noen skjelettmuskler kan være viktige kilder til NO gjennom nitratreduksjonsveier i fysiologiske situasjoner. Nyere studier tyder på at disse funnene, inkludert endringer i muskelnitratnivåer under trening, også forekommer hos mennesker17.
To av de nåværende forfatterne hadde tidligere etablert en metode for å måle nitrat- og nitrittnivåer i blod og andre væskeprøver18. Men da nivåene av disse anionene i vevshomogenater først ble analysert, var detaljerte protokoller ikke tilgjengelige. For å forstå nitrat-nitritt-NO-dynamikken i flere forskjellige organer, var målet vårt å utvikle en nøyaktig og effektiv metode for å måle nitrat- og nitrittnivåer i pattedyrvev, inkludert skjelettmuskulatur. I tidligere studier ble gnagervev brukt til å utvikle pålitelige homogeniseringsprosesser og deretter analysere nitrat- og nitrittinnhold i disse homogenatene 7,16,19. Bruken av denne homogeniseringsmetoden ble utvidet til humane skjelettmuskelbiopsiprøver, hvorved verdiene ble bekreftet, og viktigere, verdiene observert for muskel sammenlignet med blod / plasma var i lignende områder og forhold til de som ble observert hos gnagere17. I de senere år har andre grupper også begynt å måle nitrat- og nitrittnivåer i skjelettmuskelhomogenater, og rapporterte sammenlignbare verdier til de som ble rapportert av vår gruppe20,21.
Målet med dette protokollnotatet er å beskrive i detalj fremstillingen av skjelettmuskelhomogenater ved bruk av tre forskjellige homogeniseringsmetoder for etterfølgende måling av nitrat- og nitrittnivåer. I tillegg ble effekten av vevsvekt brukt til homogenisering på verdier av nitrat og nitritt i skjelettmuskelprøver undersøkt. Vi tror at disse metodene lett kan brukes på andre typer pattedyrvev. Nylig, spesielt innen treningsfysiologi, hadde oppmerksomheten blitt rettet mot mulige forskjeller i nitrat / nitritt / NO fysiologi i henhold til muskelgrupper. Vi rapporterer også mengdene nitrat og nitritt i fire forskjellige gnagermuskler og finner en ujevn fordeling av begge ioner mellom disse forskjellige musklene; en observasjon som krever videre studier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>gentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentle MACS M tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td>Length: 87 mm; Diameter: 30 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC-0409-7620-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>NDC-10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys bead homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEM; N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide analyzer</td>
			<td>GE</td>
			<td>Sievers NOA 280i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>702587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys lysing kit</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000911-LYSK0-A</td>
			<td>contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulverizer kit</td>
			<td>Cellcrusher</td>
			<td>Cellcrusher kit</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements

Nitrationer (NO3-) ble en gang antatt å være inerte sluttprodukter av nitrogenoksid (NO) metabolisme. Tidligere studier har imidlertid vist at nitrationer kan omdannes tilbake til NO hos pattedyr gjennom en to-trinns reduksjonsmekanisme: nitrat reduseres til nitritt (NO2-) hovedsakelig av orale kommensale bakterier, deretter blir nitritt redusert til NO ved flere mekanismer, inkludert via heme- eller molybdenholdige proteiner. Denne reduktive nitratveien bidrar til å forbedre NO-medierte signalveier, spesielt i kardiovaskulærsystemet og under muskeløvelse. Nivåene av nitrat i kroppen før slik utnyttelse bestemmes av to forskjellige kilder: endogen NO-oksidasjon og diettnitratinntak, hovedsakelig fra planter. For å belyse den komplekse NO-syklusen under fysiologiske omstendigheter har vi undersøkt dynamikken i metabolitter, nitrat- og nitrittioner, som er relativt stabile sammenlignet med NO. I tidligere studier ble skjelettmuskulatur identifisert som et viktig lagringsorgan for nitrationer hos pattedyr, samt en direkte kilde til NO under trening. Derfor er det viktig å etablere en pålitelig metode for å måle nitrat- og nitrittnivåer i skjelettmuskulatur og bør være nyttig for å utvide applikasjonen til andre vevsprøver. Dette papiret forklarer i detalj fremstillingen av skjelettmuskelprøver, ved hjelp av tre forskjellige homogeniseringsmetoder, for nitrat- og nitrittmålinger og diskuterer viktige problemstillinger knyttet til homogeniseringsprosesser, inkludert størrelsen på prøvene. Nitrat- og nitrittkonsentrasjoner har også blitt sammenlignet på tvers av fire forskjellige muskelgrupper.

For å oppnå representative resultater ble skjelettmuskelvev fra 8 Wistar-rotter (menn og kvinner, vekt 250 ± 50 g) brukt. Rotte skjelettmuskelhomogenater (50 mg gluteus maximus muskel for hver metode) ble fremstilt av tre forskjellige homogeniseringsverktøy (roterende homogenisator, perlehomogenisator og pulverisator). Nitrat- og nitrittinnholdet i disse homogenatene ble deretter bestemt ved hjelp av en nitrogenoksidanalysator (NOA) (figur 4). Nitratnivåene (figur 4...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements at JoVE.com

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Vi presenterer protokoller for tre ulike metoder for homogenisering av fire ulike muskelgrupper av rotte skjelettmuskelvev for å måle og sammenligne nivåene av nitrat og nitritt. Videre sammenligner vi ulike utvalgsvekter for å undersøke om vevsprøvestørrelse påvirker resultatene av homogenisering.

Fremstilling av rotte skjelettmuskelhomogenater for nitrat- og nitrittmålinger

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Skjelettmuskulatur fungerer som et stort reservoar av nitrat som, etter konvertering til nitritt, tjener som en kilde til NO under trening. Her presenterer vi metodikk for å måle disse ionene i muskel og annet vev. Til å begynne med forbereder nitratkonserverings- eller stoppløsningen ved å kombinere 890 millimolært kaliumferricyanid og 118 millimolar n-metylmaleimid i destillert vann, slik at ingen krystaller forblir i oppløsning, tilsett deretter et ikke-ionisk overflateaktivt middel i forholdet 1 til 9 og bland forsiktig for å unngå skumdannelse.Fortynn stoppoppløsningen i et 1-til-9-forhold med destillert vann og tilsett den fortynnede stoppløsningen til homogeniseringsrøret. Deretter tiner du det forrige isolerte og frosne rottemuskelvevet på isen. Når vevet har tint, fjern gjenværende fett og bindevev fra skjelettmuskulaturen.Klipp av biter av skjelettmuskulaturen og flekk dem på en gasbind for å tørke. Vei ut riktig mengde skjelettmuskulaturvev, og plasser deretter det forvektige vevet i homogeniseringsrørene som inneholder stoppoppløsningen. For homogenisering i en roterende homogenisator, plasser M-type røret som inneholder den forhåndsveide skjelettmuskelen og forhåndsmålt stoppløsning i maskinen.Homogeniser hver prøve to ganger, og etter hver homogenisering, legg røret på is umiddelbart i 5 minutter for å kjøle seg ned. Etter homogenisering, sentrifuger røret kort. Legg røret tilbake på is og tilsett riktig volum metanol før vortexing I 15 sekunder.Homogeniser prøven igjen og inkuber den på is i 30 minutter, sentrifuger deretter prøven, aspirerer supernatanten og fortsetter å måle nitritt- og nitratnivåene. For perlehomogenisering, plasser skjelettmuskelvevet i et perleholdig rør og homogeniser to ganger i 45 sekunder med den høyeste hastigheten som er tilgjengelig på instrumentet. Etter hver homogenisering, legg straks røret på is i 5 minutter for å kjøle seg ned, sentrifuger deretter røret, legg røret tilbake på is, og tilsett riktig volum metanol før vortexing I 15 sekunder.Homogeniser prøven igjen i 45 sekunder, og inkuber den deretter på is i 30 minutter. Sentrifuger prøven, aspirerer supernatanten, og fortsetter å måle nitritt- og nitratnivåene. For pulverisatorbasert homogenisering, lag rør som inneholder den fortynnede stoppoppløsningen, og vei deretter og registrer vekten av rørene.Etter avkjøling av pulverisatorverktøyet på tørris i 30 minutter, bruk pinsett kjølt i flytende nitrogen, overfør den forhåndsveide vevsprøven til pulverisatoren, og tilsett deretter en liten mengde flytende nitrogen for å sikre at vevet har flytende nitrogentemperatur. Etter at 95% av det flytende nitrogenet har fordampet, plasser knuseverktøyet på toppen av vevet og trykk godt for å føle prøven knuse, og bruk deretter en hammer, slå knuseverktøyet 3 til 5 ganger. Når hele prøven er pulverisert, ved hjelp av en flytende nitrogenkjølt skje og pinsett, overfører du det knuste vevet direkte til det forveiede røret som inneholder den fortynnede stoppløsningen.Deretter virvler røret i 15 sekunder, og åpner deretter røret for å se etter vev som sitter fast i lokket. Hvis det er det, prøv å løsne det, og virvle igjen. Sentrifuger prøven kort i 2 til 3 sekunder.Vei røret igjen og beregn vevsvekten ved å trekke den opprinnelige rørvekten fra denne nye vekten. Plasser røret på is. Tilsett et passende volum metanol i røret og virvle røret grundig i 15 sekunder før du inkuberer det på is i 30 minutter, sentrifuger deretter prøven, aspirerer supernatanten og fortsetter å måle nitritt- og nitratnivåene.Nitratnivåer og rotte skjelettmuskelhomogenater fremstilt ved hjelp av en roterende homogenisator, perlehomogenisator og pulverisator var like. Interessant, for nitrittnivåer, viste homogenatprøven fremstilt av en pulverisator den høyeste verdien, som var statistisk forskjellig fra de to andre prøveverdiene. En sammenligning av nitritt- og nitratnivåer i gluteushomogenater fremstilt fra 20, 50 og 200 milligram vev ved bruk av en perlehomogenisator viste at verken nitrat- eller nitrittnivåene var signifikant forskjellige mellom muskelprøvestørrelsene.Sammenligning av nitratnivåer i forskjellige skjelettmuskelvev i gnagerben viste at gluteusmuskelen hadde omtrent to ganger høyere nitratnivåer enn de tre andre muskelvevene. Disse forskjellene nådde imidlertid ikke statistisk signifikans. I likhet med nitratnivåene var nitratkonsentrasjonen i gluteusmuskelen også høyere enn i de tre andre muskelvevene og var signifikant høyere enn i gastrocnemius-prøven.Vår metode er relativt enkel og velegnet til små prøver, samtidig som nitrat og nitritt bevares under prøveprepareringen.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-påført skade av Sebrafisk Embryonic skjelettmuskulatur

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolasjon og kultur av individuelle myofibers og deres satellitt celler fra voksne Skeletal Muscle

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolering av Blood-fartøy-avledet multipotent Forstadier fra Menneskelig Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Tissue Triage og Frysing av modeller av Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolering av Mitokondrier fra minimale mengder av Mouse Skeletal Muscle for høy gjennomstrømming Micro respirasjonsmålinger

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Måling nitritt og nitrat, metabolitter i nitrogenoksid Pathway, i biologisk materiale ved hjelp av Chemiluminescence Method

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolering av Intakt Mitokondrier fra Skeletal Muscle av differensialsentrifugering for høy oppløsning respirometri Målinger

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Identifisering, isolasjon og karakterisering av Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) og Myogenic Progenitors (MPs) i skjelettmuskulaturen i rotten

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...