Name: preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements
Uploaded: 2021-07-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements at JoVE.com

Bu çalışma, Alan N Schechter, MD'ye intramural NIH / NIDDK hibe ZIA DK 0251041-14 tarafından desteklenmiştir.

Hayvan protokolü NIDDK Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (ASP K049-MMB-20) tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar, AAALAC web sitesinde ücretsiz olarak bulunan mevcut Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna göre ele alınmış ve tedavi edilmiştir.
1. Sıçan iskelet kası toplama
<ol><li>Bir sıçan derin anestezi altındayken (% 5 izofluran, kuyruk / bacak sıkışmasına reaksiyon olmadan doğrulanır), sol ventrikülün tepesine 19 G'lik bir iğne yerleşti...

<ol>
	<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+as+a+unique+signaling+molecule+in+the+vascular+system:+a+historical+overview.">Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), 503-514 (2002).</li><li>Moncada, S., Higgs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-arginine-nitric+oxide+pathway.">The L-arginine-nitric oxide pathway.</a> New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).</li><li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+lifetime+of+nitric+oxide:+implications+for+the+perivascular+dynamics+of+NO+and+O2.">The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics.">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).</li><li>Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+in+plasma+nitrite+after+a+dietary+nitrate+load+is+markedly+attenuated+by+an+antibacterial+mouthwash.">The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash.</a> Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).</li><li>Jansson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+functional+nitrate+reductase+that+regulates+nitrite+and+nitric+oxide+homeostasis.">A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis.</a> Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).</li><li>Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+as+a+source+of+nitrite+and+nitric+oxide+during+exercise+hyperemia+in+rat+skeletal+muscle.">Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle.</a> Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).</li><li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation.">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li><li>Shiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxymyoglobin+is+a+nitrite+reductase+that+generates+nitric+oxide+and+regulates+mitochondrial+respiration.">Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration.</a> Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).</li><li>Millar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthine+oxidoreductase+catalyses+the+reduction+of+nitrates+and+nitrite+to+nitric+oxide+under+hypoxic+conditions.">Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions.</a> FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).</li><li>Benjamin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomach+NO+synthesis.">Stomach NO synthesis.</a> Nature. 368 (6471), 502 (1994).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragastric+nitric+oxide+production+in+humans:+measurements+in+expelled+air.">Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air.</a> Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).</li><li>Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dietary+nitrate+on+blood+pressure+in+healthy+volunteers.">Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).</li><li>Kapil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+nitrate+supplementation+lowers+blood+pressure+in+humans:+role+for+nitrite-derived+NO.">Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO.</a> Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).</li><li>Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nitrate+supplementation+and+exercise+performance.">Dietary nitrate supplementation and exercise performance.</a> Sports Medicine. 44, 35-45 (2014).</li><li>Piknova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+as+an+endogenous+nitrate+reservoir.">Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir.</a> Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).</li><li>Wylie, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+nitrate+store:+influence+of+dietary+nitrate+supplementation+and+exercise.">Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise.</a> Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).</li><li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitrite+in+blood+samples+using+the+ferricyanide-based+hemoglobin+oxidation+assay.">Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay.</a> Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).</li><li>Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Nitrite+and+Nitrate,+Metabolites+in+the+Nitric+Oxide+Pathway,+in+Biological+Materials+using+the+Chemiluminescence+Method.">Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).</li><li>Nyakayiru, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+nitrate+ingestion+increases+skeletal+muscle+nitrate+content+in+humans.">Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans.</a> Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).</li><li>Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nitrate+and+nitrite+in+biopsy-sized+muscle+samples+using+HPLC.">Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC.</a> Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).</li><li>Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+DNA-strand+co-segregation+and+asymmetric+cell+division+in+skeletal+muscle+stem+cells.">Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).</li><li>Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+type+differences+in+nitrate+and+nitrite+storage+and+nitric+oxide+signaling+in+rats.">Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Ohtake, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nitrite+supplementation+improves+insulin+resistance+in+type+2+diabetic+KKA(y)+mice.">Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice.</a> Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).</li></ol>

NO metabolitleri, nitrat ve nitritteki değişiklikleri izlemek için, fizyolojik müdahalelerin bir fonksiyonu olarak, bu iyonların metabolizmalarında kritik olan farklı organlardaki seviyelerini ölçmek zorunludur. Kandaki hemoglobin NO ve metabolitleri ile reaksiyona gireceğinden, kanı doku örneklerinden mümkün olduğunca hızlı bir şekilde çıkarmak da önemlidir. Böylece iskelet kas dokuları (gluteus, TA, EDL, gastroknemius kası) toplanmadan önce hayvanlar salin ile perfüze edildi ve hedef kas etraf...

Küçük bir gaz halindeki sinyal molekülü olan nitrik oksit (NO), fizyolojik ve patofizyolojik süreçlerde kritik bir rol oynar1. NO, nitrik oksit sentaz (NOS) ailesinin endojen enzimleri tarafından L-arginin'den, nitrata (NO 3-) ve muhtemelen kandaki ve dokulardaki nitrite (NO 2-) hızlı oksidasyona uğramadan önce üretilebilir 2,3. Son zamanlarda, bu anyonların memeli sistemlerinde NO'ya geri indirgendiği gösterilmiştir4. Nitrat, esas olarak tükürük bezleri tarafından salgılanan ve doğrudan yutulan iyonlara etki eden ağız boşluğundaki kommensal bakteriyel nitrat redüktazları tarafından nitrite dönüştürülür 5 ve bir dereceye kadar ksantin oksidoredüktaz 6,7 gibi memeli enzimleri tarafından. Nitrit, deoksihemoglobin8, deoksimiyoglobin9, molibden içeren enzimler10 ve proton 11,12 varlığında enzimatik olmayan indirgeme dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalarla NO'ya daha da indirgenebilir.
Bu nitrat-nitrit-NO yolu, NOS aktivitesinin azaldığı hipoksik koşullar altında geliştirilir, çünkü NOS NO nesil4 için oksijen gerektirir. Son zamanlarda yapılan birçok çalışma, diyet nitratının kan basıncı regülasyonu ve egzersiz performansı üzerindeki yararlı etkilerini bildirmiştir, bu da nitrat azaltma yollarının NO sinyalinin 13,14,15'in artmasına katkıda bulunduğunu düşündürmektedir. Önceki çalışmalar, bazı iskelet kaslarının muhtemelen vücuttaki başlıca nitrat depolama yerleri olduğunu göstermiştir16. Kan veya karaciğer gibi diğer iç organlarla karşılaştırıldığında, iskelet kası (gluteus maximus) önemli ölçüde daha yüksek nitrat seviyeleri içerir ve memeli vücudunda önemli bir kütleye sahiptir. Koşu bandı egzersizinin, bir sıçan modeli7'de nitrite ve gluteustaki NO'ya nitrat indirgemesini arttırdığı gösterilmiştir. Bu sonuçlar, bazı iskelet kaslarının fizyolojik durumlarda nitrat indirgeme yolları yoluyla NO için önemli kaynaklar olabileceğini düşündürmektedir. Daha yeni çalışmalar, egzersiz sırasında kas nitrat seviyelerindeki değişiklikler de dahil olmak üzere bu bulguların insanlarda da meydana geldiğini göstermektedir17.
Mevcut yazarlardan ikisi daha önce kan ve diğer sıvı numunelerdeki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek için bir yöntem oluşturmuştu18. Bununla birlikte, bu anyonların doku homojenatlarındaki seviyeleri başlangıçta analiz edildiğinde, ayrıntılı protokoller mevcut değildi. Birkaç farklı organdaki nitrat-nitrit-NO dinamiklerini anlamak için amacımız, iskelet kası da dahil olmak üzere memeli dokularındaki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek için doğru ve verimli bir yöntem geliştirmekti. Daha önceki çalışmalarda, güvenilir homojenizasyon prosesleri geliştirmek ve daha sonra bu homojenatlardaki nitrat ve nitrit içeriğini analiz etmek için kemirgen dokuları kullanıldı 7,16,19. Bu homojenizasyon yönteminin kullanımı, değerlerin doğrulandığı insan iskelet kası biyopsi örneklerine genişletildi ve daha da önemlisi, kas için kan / plazmaya kıyasla gözlemlenen değerler, kemirgenlerde gözlenenlere benzer aralıklarda ve oranlarda idi17. Son yıllarda, diğer gruplar da iskelet kası homojenatlarındaki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmeye başladı ve grubumuz20,21 tarafından bildirilenlerle karşılaştırılabilir değerler bildirdi.
Bu protokol belgesinin amacı, nitrat ve nitrit seviyelerinin daha sonraki ölçümleri için üç farklı homojenizasyon yöntemi kullanılarak iskelet kası homojenatlarının hazırlanmasını ayrıntılı olarak tanımlamaktır. Ayrıca homojenizasyon için kullanılan doku ağırlığının iskelet kası örneklerinde nitrat ve nitrit değerleri üzerindeki etkileri incelenmiştir. Bu yöntemlerin diğer memeli dokularına da rahatlıkla uygulanabileceğine inanıyoruz. Son yıllarda özellikle egzersiz fizyolojisi alanında kas gruplarına göre nitrat/nitrit/NO fizyolojisindeki olası farklılıklara dikkat çekilmiştir. Ayrıca dört farklı kemirgen kasındaki nitrat ve nitrit miktarlarını rapor ediyoruz ve her iki iyonun da bu farklı kaslar arasında eşit olmayan bir dağılımını buluyoruz; daha fazla çalışma gerektiren bir gözlem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>gentleMACS dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentle MACS M tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td>Length: 87 mm; Diameter: 30 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC-0409-7620-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>NDC-10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys bead homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEM; N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide analyzer</td>
			<td>GE</td>
			<td>Sievers NOA 280i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>702587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys lysing kit</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000911-LYSK0-A</td>
			<td>contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulverizer kit</td>
			<td>Cellcrusher</td>
			<td>Cellcrusher kit</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements

Nitrat iyonlarının (NO3-) bir zamanlar nitrik oksit (NO) metabolizmasının inert son ürünleri olduğu düşünülüyordu. Bununla birlikte, önceki çalışmalar, nitrat iyonlarının memelilerde iki aşamalı bir indirgeme mekanizması ile NO'ya geri dönüştürülebileceğini göstermiştir: nitrat, çoğunlukla oral kommensal bakteriler tarafından nitrite (NO2-) indirgenir, daha sonra nitrit, heme veya molibden içeren proteinler de dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar tarafından NO'ya indirgenir. Bu indirgeyici nitrat yolu, özellikle kardiyovasküler sistemde ve kas egzersizi sırasında NO-aracılı sinyal yolaklarının geliştirilmesine katkıda bulunur. Bu tür bir kullanımdan önce vücuttaki nitrat seviyeleri iki farklı kaynak tarafından belirlenir: endojen NO oksidasyonu ve diyet nitrat alımı, esas olarak bitkilerden. Fizyolojik koşullarda karmaşık NO döngüsünü aydınlatmak için, NO'ya kıyasla nispeten kararlı olan metabolitlerinin, nitrat ve nitrit iyonlarının dinamiklerini daha fazla inceledik. Önceki çalışmalarda iskelet kası, memelilerde nitrat iyonları için önemli bir depolama organı ve egzersiz sırasında doğrudan bir NO kaynağı olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, iskelet kasındaki nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek için güvenilir bir metodoloji oluşturmak önemlidir ve uygulamasının diğer doku örneklerine genişletilmesinde yardımcı olmalıdır. Bu yazıda, nitrat ve nitrit ölçümleri için üç farklı homojenizasyon yöntemi kullanılarak iskelet kası numunelerinin hazırlanması ayrıntılı olarak açıklanmakta ve numunelerin büyüklüğü de dahil olmak üzere homojenizasyon prosesleri ile ilgili önemli konular tartışılmaktadır. Nitrat ve nitrit konsantrasyonları da dört farklı kas grubunda karşılaştırılmıştır.

Temsili sonuçlar elde etmek için, 8 Wistar sıçanından (erkek ve dişiler, ağırlık 250 ± 50 g) iskelet kası dokuları kullanılmıştır. Sıçan iskelet kası homojenatları (her yöntem için 50 mg gluteus maximus kası) üç farklı homojenizasyon aracı (döner homojenizatör, boncuk homojenizatörü ve pulverizatör) ile hazırlanmıştır. Bu homojenatların nitrat ve nitrit içerikleri daha sonra bir nitrik oksit analizörü (NOA) kullanılarak belirlendi (Şekil 4). Bu üç ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements at JoVE.com

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek ve karşılaştırmak için sıçan iskelet kası dokusunun dört farklı kas grubunun homojenizasyonu için üç farklı yöntem için protokoller sunuyoruz. Ayrıca, doku numune büyüklüğünün homojenizasyon sonuçlarını etkileyip etkilemediğini araştırmak için farklı numune ağırlıklarını karşılaştırıyoruz.

Nitrat ve Nitrit Ölçümleri için Sıçan İskelet Kas Homojenatlarının Hazırlanması

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

İskelet kası, nitrite dönüştürülmesinden sonra, egzersiz sırasında bir NO kaynağı olarak hizmet eden önemli bir nitrat rezervuarı görevi görür. Burada kas ve diğer dokulardaki bu iyonları ölçmek için metodoloji sunuyoruz. Başlamak için, 890 milimolar potasyum ferrisiyanür ve 118 milimolar n-metilmaleimid damıtılmış suda birleştirerek nitrat koruyucu veya durdurma çözeltisini hazırlayın, çözelti içinde kristal kalmamasını sağlayın, ardından 1-9 oranında iyonik olmayan bir yüzey aktif madde ekleyin ve köpüklenmeyi önlemek için hafifçe karıştırın.Durdurma çözeltisini damıtılmış su ile 1'e 9 oranında seyreltin ve seyreltilmiş durdurma çözeltisini homojenizasyon tüpüne ekleyin. Daha sonra, önceki izole edilmiş ve donmuş sıçan kas dokusunu buz üzerinde çözün. Doku çözüldükten sonra, kalan yağ ve bağ dokusunu iskelet kasından çıkarın.İskelet kasının parçalarını kesin ve kuruması için bir gazlı bez üzerinde lekeleyin. Uygun miktarda iskelet kası dokusunu tartın, ardından ağırlık öncesi dokuyu durdurma çözeltisini içeren homojenizasyon tüplerine yerleştirin. Döner homojenizatörde homojenizasyon için, önceden tartılmış iskelet kasını ve önceden ölçülmüş durdurma çözeltisini içeren M tipi tüpü makineye yerleştirin.Her numuneyi iki kez homojenize edin ve her homojenizasyondan sonra, soğuması için tüpü hemen 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Homojenizasyondan sonra, tüpü kısaca santrifüj edin. Tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin ve 15 saniye boyunca vortekslemeden önce uygun miktarda metanol ekleyin.Numuneyi tekrar homojenize edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin, ardından numuneyi santrifüj edin, süpernatanı aspire edin ve nitrit ve nitrat seviyelerini ölçmeye devam edin. Boncuk homojenizasyonu için, iskelet kası dokusunu boncuk içeren bir tüpe yerleştirin ve cihazda bulunan en yüksek hızda 45 saniye boyunca iki kez homojenize edin. Her homojenizasyondan sonra, tüpü soğuması için hemen 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin, ardından tüpü santrifüj edin, tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin ve vorteksten önce 15 saniye boyunca uygun miktarda metanol ekleyin.Numuneyi 45 saniye boyunca bir kez daha homojenize edin, ardından 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Numuneyi santrifüj edin, süpernatanı aspire edin ve nitrit ve nitrat seviyelerini ölçmeye devam edin. Pulverizatör bazlı homojenizasyon için, seyreltilmiş durdurma çözeltisini içeren tüpler hazırlayın, ardından tüplerin ağırlığını tartın ve kaydedin.Öğütücü aletini kuru buz üzerinde 30 dakika soğuttuktan sonra, sıvı azotla soğutulmuş cımbız kullanarak, önceden tartılmış doku örneğini pulverizatöre aktarın, ardından dokunun sıvı azot sıcaklığında olmasını sağlamak için az miktarda sıvı azot ekleyin. Sıvı azotun% 95'i buharlaştıktan sonra, kırma aletini dokunun üstüne yerleştirin ve numunenin ezildiğini hissetmek için sıkıca bastırın, ardından bir tokmak kullanarak kırma aletine 3 ila 5 kez vurun. Tüm numune toz haline getirildiğinde, sıvı azot soğutmalı bir kaşık ve cımbız kullanarak, ezilmiş dokuyu doğrudan seyreltilmiş durdurma çözeltisini içeren önceden tartılmış tüpe aktarın.Ardından, tüpü 15 saniye boyunca vorteksleyin, ardından kapağa sıkışmış herhangi bir doku olup olmadığını kontrol etmek için tüpü açın. Varsa, yerinden çıkarmayı deneyin, sonra tekrar vorteks. Numuneyi 2 ila 3 saniye boyunca kısaca santrifüj edin.Tüpü tekrar tartın ve orijinal tüp ağırlığını bu yeni ağırlıktan düşerek doku ağırlığını hesaplayın. Tüpü buzun üzerine yerleştirin. Tüpe uygun miktarda metanol ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe etmeden önce tüpü 15 saniye boyunca iyice vorteksleyin, ardından numuneyi santrifüj edin, süpernatanı aspire edin ve nitrit ve nitrat seviyelerini ölçmeye devam edin.Döner homojenizatör, boncuk homojenizatörü ve öğütücü kullanılarak hazırlanan nitrat seviyeleri ve sıçan iskelet kası homojenatları benzerdi. İlginç bir şekilde, nitrit seviyeleri için, bir öğütücü tarafından hazırlanan homojenat numunesi, diğer iki numune değerinden istatistiksel olarak farklı olan en yüksek değeri gösterdi. Bir boncuk homojenizatörü kullanılarak 20, 50 ve 200 miligram dokudan hazırlanan gluteus homojenatlarındaki nitrit ve nitrat seviyelerinin karşılaştırılması, ne nitrat ne de nitrit seviyelerinin kas numune boyutları arasında anlamlı derecede farklı olmadığını göstermiştir.Farklı kemirgen bacak iskelet kas dokularındaki nitrat seviyelerinin karşılaştırılması, gluteus kasının diğer üç kas dokusundan yaklaşık iki kat daha yüksek nitrat seviyelerine sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bununla birlikte, bu farklılıklar istatistiksel anlamlılığa ulaşmamıştır. Nitrat seviyelerine benzer şekilde, gluteus kasındaki nitrat konsantrasyonu da diğer üç kas dokusundakinden daha yüksekti ve gastroknemius örneğindekinden anlamlı derecede yüksekti.Yöntemimiz nispeten basittir ve numune hazırlama sırasında nitrat ve nitriti korurken küçük numuneler için çok uygundur.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Rat Prosedürleri<em&gt; In situ</em&gt; İskelet Kası Kontraktil Özellikleri

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Zebra balığı Embriyonik İskelet Kası Lazer-yaralama

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Doku Triyaj ve İskelet Kası Hastalıkları Modeller için Donma

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Kemilüminesans Yöntemi kullanılarak biyolojik Malzemeleri, Nitrik Oksit Yolu&#39;ndaki nitrit ve nitrat, Metabolitler Ölçme

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Sıçandaki İskelet Kasında Fibro-Adipojenik Progenitörlerin (FAP' ler) ve Miyojenik Progenitörlerin (Milletvekilleri) Tanımlanması, İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...