Name: size exclusion chromatography to analyze bacterial outer membrane vesicle heterogeneity
Uploaded: 2021-03-31T15:00:00
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Ce travail a été financé par la National Science Foundation (1554417) et les National Institutes of Health (DE027769).

1. Préparation des tampons
<ol><li>Pour préparer le tampon de lavage ELISA, ajouter 3,94 g de Tris-base, 8,77 g de NaCl et 1 g d’albumine sérique bovine (BSA) à 1 L d’eau désionisée (DI). Ajouter 500 μL de polysorbate-20. Ajustez le pH à 7,2 en utilisant HCl ou NaOH.</li>
	<li>Pour préparer le tampon bloquant, ajoutez 3,94 g de Tris-base, 8,77 g de NaCl et 10 g de BSA. Ajouter 500 μL de polysorbate-20 à 1 L d’eau DI. Ajustez le pH à 7,2 en utilisant HCl ou NaOH.</li>
	<li>Pour préparer le tampon d’...

<ol>
	<li>Kuehn, M. J., Kesty, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+and+the+host-pathogen+interaction.">Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction.</a> Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).</li><li>Kulp, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+functions+and+biogenesis+of+secreted+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles.</a> Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).</li><li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin.">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li><li>Nice, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+leukotoxin+is+delivered+to+host+cells+in+an+LFA-1-independent+manner+when+associated+with+outer+membrane+vesicles.">Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles.</a> Toxins. 10 (10), 414 (2018).</li><li>Haurat, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+sorting+of+cargo+proteins+into+bacterial+membrane+vesicles.">Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).</li><li>Horstman, A. L., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterotoxigenic+Escherichia+coli+secretes+active+heat-labile+enterotoxin+via+outer+membrane+vesicles.">Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (17), 12489-12496 (2000).</li><li>Wai, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle-mediated+export+and+assembly+of+pore-forming+oligomers+of+the+Enterobacterial+ClyA+cytotoxin.">Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the Enterobacterial ClyA cytotoxin.</a> Cell. 115, 25-35 (2003).</li><li>Balsalobre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+the+Type+I+secreted+&#945;-haemolysin+via+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli.">Release of the Type I secreted &#945;-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli.</a> Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).</li><li>Donato, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Bordetella+pertussis+adenylate+cyclase+toxin+to+target+cells+via+outer+membrane+vesicles.">Delivery of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to target cells via outer membrane vesicles.</a> FEBS Letters. 586, 459-465 (2012).</li><li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+of+Vibrio+vulnificus+deliver+cytolysin-hemolysin+VvhA+into+epithelial+cells+to+induce+cytotoxicity.">Outer membrane vesicles of Vibrio vulnificus deliver cytolysin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 399, 607-612 (2010).</li><li>Maldonado, R., Wei, R., Kachlany, S. C., Kazi, M., Balashova, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+effects+of+Kingella+kingae+outer+membrane+vesicles+on+human+cells.">Cytotoxic effects of Kingella kingae outer membrane vesicles on human cells.</a> Microbial Pathogenesis. 51 (1-2), 22-30 (2011).</li><li>Turner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+outer+membrane+vesicle+size+determines+their+mechanisms+of+host+cell+entry+and+protein+content.">Helicobacter pylori outer membrane vesicle size determines their mechanisms of host cell entry and protein content.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1466 (2018).</li><li>Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+growth+stage+determines+the+size,+protein+composition,+and+preferential+cargo+packaging+of+outer+membrane+vesicles.">Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles.</a> Proteomics. 19 (1-2), 1800209 (2019).</li><li>Rompikuntal, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear+localization+of+internalized+outer+membrane+vesicles+carrying+active+cytolethal+distending+toxin+from+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans.">Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans.</a> Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).</li><li>Nice, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+leukotoxin+is+delivered+to+host+cells+in+an+LFA-1-independent+manner+when+associated+with+outer+membrane+vesicles.">Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles.</a> Toxins. 10 (10), 414 (2018).</li><li>Stevenson, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+outer+membrane+vesicles+displaying+conserved+surface+polysaccharide+antigen+elicits+broadly+antimicrobial+antibodies.">Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).</li><li>Gujrati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+as+cell-specific+drug-delivery+vehicles+for+cancer+therapy.">Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy.</a> ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+nanoantibiotics+using+an+outer+membrane+vesicle-based+drug+efflux+mechanism.">Development of novel nanoantibiotics using an outer membrane vesicle-based drug efflux mechanism.</a> Journal of Controlled Release. 317, 1-22 (2020).</li><li>Chen, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+foreign+antigens+by+engineered+outer+membrane+vesicle+vaccines.">Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+displaying+engineered+glycotopes+elicit+protective+antibodies.">Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).</li><li>Singorenko, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+A+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies.">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Science Reports. 7 (1), 15297 (2017).</li><li>Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+functionality+of+extracellular+vesicles+isolated+using+size-exclusion+chromatography+compared+to+ultracentrifugation.">Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation.</a> Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).</li><li>Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+immunological+characterization+of+the+domain+of+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+leukotoxin+that+determines+its+specificity+for+human+target+cells.">Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).</li><li>Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigallocatechin+gallate+inhibits+leukotoxin+release+by+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+by+promoting+association+with+the+bacterial+membrane.">Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane.</a> Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).</li><li>Klimentov&#225;, J., Stul&#237;k, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolation+and+purification+of+outer+membrane+vesicles+from+gram-negative+bacteria.">Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria.</a> Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).</li><li>Mongui&#243;-Tortajada, M., G&#225;lvez-Mont&#243;n, C., Bayes-Genis, A., Roura, S., Borr&#224;s, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+isolation+methods:+rising+impact+of+size-exclusion+chromatography.">Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (12), 2369-2382 (2019).</li></ol>

Ici, nous avons fourni un protocole pour la séparation simple, rapide et reproductible des sous-populations bactériennes OMV. Bien que la technique soit relativement simple, certaines étapes doivent être effectuées avec beaucoup de soin pour s’assurer qu’une séparation efficace se produit dans la colonne. Tout d’abord, il est essentiel que le gel soit chargé dans la colonne avec soin et lentement pour éviter les bulles d’air. Nous avons observé que laisser le gel à température ambiante pendant plusieur...

Les bactéries à Gram négatif libèrent des vésicules dérivées de leur membrane externe, appelées vésicules de la membrane externe (OMV), tout au long de la croissance. Ces OMV jouent un rôle important dans la communication de cellule à cellule, à la fois entre les bactéries et l’hôte ainsi qu’entre les cellules bactériennes, en transportant un certain nombre de biomolécules importantes, y compris l’ADN / ARN, les protéines, les lipides et les peptidoglycanes1,2. En particulier, le rôle des OMV dans la pathogenèse bactérienne a été largement étudié en raison de leur enrichissement en certains facteurs de virulence et toxines3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Il a été rapporté que la taille des OMV varie de 20 à 450 nm, selon les bactéries mères et le stade de croissance, plusieurs types de bactéries libérant des OMV de taille hétérogène8, 12,13,14, qui diffèrent également par leur composition protéique et leur mécanisme d’entrée dans la cellule hôte12. H. pylori a libéré des OMV d’un diamètre allant de 20 à 450 nm, les OMV plus petits contenant une composition protéique plus homogène que les OMV plus grands. Fait important, les deux populations d’OMV ont été observées comme faisant l’objet d’une internalisation par les cellules hôtes via différents mécanismes12. En outre, nous avons démontré qu’Aggregatibacter actinomycetemcomitans libère une population de petits OMV (<150 nm) ainsi qu’une population de grands OMV (>350 nm), les OMV contenant une quantité importante d’une toxine protéique sécrétée, la leucotoxine (LtxA)15. Bien que le rôle de l’hétérogénéité OMV dans les processus cellulaires soit clairement important, les difficultés techniques dans la séparation et l’analyse de populations distinctes de vésicules ont limité ces études.
En plus de leur importance dans la pathogenèse bactérienne, les OMV ont été proposés pour une utilisation dans un certain nombre d’applications biotechnologiques, y compris comme vaccins et véhicules d’administration de médicaments16,17,18,19,20. Pour leur utilisation translationnelle dans de telles approches, une préparation propre et monodispersée de vésicules est nécessaire. Ainsi, des méthodes de séparation efficaces et efficientes sont nécessaires.
Le plus souvent, la centrifugation par gradient de densité (DGC) est utilisée pour séparer les populations de vésicules de taille hétérogène des débris cellulaires, y compris les flagelles et les protéines sécrétées21; la méthode a également été rapportée comme une approche pour séparer les sous-populations OMV de taille hétérogène12,13,14. Cependant, DGC prend du temps, est inefficace et très variable d’utilisateur à utilisateur22 et n’est donc pas idéal pour la mise à l’échelle. En revanche, la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) représente une approche évolutive, efficace et cohérente pour purifier les OMV21,23,24. Nous avons constaté qu’une longue colonne SEC à flux gravitaire de 50 cm, remplie de milieu de filtration sur gel, est suffisante pour purifier et séparer efficacement les sous-populations d’OMV. Plus précisément, nous avons utilisé cette approche pour séparer les OMV d’A. actinomycetemcomitans en « grandes » et « petites » sous-populations, ainsi que pour éliminer la contamination des protéines et de l’ADN. La purification a été achevée en moins de 4 h, et la séparation complète des sous-populations OMV et l’enlèvement des débris ont été réalisés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 50 kDa filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA Immuno Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T13320</td>
			<td>1.5 x 50 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Econo-Column</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7371552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 Pro Plate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Amresco (VWR)</td>
			<td>0395-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4)</td>
			<td>Amresco (VWR)</td>
			<td>0781-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S-1000 Superfine</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0476-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Amresco (VWR)</td>
			<td>0404-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0497-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween(R) 20</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>23336-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

size exclusion chromatography to analyze bacterial outer membrane vesicle heterogeneity

La paroi cellulaire des bactéries à Gram négatif est constituée d’une membrane interne (cytoplasmique) et externe (OM), séparées par une fine couche de peptidoglycane. Tout au long de la croissance, la membrane externe peut saigner pour former des vésicules sphériques de la membrane externe (OMV). Ces OMV sont impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires, y compris la livraison de fret aux cellules hôtes et la communication avec les cellules bactériennes. Récemment, le potentiel thérapeutique des OMV a commencé à être exploré, y compris leur utilisation comme vaccins et véhicules d’administration de médicaments. Bien que les OMV soient dérivés de l’OM, on apprécie depuis longtemps que la cargaison de lipides et de protéines de l’OMV diffère, souvent de manière significative, de celle de l’OM. Plus récemment, des preuves que les bactéries peuvent libérer plusieurs types d’OMV ont été découvertes, et il existe des preuves que la taille peut avoir un impact sur le mécanisme de leur absorption par les cellules hôtes. Cependant, les études dans ce domaine sont limitées par les difficultés à séparer efficacement les OMV de taille hétérogène. La centrifugation par gradient de densité (DGC) a traditionnellement été utilisée à cette fin; cependant, cette technique prend beaucoup de temps et est difficile à mettre à l’échelle. La chromatographie d’exclusion de taille (SEC), en revanche, est moins lourde et se prête à la mise à l’échelle future nécessaire pour l’utilisation thérapeutique des OMV. Ici, nous décrivons une approche SEC qui permet une séparation reproductible de vésicules de taille hétérogène, en utilisant comme cas de test, les OMV produits par Aggregatibacter actinomycetemcomitans, dont le diamètre varie de moins de 150 nm à plus de 350 nm. Nous démontrons la séparation des OMV « grands » (350 nm) et des OMV « petits » (<150 nm), vérifiée par diffusion dynamique de la lumière (DLS). Nous recommandons les techniques basées sur la SEC plutôt que les techniques basées sur la DGC pour la séparation des vésicules de taille hétérogène en raison de sa facilité d’utilisation, de sa reproductibilité (y compris d’utilisateur à utilisateur) et de sa possibilité de mise à l’échelle.

La figure 2 montre les résultats représentatifs de cette méthode. Les OMV produits par la souche JP2 d’A. actinomycetemcomitans ont d’abord été purifiés à partir du surnageant de culture par ultracentrifugation15. Nous avons précédemment constaté que cette souche produit deux populations d’OMV, l’une avec des diamètres d’environ 300 nm et l’autre avec des diamètres d’environ 100 nm15. Pour séparer ces populat...

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Size Exclusion Chromatography to Analyze Bacterial Outer Membrane Vesicle Heterogeneity

Les vésicules bactériennes jouent un rôle important dans la pathogenèse et ont des applications biotechnologiques prometteuses. L’hétérogénéité des vésicules complique l’analyse et l’utilisation; par conséquent, une méthode simple et reproductible pour séparer les différentes tailles de vésicules est nécessaire. Ici, nous démontrons l’utilisation de la chromatographie d’exclusion de taille pour séparer les vésicules hétérogènes produites par Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Chromatographie d’exclusion de taille pour analyser l’hétérogénéité des vésicules de la membrane externe bactérienne

The cell wall of Gram-negative bacteria consists of an inner (cytoplasmic) and outer membrane (OM), separated by a thin peptidoglycan layer. Throughout ...

La chromatographie d’exclusion de taille est une approche utile pour séparer les sous-populations de vésicules bactériennes de taille hétérogène et pour éliminer les acides nucléiques et les protéines des surnageants bactériens. La chromatographie d’exclusion de taille est moins coûteuse, plus rapide et plus reproductible que les autres techniques de séparation, y compris l’ultracentrifugation par gradient de densité. Nous avons démontré le potentiel de cette approche en utilisant les vésicules d’A.actinomycetemcomitans, mais nous nous attendons à ce qu’elle puisse également être appliquée à d’autres populations de vésicules bactériennes de taille hétérogène.Assurez-vous de bien dégazer toutes les solutions de tampon et de perles et de pipeter la solution lentement sans introduire de bulles, mais assez rapidement pour que les billes s’emballent de manière homogène sans se dessécher. Pour commencer, utilisez une tige de verre pour mélanger un flacon de milieu de filtration en gel et versez le volume nécessaire pour remplir la colonne plus environ 50% d’excès dans une bouteille en verre. Laissez les perles se déposer et décanter l’excès de liquide.Resuspendez les billes dans un tampon d’élution en une solution finale d’environ 70% de gel et 30% de tampon et dégazez la solution sous vide. Montez la colonne sur un support annulaire en position verticale et remplissez la colonne avec un tampon d’élution pour mouiller les parois avant de drainer le tampon jusqu’à ce qu’il ne reste qu’environ un centimètre. Ensuite, pipetez soigneusement les billes de gel dans la colonne tout en drainant simultanément l’excès de tampon pour empêcher les perles de se déposer jusqu’à ce que la colonne soit emballée à une hauteur d’environ deux centimètres au-dessous du fond du réservoir de la colonne.Avant de charger l’échantillon, dégazez le tampon d’élution sous vide. Lavez la colonne avec environ deux fois le volume de colonne du tampon d’élution. Une fois que le tampon atteint le sommet de la couche de gel, ajoutez soigneusement deux millilitres d’un échantillon de vésicule de membrane externe de 100 à 200 nanomolaires par litre sur le dessus de la couche de gel sans perturber la surface et laissez l’échantillon entrer dans le gel.Ajoutez lentement le tampon d’élution à la colonne sans perturber la couche de gel et placez un tube de 50 millilitres sous la colonne. Pour éviter que la colonne ne sèche, ajoutez simultanément un tampon d’élution en haut de la colonne. Après avoir recueilli 20 millilitres d’éluat, placez un rack de tubes de 1,5 millilitre sous la colonne.Collectez un total de 96 fractions d’un millilitre dans chaque tube. Lors de la collecte des échantillons, ajoutez continuellement un tampon d’élution à la colonne. Pour nettoyer la colonne, exécutez un volume de colonne d’hydroxyde de sodium molaire 0,1 à travers la colonne, suivi de deux volumes de colonne de tampon d’élution.Pour mesurer les concentrations lipidiques, pipettez 50 microlitres de chaque fraction dans une plaque de 96 puits. Ajouter 2,5 microlitres de colorant lipophile à chaque puits. Après 15 secondes, mesurez l’intensité de la floraison.Pour mesurer la concentration d’une protéine d’intérêt, ajoutez 100 microlitres de chaque fraction dans les puits individuels d’une plaque immunologique ELISA. Après trois heures à 25 degrés Celsius, décantez le contenu de la plaque. Lavez la plaque cinq fois avec 200 microlitres de tampon de lavage ELISA par lavage en décant la plaque après chaque lavage.Ajoutez 200 microlitres de tampon bloquant à chaque puits pour une incubation d’une heure à 25 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, décantez la plaque et ajoutez 100 microlitres d’anticorps primaires dans un tampon bloquant pour une incubation de nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, décantez la plaque et lavez la plaque cinq fois avec un tampon de lavage ELISA comme démontré.Après le dernier lavage, ajoutez 100 microlitres d’anticorps secondaires dans un tampon de lavage ELISA à chaque puits pour une incubation d’une heure à 25 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, laver la plaque comme démontré et ajouter 100 microlitres de solution de TMB à chaque puits pour une incubation de 15 à 30 minutes à température ambiante. Lorsqu’une couleur bleue se développe, ajoutez 50 microlitres de solution d’arrêt à chaque puits et mesurez l’absorbance à 450 nanomètres.Après la purification de la colonne d’exclusion de taille d’un surnageant de culture d’A.actinomycetemcomitans, comme démontré, deux pics lipidiques distincts ont été observés, correspondant aux grandes et petites vésicules de la membrane externe produites par cette souche. L’analyse ELISA des fractions de l’échantillon a révélé que la toxine est principalement associée à la sous-population de grandes vésicules de la membrane externe. L’analyse par immuno-transfert a donné des résultats similaires mais plus bruyants, indiquant que cette approche est moins sensible que l’ELISA.Comme observé, cette technique de chromatographie est capable d’éliminer des quantités importantes de protéines libres des préparations des vésicules de la membrane externe. Cependant, il est important de noter que la concentration totale en protéines n’est pas nécessairement corrélée à la concentration de protéines spécifiques. Il est important d’être très prudent lors de l’emballage et du fonctionnement de la colonne pour éviter les bulles et éviter que la colonne ne se dessèche.La diffusion dynamique de la lumière, le suivi des particules et la bicroscopie peuvent être effectués après une chromatographie d’exclusion de taille pour déterminer la taille et d’autres caractéristiques des vésicules de la membrane externe séparées.

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