Name: size exclusion chromatography to analyze bacterial outer membrane vesicle heterogeneity
Uploaded: 2021-03-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Size Exclusion Chromatography to Analyze Bacterial Outer Membrane Vesicle Heterogeneity at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (1554417) والمعاهد الوطنية للصحة (DE027769).

1. إعداد المخازن المؤقتة
<ol><li>لإعداد العازلة غسل ELISA، إضافة 3.94 غرام تريس قاعدة، 8.77 غرام NaCl، و 1 غرام ألبوم مصل البقري (BSA) إلى 1 لتر من الماء deionized (DI). إضافة 500 ميكرولتر بوليسوربات-20. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام HCl أو NaOH.</li>
	<li>لإعداد المخزن المؤقت للحجب، أضف 3.94 غرام من قاعدة Tris و8.77 g NaCl و10 g BSA. ?...

<ol>
	<li>Kuehn, M. J., Kesty, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+and+the+host-pathogen+interaction.">Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction.</a> Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).</li><li>Kulp, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+functions+and+biogenesis+of+secreted+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles.</a> Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).</li><li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin.">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li><li>Nice, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+leukotoxin+is+delivered+to+host+cells+in+an+LFA-1-independent+manner+when+associated+with+outer+membrane+vesicles.">Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles.</a> Toxins. 10 (10), 414 (2018).</li><li>Haurat, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+sorting+of+cargo+proteins+into+bacterial+membrane+vesicles.">Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).</li><li>Horstman, A. L., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterotoxigenic+Escherichia+coli+secretes+active+heat-labile+enterotoxin+via+outer+membrane+vesicles.">Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (17), 12489-12496 (2000).</li><li>Wai, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle-mediated+export+and+assembly+of+pore-forming+oligomers+of+the+Enterobacterial+ClyA+cytotoxin.">Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the Enterobacterial ClyA cytotoxin.</a> Cell. 115, 25-35 (2003).</li><li>Balsalobre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+the+Type+I+secreted+&#945;-haemolysin+via+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli.">Release of the Type I secreted &#945;-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli.</a> Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).</li><li>Donato, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Bordetella+pertussis+adenylate+cyclase+toxin+to+target+cells+via+outer+membrane+vesicles.">Delivery of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to target cells via outer membrane vesicles.</a> FEBS Letters. 586, 459-465 (2012).</li><li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+of+Vibrio+vulnificus+deliver+cytolysin-hemolysin+VvhA+into+epithelial+cells+to+induce+cytotoxicity.">Outer membrane vesicles of Vibrio vulnificus deliver cytolysin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 399, 607-612 (2010).</li><li>Maldonado, R., Wei, R., Kachlany, S. C., Kazi, M., Balashova, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+effects+of+Kingella+kingae+outer+membrane+vesicles+on+human+cells.">Cytotoxic effects of Kingella kingae outer membrane vesicles on human cells.</a> Microbial Pathogenesis. 51 (1-2), 22-30 (2011).</li><li>Turner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+outer+membrane+vesicle+size+determines+their+mechanisms+of+host+cell+entry+and+protein+content.">Helicobacter pylori outer membrane vesicle size determines their mechanisms of host cell entry and protein content.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1466 (2018).</li><li>Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+growth+stage+determines+the+size,+protein+composition,+and+preferential+cargo+packaging+of+outer+membrane+vesicles.">Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles.</a> Proteomics. 19 (1-2), 1800209 (2019).</li><li>Rompikuntal, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear+localization+of+internalized+outer+membrane+vesicles+carrying+active+cytolethal+distending+toxin+from+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans.">Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans.</a> Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).</li><li>Nice, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+leukotoxin+is+delivered+to+host+cells+in+an+LFA-1-independent+manner+when+associated+with+outer+membrane+vesicles.">Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles.</a> Toxins. 10 (10), 414 (2018).</li><li>Stevenson, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+outer+membrane+vesicles+displaying+conserved+surface+polysaccharide+antigen+elicits+broadly+antimicrobial+antibodies.">Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).</li><li>Gujrati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+as+cell-specific+drug-delivery+vehicles+for+cancer+therapy.">Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy.</a> ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+nanoantibiotics+using+an+outer+membrane+vesicle-based+drug+efflux+mechanism.">Development of novel nanoantibiotics using an outer membrane vesicle-based drug efflux mechanism.</a> Journal of Controlled Release. 317, 1-22 (2020).</li><li>Chen, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+foreign+antigens+by+engineered+outer+membrane+vesicle+vaccines.">Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+displaying+engineered+glycotopes+elicit+protective+antibodies.">Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).</li><li>Singorenko, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+A+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies.">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Science Reports. 7 (1), 15297 (2017).</li><li>Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+functionality+of+extracellular+vesicles+isolated+using+size-exclusion+chromatography+compared+to+ultracentrifugation.">Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation.</a> Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).</li><li>Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+immunological+characterization+of+the+domain+of+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+leukotoxin+that+determines+its+specificity+for+human+target+cells.">Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).</li><li>Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigallocatechin+gallate+inhibits+leukotoxin+release+by+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+by+promoting+association+with+the+bacterial+membrane.">Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane.</a> Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).</li><li>Klimentov&#225;, J., Stul&#237;k, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolation+and+purification+of+outer+membrane+vesicles+from+gram-negative+bacteria.">Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria.</a> Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).</li><li>Mongui&#243;-Tortajada, M., G&#225;lvez-Mont&#243;n, C., Bayes-Genis, A., Roura, S., Borr&#224;s, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+isolation+methods:+rising+impact+of+size-exclusion+chromatography.">Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (12), 2369-2382 (2019).</li></ol>

هنا ، قدمنا بروتوكولا للفصل البسيط والسريع والتكرار بين الخلايا الفرعية البكتيرية OMV. على الرغم من أن هذه التقنية مستقيمة نسبيا إلى الأمام، هناك بعض الخطوات التي يجب تنفيذها بعناية فائقة لضمان حدوث فصل فعال في العمود. أولا، من الضروري أن يتم تحميل الجل في العمود بعناية وببطء لتجنب فقاعات ?...

البكتيريا السلبية الغرام إطلاق الحويصلات المستمدة من الغشاء الخارجي، ما يسمى الحويصلات الغشاء الخارجي (OMVs)، في جميع أنحاء النمو. هذه OMVs تلعب أدوارا هامة في الاتصالات بين الخلايا، سواء بين البكتيريا والمضيف وكذلك بين الخلايا البكتيرية، من خلال حمل عدد من الجزيئات الحيوية الهامة، بما في ذلك الحمض النووي / الحمض النووي الريبي، والبروتينات، والدهون، وpeptidoglycans1،2. على وجه الخصوص ، تم دراسة دور OMVs في الإمراض البكتيري على نطاق واسع بسبب تخصيبها في بعض عوامل الفوعة والسموم3و4و5و6و7و8و9و10و11.
وقد تم الإبلاغ عن OMVs لتتراوح في الحجم من 20 إلى 450 نانومتر، اعتمادا على البكتيريا الأم ومرحلة النمو، مع عدة أنواع من البكتيريا الإفراج عن OMVs غير متجانسة الحجم8،12،13،14،والتي تختلف أيضا في تكوين البروتين وآلية دخول الخلية المضيفة12. H. pylori صدر OMVs تتراوح في القطر من 20 إلى 450 نانومتر، مع OMVs أصغر تحتوي على تكوين البروتين أكثر تجانسا من OMVs أكبر. الأهم من ذلك، لوحظ أن اثنين من السكان من OMVs أن استيعابها من قبل الخلايا المضيفة عن طريق آليات مختلفة12. وبالإضافة إلى ذلك، أثبتنا أن Aggregatibacter actinomycetemcomitans تطلق مجموعة من OMVs صغيرة (<150 نانومتر) جنبا إلى جنب مع مجموعة كبيرة (>350 نانومتر) OMVs، مع OMVs تحتوي على كمية كبيرة من السم البروتين يفرز، leukotoxin (LtxA)15. في حين أن دور عدم التجانس OMV في العمليات الخلوية مهم بشكل واضح ، فإن الصعوبات التقنية في فصل وتحليل مجموعات متميزة من الحويصلات حدت من هذه الدراسات.
بالإضافة إلى أهميتها في الإمراض البكتيري ، تم اقتراح OMVs للاستخدام في عدد من التطبيقات الحيوية ، بما في ذلك اللقاحات ومركبات توصيل الأدوية16و17و18و19و20. لاستخدامها في هذه النهج، مطلوب إعداد نظيفة وموحدة من الحويصلات. وبالتالي، فإن أساليب الفصل الفعالة والفعالة ضرورية.
الأكثر شيوعا، كثافة التدرج الطرد المركزي (DGC) يستخدم لفصل مجموعات الحويكل غير متجانسة الحجم من الحطام الخلوي، بما في ذلك flagellae والبروتينات المفرزة21؛ كما تم الإبلاغ عن طريقة كنهج لفصل السكان الفرعي OMV غير متجانسة الحجم12،13،14. ومع ذلك، DGC تستغرق وقتا طويلا، غير فعالة، ومتغيرة للغاية من مستخدم إلى مستخدم22، وبالتالي، ليست مثالية لتوسيع نطاق. في المقابل، يمثل اللونيات استبعاد الحجم (SEC) نهجا قابلا للتطوير والكفاءة ومتسقا لتنقية OMVs21و23و24. لقد وجدنا أن طويلة (50 سم)، والجاذبية تدفق، عمود لجنة الأوراق المالية والبورصة، مليئة هلام الترشيح المتوسطة كافية لتنقية بكفاءة وفصل السكان الفرعيين من OMVs. على وجه التحديد، استخدمنا هذا النهج لفصل A. actinomycetemcomitans OMVs إلى مجموعات فرعية "كبيرة" و "صغيرة"، وكذلك لإزالة التلوث بالبروتين والحمض النووي. وقد تم الانتهاء من تنقية في أقل من 4 ساعة، وتم الفصل الكامل بين السكان الفرعيين OMV وإزالة الحطام.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 50 kDa filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA Immuno Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T13320</td>
			<td>1.5 x 50 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Econo-Column</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7371552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 Pro Plate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Amresco (VWR)</td>
			<td>0395-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4)</td>
			<td>Amresco (VWR)</td>
			<td>0781-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S-1000 Superfine</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0476-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Amresco (VWR)</td>
			<td>0404-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0497-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween(R) 20</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>23336-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

size exclusion chromatography to analyze bacterial outer membrane vesicle heterogeneity

يتكون جدار الخلية من البكتيريا السلبية الغرام من غشاء داخلي (السيتوبلازمي) والخارجي (OM)، مفصولة طبقة بيبتيدوغليكان رقيقة. طوال النمو ، يمكن للغشاء الخارجي أن يبلل لتشكيل حويصلات الغشاء الخارجي الكروي (OMVs). وتشارك هذه OMVs في العديد من الوظائف الخلوية بما في ذلك تسليم البضائع إلى الخلايا المضيفة والتواصل مع الخلايا البكتيرية. وفي الآونة الأخيرة، بدأ استكشاف الإمكانات العلاجية لمركبات OMVs، بما في ذلك استخدامها كلقاحات ومركبات لإيصال الأدوية. على الرغم من أن OMVs مشتقة من OM ، فقد كان من دواعي التقدير منذ فترة طويلة أن شحنة الدهون والبروتين في OMV تختلف ، في كثير من الأحيان بشكل كبير ، عن تلك الخاصة ب OM. وفي الآونة الأخيرة، تم اكتشاف أدلة على أن البكتيريا يمكن أن تطلق أنواعا متعددة من OMVs، وتوجد أدلة على أن الحجم يمكن أن يؤثر على آلية امتصاصها من قبل الخلايا المضيفة. ومع ذلك، فإن الدراسات في هذا المجال محدودة بسبب الصعوبات في الفصل بكفاءة بين OMVs غير المتجانسة الحجم. وقد جرت العادة على استخدام أجهزة الطرد المركزي المتدرجة للكثافة لهذا الغرض؛ ومع ذلك، تستغرق هذه التقنية وقتا طويلا ويصعب توسيع نطاقها. من ناحية أخرى ، فإن اللونيات استبعاد الحجم (SEC) أقل تعقيدا وتفسح المجال للارتقاء المستقبلي الضروري للاستخدام العلاجي ل OMVs. هنا، ونحن نصف نهج لجنة الأوراق المالية والبورصة التي تمكن من فصل استنساخها من الحويصلات غير متجانسة الحجم، وذلك باستخدام كحالة اختبار، OMVs التي تنتجها Aggregatibacter actinomycetemcomitans، والتي تتراوح في القطر من أقل من 150 نانومتر إلى أكثر من 350 نانومتر. نحن نظهر فصل OMVs "كبيرة" (350 نانومتر) و "صغيرة" (<150 نانومتر) OMVs، التي تم التحقق منها من خلال تشتت الضوء الديناميكي (DLS). نوصي تقنيات قائمة على لجنة الأوراق المالية والبورصة على تقنيات المستندة إلى DGC لفصل الحويصلات غير متجانسة الحجم بسبب سهولة استخدامها، والاستنساخ (بما في ذلك المستخدم إلى المستخدم)، وإمكانية لتوسيع نطاق.

ويبين الشكل 2 النتائج التمثيلية لهذه الطريقة. OMVs التي تنتجها A. actinomycetemcomitans سلالة JP2 تم تنقيتها لأول مرة من الثقافة الفائقة باستخدام الطرد الفائق15. وجدنا سابقا أن هذه السلالة تنتج مجموعتين من OMVs، واحد مع أقطار حوالي 300 نانومتر وواحد مع أقطار حوالي 100 نانومتر...

Watch this Scientific Journal Video about Size Exclusion Chromatography to Analyze Bacterial Outer Membrane Vesicle Heterogeneity at JoVE.com

Size Exclusion Chromatography to Analyze Bacterial Outer Membrane Vesicle Heterogeneity

الحويصلات البكتيرية تلعب أدوارا هامة في الإمراض ولها تطبيقات التكنولوجيا الحيوية الواعدة. عدم التجانس من الحويصلات يعقد التحليل والاستخدام; لذلك ، من الضروري استخدام طريقة بسيطة قابلة للاستنساخ لفصل أحجام مختلفة من الحويصلات. هنا، ونحن نثبت استخدام الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم لفصل الحويصلات غير المتجانسة التي تنتجها Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

حجم استبعاد الكروماتوغرافيا لتحليل الغشاء الخارجي البكتيري فيسيكلي التجانس

The cell wall of Gram-negative bacteria consists of an inner (cytoplasmic) and outer membrane (OM), separated by a thin peptidoglycan layer. Throughout ...

يعد اللونيات استبعاد الحجم نهجا مفيدا لفصل الفئات السكانية الفرعية للحوائش البكتيرية غير المتجانسة الحجم وإزالة الأحماض النووية والبروتينات من المضادات البكتيرية. يعد اللونيات استبعاد الحجم أقل تكلفة وأسرع وأكثر قابلية للاستنساخ من تقنيات الفصل الأخرى، بما في ذلك الطرد الفائق الانحدار للكثافة. لقد أظهرنا إمكانات هذا النهج باستخدام الحويصلات A.actinomycetemcomitans ، لكننا نتوقع أنه يمكن تطبيقه على مجموعات الحويصلات البكتيرية الأخرى غير المتجانسة الحجم أيضا.تأكد من أن degas بشكل صحيح كل من العازلة وحلول حبة وماصة الحل ببطء دون إدخال فقاعات ولكن بسرعة كافية أن حزمة الخرز متجانسة دون تجفيف. للبدء، استخدم قضيب زجاجي لخلط زجاجة مخزون من هلام الترشيح المتوسطة وصب حجم المطلوبة لملء العمود بالإضافة إلى ما يقرب من 50٪ الزائدة في زجاجة. السماح للخرز لتسوية وdecant السائل الزائد.Resuspend الخرز في العازلة elution إلى حل نهائي من هلام ما يقرب من 70 ٪ و 30 ٪ العازلة وdgas الحل تحت فراغ. قم بتركيب العمود على حامل حلقة في الموضع الرأسي وملء العمود بحاجز elution لتبلل الجدران قبل استنزاف المخزن المؤقت حتى يبقى سنتيمتر واحد فقط. ثم ماصة بعناية الخرز هلام في العمود في حين استنزاف في وقت واحد العازلة الزائدة لمنع الخرز من الاستقرار حتى يتم تعبئة العمود إلى ارتفاع سنتيمترين تقريبا تحت الجزء السفلي من خزان العمود.قبل تحميل العينة، ديغا العازلة elution تحت فراغ. اغسل العمود بحوالي ضعف حجم العمود من المخزن المؤقت elution. بمجرد أن يصل العازلة إلى أعلى طبقة هلام، إضافة بعناية اثنين من ملليلتر من 100 إلى 200 نانومولار لكل لتر عينة الحويصلة الغشاء الخارجي على رأس طبقة هلام دون إزعاج السطح والسماح للعينة دخول هلام.أضف المخزن المؤقت elution ببطء إلى العمود دون إزعاج طبقة الجل وضع أنبوب 50 ملليلتر تحت العمود. لمنع تجفيف العمود، قم في نفس الوقت بإضافة المخزن المؤقت elution إلى أعلى العمود. بعد جمع 20 ملليلتر من اليواتي، ضع رف من أنابيب 1.5 ملليلتر تحت العمود.جمع ما مجموعه 96 كسر ملليلتر واحد في كل أنبوب. أثناء تجميع العينات، قم بإضافة المخزن المؤقت elution باستمرار إلى العمود. لتنظيف العمود، قم بتشغيل حجم عمود واحد من هيدروكسيد الصوديوم المولاري 0.1 من خلال العمود متبوعا بمجلدات عمودين من المخزن المؤقت elution.لقياس تركيزات الدهون، ماصة 50 ميكرولتر من كل جزء في لوحة بئر 96. إضافة 2.5 ميكرولتر من صبغة الدهون إلى كل بئر. بعد 15 ثانية، قياس كثافة فلوريسنس.لقياس تركيز البروتين ذات الأهمية، أضف 100 ميكرولتر من كل جزء إلى آبار فردية من لوحة المناعة ELISA. بعد ثلاث ساعات في 25 درجة مئوية، decant محتويات لوحة. غسل لوحة خمس مرات مع 200 ميكرولتر من العازلة غسل ELISA لكل غسل decanting لوحة بعد كل غسل.إضافة 200 ميكرولتر من العازلة حجب إلى كل بئر لمدة ساعة واحدة حضانة في 25 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، قم بفك الصفيحة وأضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية في حاجز الحجب لاحتضانها بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، decant لوحة وغسل لوحة خمس مرات مع العازلة غسل ELISA كما هو موضح.بعد الغسيل الأخير، أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية في عازل غسل ELISA إلى كل بئر لمدة ساعة حضانة عند 25 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، اغسل اللوحة كما هو موضح وأضف 100 ميكرولتر من محلول TMB لكل بئر لمدة 15 إلى 30 دقيقة حضانة في درجة حرارة الغرفة. عندما يتطور اللون الأزرق، إضافة 50 ميكرولتر من محلول وقف لكل بئر وقياس امتصاص في 450 نانومتر.بعد حجم استبعاد العمود تنقية A.actinomycetemcomitans الثقافة supernatant كما هو موضح، لوحظت اثنين من قمم الدهون متميزة، المقابلة ل vesicles الغشاء الخارجي الكبيرة والصغيرة التي تنتجها هذه السلالة. كشف تحليل ELISA لكسور العينة أن السم يرتبط في المقام الأول بالسكان الفرعيين ل الحويصلات الكبيرة للغشاء الخارجي. أعطى تحليل البقع المناعية نتائج مماثلة ولكن أكثر ضجيجا ، مما يشير إلى أن هذا النهج أقل حساسية من ELISA.كما لوحظ، هذه التقنية الكروماتوغرافيا قادرة على إزالة كميات كبيرة من البروتينات الحرة من الاستعدادات الحويصلات الغشاء الخارجي. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن تركيز البروتين الكلي لا يرتبط بالضرورة مع تركيز بروتينات محددة. من المهم أن نكون حذرين جدا أثناء التعبئة وتشغيل العمود لتجنب الفقاعات ومنع العمود من الجفاف.يمكن إجراء تشتت الضوء الديناميكي وتتبع الجسيمات والتنظير الثنائي بعد كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لتحديد حجم وخصائص أخرى من الحويصلات الغشاء الخارجي المنفصل.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

تصميم مفاعل حيوي لضغط الدوري السابقين فيفو دراسة صمامات القلب الأورطي

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

كشف البكتيرية والاستدلال باستخدام مجسات الكهروكيميائية

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

غشاء العمود الفقري: أداة كيميائية حيوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات للبروتينات الغشاء<em&gt; في فيفو</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

الدهون طبقة ثنائية الحويصلة انشاء طريق ميكروفلويديك النفث

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

الكمي والحجم التنميط من خارج الخلية عن طريق الحويصلات الانضباطي مقاوم نبض الاستشعار

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

نقل التلألؤ الرنين الطاقة لدراسة التغييرات بتكوين جزئي في غشاء البروتينات أعرب في خلايا الثدييات

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

طرق للتميز الرئيسين تطوير بيوفيلم والموئل التجانس

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

A منصة ميكروفلويديك لتجهيز الدقة الصغيرة الحجم عينة واستخدامها لحجم الجسيمات البيولوجية منفصلة مع Microdevice الصوتية

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate Poly(Lactic Acid) Scaffolds with Graded Pore Size

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate PolyLactic Acid Scaffolds with Graded Pore Size

وسطحي جدا وصديقة للبيئة الطريق إلى افتعال بولي (حمض اللاكتيك) السقالات مع متدرج مسام الحجم

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

علاج الرباط ينشأ مع مصل مكيفة مكيفة: نموذج هندسة الأنسجة الانتقالية

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...