Name: preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements
Uploaded: 2021-07-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements at JoVE.com

Detta arbete stöddes av intramural NIH/NIDDK-bidrag ZIA DK 0251041-14 till Alan N Schechter, MD.

Djurprotokollet godkändes av NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20). Djur hanterades och behandlades enligt den aktuella guiden för vård och användning av försöksdjur som finns fritt tillgänglig på AAALAC:s webbplats.
1. Råtta skelettmuskeluppsamling
<ol><li>Medan en råtta är under djupbedövning (5% isofluran, bekräftad av frånvarande reaktion på svans / bennypa), starta perfusion med saltlösning innehållande heparin genom att placera en 19 G nål i en topp i ...

<ol>
	<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+as+a+unique+signaling+molecule+in+the+vascular+system:+a+historical+overview.">Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), 503-514 (2002).</li><li>Moncada, S., Higgs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-arginine-nitric+oxide+pathway.">The L-arginine-nitric oxide pathway.</a> New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).</li><li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+lifetime+of+nitric+oxide:+implications+for+the+perivascular+dynamics+of+NO+and+O2.">The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics.">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).</li><li>Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+in+plasma+nitrite+after+a+dietary+nitrate+load+is+markedly+attenuated+by+an+antibacterial+mouthwash.">The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash.</a> Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).</li><li>Jansson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+functional+nitrate+reductase+that+regulates+nitrite+and+nitric+oxide+homeostasis.">A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis.</a> Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).</li><li>Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+as+a+source+of+nitrite+and+nitric+oxide+during+exercise+hyperemia+in+rat+skeletal+muscle.">Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle.</a> Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).</li><li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation.">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li><li>Shiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxymyoglobin+is+a+nitrite+reductase+that+generates+nitric+oxide+and+regulates+mitochondrial+respiration.">Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration.</a> Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).</li><li>Millar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthine+oxidoreductase+catalyses+the+reduction+of+nitrates+and+nitrite+to+nitric+oxide+under+hypoxic+conditions.">Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions.</a> FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).</li><li>Benjamin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomach+NO+synthesis.">Stomach NO synthesis.</a> Nature. 368 (6471), 502 (1994).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragastric+nitric+oxide+production+in+humans:+measurements+in+expelled+air.">Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air.</a> Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).</li><li>Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dietary+nitrate+on+blood+pressure+in+healthy+volunteers.">Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).</li><li>Kapil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+nitrate+supplementation+lowers+blood+pressure+in+humans:+role+for+nitrite-derived+NO.">Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO.</a> Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).</li><li>Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nitrate+supplementation+and+exercise+performance.">Dietary nitrate supplementation and exercise performance.</a> Sports Medicine. 44, 35-45 (2014).</li><li>Piknova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+as+an+endogenous+nitrate+reservoir.">Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir.</a> Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).</li><li>Wylie, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+nitrate+store:+influence+of+dietary+nitrate+supplementation+and+exercise.">Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise.</a> Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).</li><li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitrite+in+blood+samples+using+the+ferricyanide-based+hemoglobin+oxidation+assay.">Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay.</a> Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).</li><li>Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Nitrite+and+Nitrate,+Metabolites+in+the+Nitric+Oxide+Pathway,+in+Biological+Materials+using+the+Chemiluminescence+Method.">Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).</li><li>Nyakayiru, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+nitrate+ingestion+increases+skeletal+muscle+nitrate+content+in+humans.">Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans.</a> Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).</li><li>Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitrate+and+nitrite+in+biopsy-sized+muscle+samples+using+HPLC.">Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC.</a> Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).</li><li>Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+DNA-strand+co-segregation+and+asymmetric+cell+division+in+skeletal+muscle+stem+cells.">Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).</li><li>Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+type+differences+in+nitrate+and+nitrite+storage+and+nitric+oxide+signaling+in+rats.">Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Ohtake, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nitrite+supplementation+improves+insulin+resistance+in+type+2+diabetic+KKA(y)+mice.">Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice.</a> Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).</li></ol>

För att övervaka förändringar i NO-metaboliterna, nitrat och nitrit, som en funktion av fysiologiska ingrepp, är det absolut nödvändigt att mäta nivåerna av dessa joner i de olika organen som är kritiska i deras ämnesomsättning. Eftersom hemoglobin i blod kommer att reagera med NO och dess metaboliter är det också viktigt att snabbt ta bort blod från vävnadsprover så mycket som möjligt. Således perfuserades djur med saltlösning innan de samlade skelettmuskelvävnader (gluteus, TA, EDL, gastrocnemiusmu...

Kväveoxid (NO), en liten gasformig signalmolekyl, spelar en avgörande roll i fysiologiska och patofysiologiska processer1. NO kan framställas från L-arginin av endogena enzymer i familjen kväveoxidsyntas (NOS) innan de genomgår snabb oxidation till nitrat (NO3-) och eventuellt nitrit (NO2-) i blod och vävnader 2,3. Nyligen har dessa anjoner visat sig reduceras tillbaka till NO i däggdjurssystem4. Nitrat omvandlas till nitrit, huvudsakligen genom kommensala bakteriella nitratreduktaser i munhålan som verkar på joner som utsöndras av spottkörtlarna och direkt intas 5, och till viss del av däggdjursenzymer såsom xantinoxidoreduktas 6,7. Nitrit kan ytterligare reduceras till NO genom flera mekanismer inklusive deoxihemoglobin8, deoxymyoglobin9, molybdeninnehållande enzymer 10 och icke-enzymatisk reduktion i närvaro av protoner11,12.
Denna nitrat-nitrit-NO-väg förbättras under hypoxiska förhållanden där NOS-aktiviteten minskar eftersom NOS kräver syre för NO-generation4. Många nyligen genomförda studier har rapporterat positiva effekter av dietnitrat på blodtrycksreglering och träningsprestanda, vilket tyder på att nitratreduktionsvägar bidrar till ökningen av NO-signalering13,14,15. Tidigare studier har visat att vissa skelettmuskler sannolikt är de stora nitratlagringsplatserna i kroppen16. Jämfört med blod eller andra inre organ som lever innehåller skelettmuskulaturen (gluteus maximus) signifikant högre nitratnivåer och har en betydande massa i däggdjurskroppen. Löpbandsträning visade sig öka nitratreduktionen till nitrit och till NO i gluteus i en råtta modell7. Dessa resultat antyder att vissa skelettmuskler kan vara viktiga källor för NO genom nitratreduktionsvägar i fysiologiska situationer. Nyare studier tyder på att dessa fynd, inklusive förändringar i muskelnitratnivåer under träning, också förekommer hos människor17.
Två av de nuvarande författarna hade tidigare etablerat en metod för att mäta nitrat- och nitritnivåer i blod och andra vätskeprover18. Men när nivåerna av dessa anjoner i vävnadshomogenater initialt analyserades var detaljerade protokoll inte tillgängliga. För att förstå nitrat-nitrit-NO-dynamiken i flera olika organ var vårt mål att utveckla en exakt och effektiv metod för att mäta nitrat- och nitritnivåer i däggdjursvävnader inklusive skelettmuskulatur. I tidigare studier användes gnagarvävnader för att utveckla tillförlitliga homogeniseringsprocesser och sedan analysera nitrat- och nitritinnehåll i dessa homogenater 7,16,19. Användningen av denna homogeniseringsmetod utvidgades till humana skelettmuskelbiopsiprover, varigenom värdena bekräftades, och viktigare, de värden som observerades för muskler jämfört med blod / plasma var i liknande intervall och förhållanden som de som observerades hos gnagare17. Under de senaste åren har andra grupper också börjat mäta nitrat- och nitritnivåer i skelettmuskelhomogenater och rapporterat jämförbara värden med de som rapporterats av vår grupp20,21.
Syftet med detta protokollpapper är att i detalj beskriva beredningen av skelettmuskelhomogenater med hjälp av tre olika homogeniseringsmetoder för efterföljande mätning av nitrat- och nitritnivåer. Dessutom undersöktes effekterna av vävnadsvikt som används för homogenisering på värden av nitrat och nitrit i skelettmuskelprover. Vi tror att dessa metoder lätt kan tillämpas på andra typer av däggdjursvävnader. På senare tid, särskilt inom träningsfysiologi, hade man uppmärksammat de möjliga skillnaderna i nitrat/nitrit/NO-fysiologi beroende på muskelgrupper. Vi rapporterar också mängderna nitrat och nitrit i fyra olika gnagarmuskler och hittar en icke-enhetlig fördelning av båda jonerna mellan dessa olika muskler; en observation som kräver ytterligare studier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>gentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentle MACS M tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td>Length: 87 mm; Diameter: 30 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC-0409-7620-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>NDC-10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys bead homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEM; N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide analyzer</td>
			<td>GE</td>
			<td>Sievers NOA 280i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>702587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys lysing kit</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000911-LYSK0-A</td>
			<td>contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulverizer kit</td>
			<td>Cellcrusher</td>
			<td>Cellcrusher kit</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements

Nitratjoner (NO3-) ansågs en gång vara inerta slutprodukter av kväveoxidmetabolism (NO). Tidigare studier visade dock att nitratjoner kan omvandlas tillbaka till NO hos däggdjur genom en tvåstegsreduktionsmekanism: nitrat reduceras till nitrit (NO2-) mestadels av orala kommensala bakterier, sedan reduceras nitrit till NO genom flera mekanismer inklusive via hem- eller molybdeninnehållande proteiner. Denna reduktiva nitratväg bidrar till att förbättra NO-medierade signalvägar, särskilt i hjärt-kärlsystemet och under muskelträning. Nitrathalterna i kroppen före sådan användning bestäms av två olika källor: endogen NO-oxidation och nitratintag via kosten, huvudsakligen från växter. För att belysa den komplexa NO-cykeln under fysiologiska omständigheter har vi undersökt vidare dynamiken i dess metaboliter, nitrat- och nitritjoner, som är relativt stabila jämfört med NO. I tidigare studier identifierades skelettmuskulaturen som ett viktigt lagringsorgan för nitratjoner hos däggdjur, samt en direkt källa till NO under träning. Därför är det viktigt att fastställa en tillförlitlig metod för att mäta nitrat- och nitritnivåer i skelettmuskulaturen och bör vara till hjälp för att utvidga dess tillämpning till andra vävnadsprover. Detta dokument förklarar i detalj beredningen av skelettmuskelprover, med hjälp av tre olika homogeniseringsmetoder, för nitrat- och nitritmätningar och diskuterar viktiga frågor relaterade till homogeniseringsprocesser, inklusive provernas storlek. Nitrat- och nitritkoncentrationer har också jämförts mellan fyra olika muskelgrupper.

För att få representativa resultat användes skelettmuskelvävnader från 8 Wistar-råttor (män och kvinnor, vikt 250 ± 50 g). Råttors skelettmuskelhomogenater (50 mg gluteus maximus-muskel för varje metod) framställdes av tre olika homogeniseringsverktyg (roterande homogenisator, pärlhomogenisator och pulveriserare). Nitrat- och nitrithalten i dessa homogenater bestämdes sedan med användning av en kväveoxidanalysator (NOA) (figur 4). Nitrathalterna (figur 4A<...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements at JoVE.com

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Vi presenterar protokoll för tre olika metoder för homogenisering av fyra olika muskelgrupper i råttskelettmuskelvävnad för att mäta och jämföra nivåerna av nitrat och nitrit. Vidare jämför vi olika provvikter för att undersöka om vävnadsprovets storlek påverkar resultaten av homogenisering.

Beredning av råttors skelettmuskelhomogenater för nitrat- och nitritmätningar

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Skelettmuskeln fungerar som en stor reservoar av nitrat som, efter omvandling till nitrit, fungerar som en källa till NO under träning. Här presenterar vi metodik för att mäta dessa joner i muskler och andra vävnader. För att börja, förbered nitratkonserverings- eller stopplösningen genom att kombinera 890 millimolar kaliumferricyanid och 118 millimolar n-metylmaleimid i destillerat vatten, se till att inga kristaller förblir i lösning, tillsätt sedan ett icke-joniskt ytaktivt medel i ett förhållande 1-till-9 och blanda försiktigt för att undvika skumning.Späd stopplösningen i ett förhållande 1 till 9 med destillerat vatten och tillsätt den utspädda stopplösningen till homogeniseringsröret. Därefter tina den tidigare isolerade och frusna råttmuskelvävnaden på is. När vävnaden har tinat, ta bort det återstående fettet och bindväven från skelettmuskeln.Skär av bitar av skelettmuskeln och blotta dem på en gasväv för att torka. Väg ut lämplig mängd skelettmuskelvävnad och placera sedan vävnaden före vikt i homogeniseringsrören som innehåller stopplösningen. För homogenisering i en roterande homogenisator, placera röret av M-typ som innehåller den förvägda skelettmuskeln och den förmätta stopplösningen i maskinen.Homogenisera varje prov två gånger, och efter varje homogenisering, placera röret på is omedelbart i 5 minuter för att svalna. Efter homogenisering, centrifugera röret kort. Lägg tillbaka röret på is och tillsätt lämplig volym metanol innan du virvlar i 15 sekunder.Homogenisera provet igen och inkubera det på is i 30 minuter, centrifugera sedan provet, aspirera supernatanten och fortsätt att mäta nitrit- och nitratnivåerna. För pärlhomogenisering, placera skelettmuskelvävnaden i ett pärlinnehållande rör och homogenisera två gånger i 45 sekunder med den högsta hastighet som finns på instrumentet. Efter varje homogenisering, placera omedelbart röret på is i 5 minuter för att svalna, centrifugera sedan röret, placera röret tillbaka på is och tillsätt lämplig volym metanol innan du virvlar i 15 sekunder.Homogenisera provet en gång till i 45 sekunder och inkubera det sedan på is i 30 minuter. Centrifugera provet, aspirera supernatanten och fortsätt att mäta nitrit- och nitratnivåerna. För pulveriseringsbaserad homogenisering, förbered rör som innehåller den utspädda stopplösningen, väg sedan och registrera rörens vikt.Efter kylning av pulveriseringsverktyget på torris i 30 minuter, använd pincett kyld i flytande kväve, överför det förvägda vävnadsprovet till pulveriseraren och tillsätt sedan en liten mängd flytande kväve för att säkerställa att vävnaden har flytande kvävetemperatur. När 95% av det flytande kvävet har förångats, placera krossverktyget ovanpå vävnaden och tryck ordentligt för att känna provkrossningen, använd sedan en klubba, slå krossverktyget 3 till 5 gånger. När hela provet har pulveriserats med hjälp av en flytande kvävekyld sked och pincett, överförs den krossade vävnaden direkt till det förvägda röret som innehåller den utspädda stopplösningen.Virvla sedan röret i 15 sekunder och öppna sedan röret för att kontrollera om det finns någon vävnad som sitter fast i locket. Om det finns, försök att lossa det, sedan virvla igen. Centrifugera provet kort i 2 till 3 sekunder.Väg röret igen och beräkna vävnadsvikten genom att dra av den ursprungliga rörvikten från denna nya vikt. Placera röret på is. Tillsätt en lämplig volym metanol i röret och virvla röret noggrant i 15 sekunder innan du inkuberar det på is i 30 minuter, centrifugera sedan provet, aspirera supernatanten och fortsätt att mäta nitrit- och nitratnivåerna.Nitratnivåer och råttors skelettmuskelhomogenater framställda med användning av en roterande homogenisator, pärlhomogenisator och pulveriserare var likartade. Intressant nog, för nitritnivåer, visade homogenatprovet framställt av en pulveriserare det högsta värdet, vilket statistiskt skilde sig från de andra två provvärdena. En jämförelse av nitrit- och nitrathalter i gluteushomogenater framställda från 20, 50 och 200 milligram vävnad med användning av en pärlhomogenisator visade att varken nitrat- eller nitritnivåerna skilde sig signifikant mellan muskelprovstorlekarna.Att jämföra nitratnivåer i olika gnagarbenskelettmuskelvävnader avslöjade att gluteusmuskeln hade ungefär dubbelt högre nitratnivåer än de andra tre muskelvävnaderna. Dessa skillnader nådde emellertid inte statistisk signifikans. I likhet med nitratnivåerna var nitratkoncentrationen i gluteusmuskeln också högre än i de andra tre muskelvävnaderna och var signifikant högre än i gastrocnemiusprovet.Vår metod är relativt enkel och väl lämpad för små prover samtidigt som nitrat och nitrit bevaras under provberedningen.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulta och embryonala skelettmuskler Microexplant Kultur och Isolering av skelettet muskelceller Stem

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Förfaranden för råtta<em&gt; In situ</em&gt; Skelettmuskulaturen Kontraktila egenskaper

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-vållad skada av Zebrafish embryonala skelettmuskulatur

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolering och odling av individuella Myofibers och deras satellit celler från vuxna skelettmuskulatur

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolering av blod-kärl-härledda multi prekursorer från Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Vävnads Triage och frysning efter Modeller av skelettmuskulatur Sjukdom

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolering av mitokondrier från minimala kvantiteter av mus skelettmuskulatur för hög genomströmning Microandnings Mätningar

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Mätning nitrit och nitrat, metaboliter i kväveoxid Pathway, i biologiskt material med hjälp av kemiluminescens metod

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolering av Intakt Mitokondrier från skelettmuskulatur genom differentialcentrifugering för Högupplösta respirometri Mätningar

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Identifiering, isolering och karakterisering av fibroadiogena stamceller (FAPs) och myogena stamceller (MPs) i skelettmuskulaturen i råttan

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...