Name: size exclusion chromatography to analyze bacterial outer membrane vesicle heterogeneity
Uploaded: 2021-03-31T15:00:00
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이 작품은 국립 과학 재단 (1554417)과 건강의 국립 연구소 (DE027769)에 의해 투자되었다.

1. 버퍼 준비
<ol><li>ELISA 세척 버퍼를 준비하려면 3.94g 트라이스 베이스, 8.77 g NaCl, 1 g 소 세럼 알부민(BSA)을 1L의 디온화(DI) 물에 넣습니다. 500 μL 폴리소르바테-20을 추가합니다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다.</li>
	<li>블로킹 버퍼를 준비하려면 트라이베이스 3.94g, NaCl 8.77g, BSA 10g을 추가합니다. 500 μL 폴리소르바테-20 ~1L의 DI 물을 추가합니다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정합?...

<ol>
	<li>Kuehn, M. J., Kesty, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+and+the+host-pathogen+interaction.">Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction.</a> Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).</li><li>Kulp, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+functions+and+biogenesis+of+secreted+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles.</a> Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).</li><li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin.">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li><li>Nice, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+leukotoxin+is+delivered+to+host+cells+in+an+LFA-1-independent+manner+when+associated+with+outer+membrane+vesicles.">Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles.</a> Toxins. 10 (10), 414 (2018).</li><li>Haurat, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+sorting+of+cargo+proteins+into+bacterial+membrane+vesicles.">Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).</li><li>Horstman, A. L., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterotoxigenic+Escherichia+coli+secretes+active+heat-labile+enterotoxin+via+outer+membrane+vesicles.">Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (17), 12489-12496 (2000).</li><li>Wai, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle-mediated+export+and+assembly+of+pore-forming+oligomers+of+the+Enterobacterial+ClyA+cytotoxin.">Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the Enterobacterial ClyA cytotoxin.</a> Cell. 115, 25-35 (2003).</li><li>Balsalobre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+the+Type+I+secreted+&#945;-haemolysin+via+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli.">Release of the Type I secreted &#945;-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli.</a> Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).</li><li>Donato, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Bordetella+pertussis+adenylate+cyclase+toxin+to+target+cells+via+outer+membrane+vesicles.">Delivery of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to target cells via outer membrane vesicles.</a> FEBS Letters. 586, 459-465 (2012).</li><li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+of+Vibrio+vulnificus+deliver+cytolysin-hemolysin+VvhA+into+epithelial+cells+to+induce+cytotoxicity.">Outer membrane vesicles of Vibrio vulnificus deliver cytolysin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 399, 607-612 (2010).</li><li>Maldonado, R., Wei, R., Kachlany, S. C., Kazi, M., Balashova, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+effects+of+Kingella+kingae+outer+membrane+vesicles+on+human+cells.">Cytotoxic effects of Kingella kingae outer membrane vesicles on human cells.</a> Microbial Pathogenesis. 51 (1-2), 22-30 (2011).</li><li>Turner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+outer+membrane+vesicle+size+determines+their+mechanisms+of+host+cell+entry+and+protein+content.">Helicobacter pylori outer membrane vesicle size determines their mechanisms of host cell entry and protein content.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1466 (2018).</li><li>Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+growth+stage+determines+the+size,+protein+composition,+and+preferential+cargo+packaging+of+outer+membrane+vesicles.">Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles.</a> Proteomics. 19 (1-2), 1800209 (2019).</li><li>Rompikuntal, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear+localization+of+internalized+outer+membrane+vesicles+carrying+active+cytolethal+distending+toxin+from+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans.">Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans.</a> Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).</li><li>Nice, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+leukotoxin+is+delivered+to+host+cells+in+an+LFA-1-independent+manner+when+associated+with+outer+membrane+vesicles.">Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles.</a> Toxins. 10 (10), 414 (2018).</li><li>Stevenson, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+outer+membrane+vesicles+displaying+conserved+surface+polysaccharide+antigen+elicits+broadly+antimicrobial+antibodies.">Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).</li><li>Gujrati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+as+cell-specific+drug-delivery+vehicles+for+cancer+therapy.">Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy.</a> ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+nanoantibiotics+using+an+outer+membrane+vesicle-based+drug+efflux+mechanism.">Development of novel nanoantibiotics using an outer membrane vesicle-based drug efflux mechanism.</a> Journal of Controlled Release. 317, 1-22 (2020).</li><li>Chen, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+foreign+antigens+by+engineered+outer+membrane+vesicle+vaccines.">Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+displaying+engineered+glycotopes+elicit+protective+antibodies.">Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).</li><li>Singorenko, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+A+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies.">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Science Reports. 7 (1), 15297 (2017).</li><li>Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+functionality+of+extracellular+vesicles+isolated+using+size-exclusion+chromatography+compared+to+ultracentrifugation.">Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation.</a> Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).</li><li>Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+immunological+characterization+of+the+domain+of+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+leukotoxin+that+determines+its+specificity+for+human+target+cells.">Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).</li><li>Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigallocatechin+gallate+inhibits+leukotoxin+release+by+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+by+promoting+association+with+the+bacterial+membrane.">Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane.</a> Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).</li><li>Klimentov&#225;, J., Stul&#237;k, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolation+and+purification+of+outer+membrane+vesicles+from+gram-negative+bacteria.">Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria.</a> Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).</li><li>Mongui&#243;-Tortajada, M., G&#225;lvez-Mont&#243;n, C., Bayes-Genis, A., Roura, S., Borr&#224;s, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+isolation+methods:+rising+impact+of+size-exclusion+chromatography.">Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (12), 2369-2382 (2019).</li></ol>

여기에서, 우리는 세균성 OMV 하위 인구의 간단하고 빠르며 재현 가능한 분리를 위한 프로토콜을 제공했습니다. 이 기술은 비교적 직선적이지만 열에서 효율적인 분리가 발생하는지 확인하기 위해 매우 신중하게 수행해야 하는 몇 가지 단계가 있습니다. 첫째, 기포를 피하기 위해 젤을 조심스럽게 천천히 컬럼에 적재하는 것이 필수적입니다. 우리는 열을적재하기 전에 몇 시간 동안 실온에서 젤을...

그람 음성 박테리아는 성장을 통해 그들의 외부 막, 소위 외부 막 소포 (OMV)에서 파생 된 소포를 방출합니다. 이러한 OmV는 DNA/RNA, 단백질, 지질 및 펩티도글리칸1,2를포함한 다수의 중요한 생체 분자를 운반함으로써 박테리아와 숙주 뿐만 아니라 세균 세포 간 세포 간 통신에서 중요한 역할을 한다. 특히, 세균발생에 있는 OMV의 역할은 특정 독성 인자 및독소3,4,5,6,7,8,9,10,11에있는 그들의 풍부하게 때문에 광범위하게 연구되고있다.
OMV는 부모 박테리아와 성장 단계에 따라 20~450nm의 크기로 보고되었으며, 여러 종류의 박테리아가 이질적으로 크기의 OMV8,12,13,14를방출하며, 이는 또한 숙주 세포항목(12)의단백질 조성 및 메커니즘과 차이가 있다. H. 파일로리는 직경 이 20~450nm에 이르는 OMV를 출시했으며, 더 작은 OmV는 더 큰 OmV보다 더 균일한 단백질 성분을 함유하고 있습니다. 중요한 것은, OMV의 두 집단은 상이한메커니즘(12)을통해 숙주 세포에 의해 내면화되는 것으로 관찰되었다. 또한, 아그레가티박터 액티노미세템코미티안은 소형(<150nm) OMV의 인구와 함께 대형(>350 nm) OMV의 인구를 방출하고, 옴카는 상당한 양의 분비 단백질 독소, 류코톡신(LtxA)15를함유하고 있음을 입증했다. 세포 프로세스에서 OMV 이질성의 역할은 분명히 중요하지만, 소포의 뚜렷한 인구를 분리하고 분석하는 기술적 어려움은 이러한 연구를 제한했습니다.
세균성 병인증의 중요성 외에도, OMV는 백신 및 약물 전달차량(16,17, 18,19,20)을포함한 다수의 생명공학 적 응용 분야에서 사용하기 위해 제안되었습니다. 이러한 접근 방식에서 번역을 사용하려면 소포의 깨끗하고 단분산 된 준비가 필요합니다. 따라서 효과적이고 효율적인 분리 방법이 필요합니다.
가장 일반적으로, 밀도 그라데이션 원심분리(DGC)는 이질적으로 크기의 소포 집단을 기색 및 분비단백질(21)을포함한 세포 이물질로부터 분리하는 데 사용된다. 이 방법은 또한 이질적으로 크기의 OMV하위집단(12,13,14)을분리하는 접근법으로 보고되었다. 그러나 DGC는 시간이 많이 걸리고 비효율적이며 매우 가변적인 사용자 대사용자(22)이므로 확장에 적합하지 않습니다. 대조적으로,크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 OMV21,23,24를정화하는 확장가능하고 효율적이며 일관된 접근 방식을 나타낸다. 우리는 긴 (50cm), 중력 흐름, SEC 열, 젤 여과 매체로 채워진 효율적으로 정화하고 OMV의 하위 집단을 분리하기에 충분하다는 것을 발견했습니다. 특히, 우리는 A. actinomycetemcomitans OMV를 "큰" 및 "작은" 하위 인구로 분리하고 단백질과 DNA 오염을 제거하기 위하여 이 접근법을 이용했습니다. 정화는 4시간 미만으로 완료되었고, OMV 하위 인구의 완전한 분리와 이물질의 제거가 이루어졌습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 50 kDa filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA Immuno Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T13320</td>
			<td>1.5 x 50 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Econo-Column</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7371552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 Pro Plate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Amresco (VWR)</td>
			<td>0395-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4)</td>
			<td>Amresco (VWR)</td>
			<td>0781-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S-1000 Superfine</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0476-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Amresco (VWR)</td>
			<td>0404-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0497-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween(R) 20</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>23336-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

size exclusion chromatography to analyze bacterial outer membrane vesicle heterogeneity

그람 음성 박테리아의 세포벽은 얇은 펩티도글리칸 층으로 분리된 내부(세포질) 및 외부 막(OM)으로 구성됩니다. 성장을 통해 외부 멤브레인은 구형 외부 막 소포 (OMV)를 형성하기 위해 출혈 할 수 있습니다. 이러한 OmV는 호스트 세포에 화물 전달 및 세균 세포와의 통신을 포함한 수많은 세포 기능에 관여합니다. 최근, OMV의 치료 잠재력은 백신 및 약물 전달 차량으로 의 사용을 포함하여 탐구되기 시작했습니다. OMV는 OM에서 파생되지만 OMV의 지질 및 단백질 화물은 OM과 크게 다르다는 것을 오랫동안 인식해 왔습니다. 최근에는 박테리아가 여러 유형의 OMV를 방출할 수 있다는 증거가 발견되었으며, 크기가 숙주 세포에 의한 섭취 메커니즘에 영향을 미칠 수 있다는 증거가 존재합니다. 그러나, 이 지역에 있는 연구는 이질적으로 크기의 OMV를 효율적으로 분리하는 어려움에 의해 제한됩니다. 밀도 그라데이션 원심분리(DGC)는 전통적으로 이러한 목적을 위해 사용되어 왔습니다. 그러나 이 기술은 시간이 많이 걸리고 확장하기가 어렵습니다. 반면 에 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 덜 번거롭고 OMV의 치료 사용을 위해 필요한 미래 확장에 빌려준다. 여기서는 150nm 미만에서 350nm 이상까지 직경범위의 Aggregatibacter actinomycetemcomitans에의해 생성된 테스트 케이스, OmV를 사용하여 이질적으로 크기의 소포를 재현 할 수있는 분리를 가능하게하는 SEC 접근 방식을 설명합니다. 동적 조명 산란(DLS)으로 검증된 "대형"(350nm) OMV 및 "스몰"(<150 nm) OMV의 분리를 시연합니다. 사용 편의성, 재현성(사용자 간 포함) 및 확장 가능성으로 인해 DGC 기반 기법을 통해 이질적으로 크기의 소포를 분리하는 것이 좋습니다.

그림 2에서는 이 메서드의 대표적인 결과를 보여 주어 있습니다. A. actinomycetemcomitans 균주 JP2에 의해 생성된 OMV는 초원심분리기를 사용하여 문화 상류체로부터 먼저 정제되었다15. 우리는 이전에이 균주가 약 300 nm의 직경과 약 100 nm15의직경을 가진 하나, OMV의 두 인구를 생산하는 것을 발견했다. 이러한 OMV 인구를 분리하기 위해 위에?...

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Size Exclusion Chromatography to Analyze Bacterial Outer Membrane Vesicle Heterogeneity

세균성 소포는 병인에 중요한 역할을 하고 유망한 생명 공학 응용 프로그램이 있습니다. 소포의 이질성은 분석과 사용을 복잡하게 합니다. 따라서 다양한 크기의 소포를 분리하는 간단하고 재현 가능한 방법이 필요합니다. 여기에서, 우리는 Aggregatibacter actinomycetemcomitans에의해 생성된 이기종 소포를 분리하기 위하여 크기 배제 크로마토그래피의 사용을 보여줍니다.

크기 배제 크로마토그래피는 세균 외부 막 소포 이질성을 분석

The cell wall of Gram-negative bacteria consists of an inner (cytoplasmic) and outer membrane (OM), separated by a thin peptidoglycan layer. Throughout ...

크기 배제 크로마토그래피는 이질적으로 크기의 세균 성 소포의 하위 집단을 분리하고 세균 성 초자연체에서 핵산과 단백질을 제거하기위한 유용한 접근 방식입니다. 크기 배제 크로마토그래피는 밀도 그라데이션 초원심 분리를 포함한 다른 분리 기술보다 저렴하고 빠르며 재현이 가능합니다. 우리는 A.actinomycetemcomitans 소포를 사용하여 이 접근의 잠재력을 보여주었습니다, 그러나 우리는 또한 그밖 이기질 크기의 세균성 소포 인구에 적용될 수 있었다는 것을 예상합니다.모든 버퍼와 비드 솔루션을 제대로 탈착하고 거품을 도입하지 않고 천천히 솔루션을 피펫해야하지만 비드가 건조하지 않고 균일하게 포장 할 만큼 빨리. 먼저 유리 막대를 사용하여 젤 여과 매체의 스톡 병을 혼합하고 컬럼을 채우는 데 필요한 부피를 유리 병에 약 50%의 초과물을 붓습니다. 구슬이 여분의 액체를 정착시키고 데큰란트하도록 허용합니다.용출 버퍼에서 구슬을 약 70% 젤 및 30%의 버퍼로 재연하고 진공 상태에서 용액을 탈가스합니다. 기둥을 수직 위치에 있는 링 스탠드에 장착하고 열을 용해 버퍼로 채우고 벽을 적시고 버퍼를 약 1센티미터만 유지할 때까지 버퍼를 배수합니다. 그런 다음 열 저장소 의 바닥 아래 약 2 센티미터높이로 열이 포장 될 때까지 구슬이 침전되는 것을 방지하기 위해 과도한 버퍼를 배수하면서 젤 구슬을 조심스럽게 열로 피펫합니다.시료를 로드하기 전에 용출 버퍼를 진공 상태에서 탈가스로 변환합니다. 용출 버퍼의 약 2배의 열 부피로 컬럼을 세척합니다. 버퍼가 젤 층의 상단에 도달하면, 조심스럽게 표면을 방해하지 않고 젤 층 위에 리터 외부 멤브레인 소포 샘플 당 100 ~ 200 나노 몰라의 두 밀리리터를 추가하고 샘플이 젤에 들어가게한다.젤 층을 방해하지 않고 컬럼에 용출 버퍼를 천천히 추가하고 컬럼 아래에 50 밀리리터 튜브를 놓습니다. 열이 건조되지 않도록 하려면 동시에 열 상단에 용출 버퍼를 추가합니다. 20 밀리리터의 용루를 수집한 후 컬럼 아래에 1.5 밀리리터 튜브랙을 놓습니다.각 튜브에 총 96 개의 1 밀리 리터 분획을 수집합니다. 샘플을 수집하는 동안 열에 용출 버퍼를 지속적으로 추가합니다. 컬럼을 청소하려면 컬럼을 통해 수산화 나트륨0.1의 열 부피를 한 다음 두 개의 열 볼륨의 용출 버퍼를 실행합니다.지질 농도를 측정하기 위해 각 분획의 파이펫 50 마이크로리터를 96개의 웰 플레이트로 넣습니다. 각 웰에 2.5 마이크로리터의 리포마이트 염료를 넣습니다. 15초 후, 꽃의 강도를 측정합니다.관심 있는 단백질의 농도를 측정하려면 각 분획의 100마이크로리터를 ELISA 면역 플레이트의 개별 우물에 추가합니다. 섭씨 25도에서 3 시간 후, 접시 내용물. 세척 할 때마다 접시를 탈수 하는 세척 당 ELISA 세척 버퍼의 200 마이크로 리터와 함께 접시를 5 번 세척.25°C에서 1시간 동안 각 웰에 200마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가합니다. 인큐베이션의 끝에서, 플레이트를 데킹하고 4섭씨에서 하룻밤 잠복에 대한 버퍼를 차단하는 1차 항체의 마이크로리터를 추가한다. 다음 날, 접시를 데치고 ELISA 세척 버퍼로 접시를 5 번 세척하는 것으로 입증되었습니다.마지막 세척 후, ELISA 세척 버퍼에 이차 항체의 100 마이크로리터를 섭씨 25도에서 1시간 배양에 각각 양립할 수 있습니다. 인큐베이션이 끝나면, 입증된 대로 플레이트를 세척하고 실온에서 15~30분 동안 각 웰에 100마이크로리터의 TMB 용액을 추가합니다. 파란색이 발달하면 각 웰에 50 마이크로리터의 정지 용액을 추가하고 450 나노미터에서 흡광도를 측정합니다.A.actinomycetemcomitans 배양 체퍼넌트의 크기 배제 컬럼 정화 후, 이 균주에 의해 생성된 크고 작은 외부 막 소포에 대응하는 두 개의 뚜렷한 지질 봉우리가 관찰되었다. 샘플 분획의 ELISA 분석은 독소가 주로 큰 외부 막 소포의 하위 집단과 연관되어 있음을 밝혔다. 면역 얼룩 분석은 이 접근이 ELISA 보다는 보다 더 적게 민감하다는 것을 나타내는 유사하지만 더 시끄러운 결과를 주었습니다.관찰된 바와 같이, 이 크로마토그래피 기술은 외부 막 소포의 준비에서 상당한 양의 무료 단백질을 제거할 수 있습니다. 그러나, 총 단백질 농도 반드시 특정 단백질의 농도와 상관 관계가 되지 않습니다 주의 하는 것이 중요 하다. 기둥의 포장 및 실행 중에 거품을 피하고 기둥이 건조되는 것을 방지하는 것이 중요합니다.다이나믹 광 산란, 입자 추적 및 이두산 법은 분리된 외부 멤브레인 소포의 크기 및 기타 특성을 결정하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 수행할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

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의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

연구

생체공학

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

막 척추 : 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별 할 수있는 생화학 적 도구<em&gt; 생체</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

정량화 및 조정 가능한 저항 펄스 감지 기능을 사용하여 세포 외 소포의 크기 프로파일 링

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

발광 공명 에너지는 포유 동물 세포에 표현 막 단백질의 구조 변화를 연구에 전송

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

미세 유체 정밀 작은 볼륨 샘플 처리를위한 플랫폼 및 음향 마이크로 디바이스로 구분 생물 입자 크기의 사용

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate Poly(Lactic Acid) Scaffolds with Graded Pore Size

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate PolyLactic Acid Scaffolds with Graded Pore Size

손쉬운 및 환경 친화적 인 경로는 그레이드 기공 크기와 폴리 (젖산) 공사장 공중 발판을 제조

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

운동 조건의 혈청을 이용한 인대 구조의 치료 : Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...