Name: rapid freezing using sandwich freezing device for good ultrastructural preservation of biological specimens in electron microscopy
Uploaded: 2021-07-19T14:00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy at JoVE.com

ملاحظة: وافقت لجنة أخلاقيات البحوث الطبية الحيوية التابعة لكلية الدراسات العليا للطب، جامعة شيبا (3085) على بروتوكول الدراسة الخاص بالعينات البشرية. 2- إن التيتروكسيد أوزميوم مادة كيميائية خطيرة؛ وينبغي التعامل معها ارتداء قفازات في غطاء محرك السيارة الدخان. الشكل 1 يظهر جهاز تجميد شطيرة والأدوات اللازمة28. ويبين الشكل 2 المواد اللازمة لإجراء تجارب تجميد الشطائر. تمتلئ قارورة الزجاج مع الأسيتون التي تحتوي على tetroxide osmium والاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام (الشكل 2B). الأقراص النحاسية هي 3 ملم في القطر، مع عدم وجود ثقوب، لديها حرف على جانب واحد، وتتوفر تجاريا(الشكل 2C).
1. التجميد السريع لتعليق الخلايا من أجل استبدال التجميد
ملاحظة: يظهر الإجراء بأكمله في الشكل 3.
<ol><li>خلايا<ol>
<li>استخدام تعليق الخلية من البكتيريا والخميرة (الشكل 2A)، والخلايا المستزرعة، والخلايا المعزولة لتجميد شطيرة. ملاحظة: يمكن استخدام كل من الخلايا الحية والغلوتارالدهيد الثابتة28.</li>
	</ol></li>
	<li>إعداد البروبان السائل ملاحظة: استخدام cryogloves ونظارات واقية عند التعامل مع النيتروجين السائل. وبما أن البروبان متفجر، ينبغي الحرص على عدم استخدام الحرائق في نفس الغرفة، وينبغي إبقاء النوافذ مفتوحة.<ol>
<li>ملء حاوية النيتروجين السائل من SFD مع النيتروجين السائل (الشكل 4A). ملء حاوية البروبان السائل مع البروبان السائل عن طريق إدخال غاز البروبان باستخدام فوهة غرامة (الشكل 4B، C). تسريع تماسك البروبان باستخدام شريط معدني تبريد (الشكل 1 والشكل 4D، ه).</li>
	</ol></li>
	<li>إعداد أقراص النحاس<ol>
<li>وضع أقراص النحاس على زجاج الشريحة مع عدم وجود حرف الجانب لأعلى (الشكل 2D) وعلاج مع توهج التفريغ في 10 السلطة الفلسطينية، 400 فولت، 1 مأ لمدة 30 ق (الشكل 4F،G) لجعل سطح القرص hydrophilic باستخدام جهاز بصق أيون30.</li>
	</ol></li>
	<li>شطيرة وتجميد يغرق من تعليق الخلية<ol>
<li>نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 2 مل (الشكل 5A) والطرد المركزي في 2,900 × غرام لمدة 10 ق في درجة حرارة الغرفة (الشكل 5B, C). إزالة supernatant، وتعليق بيليه للحصول على تعليق سميكة (انظر المناقشة).</li>
		<li>ضع كمية صغيرة من تعليق الخلية (~ 0.02 ميكرولتر) على قرص نحاسي(الشكل 5D-F)،قم بتغطيتها بقرص نحاسي آخر(الشكل 5G)،والتقط الأقراص باستخدام ملاقط(الشكل 5H). ملاحظة: لقياس ~ 0.02 ميكرولتر من تعليق الخلية، لاحظ 0.1 قطرات μL من التعليق تحت المنظار المجسم وتقسيمها إلى قطرات التي هي1/5th من هذا الحجم.</li>
		<li>جعل بئر في وسط البروبان الصلبة مع شريط معدني رقيقة (الشكل 5I). تعيين ملاقط في SFD وتجميدها بسرعة عن طريق الضغط على زر الحقن للجهاز (الشكل 5J، ك). ملاحظة: يجب الحرص على عدم تجفيف العينات وعدم وضع القرصين تماما فوق بعضهما البعض (وإلا، فإن فصلها سيصبح صعبا جدا في الخطوة التالية).</li>
	</ol></li>
	<li>شطيرة وتجميد الأنسجة الحيوانية والبشرية<ol>
<li>استخدام الأنسجة الحيوانية والبشرية (~ 0.5 مم × 0.5 مم × 1.5 مم) ثابتة في 2.5٪ غلوتارالدهيد-0.1 متر عازل فوسفات (الرقم الحموضة 7.4) (الشكل 6A، B). شريحة لهم في 0.1- إلى 0.2- مقطع سميك مم مع شفرة حلاقة تحت مجسم(الشكل 6C,D).<ol>
<li>ضع قطرة صغيرة (~ 0.02 ميكرولتر) من محلول الجلوتارالدهيد على قرص نحاسي(الشكل 6E، F). ثم استخدم الملاقط لوضع قطعة من الأنسجة في الجلوتارالدهيد على القرص النحاسي(الشكل 6G، H) وتغطيتها بقرص نحاسي آخر(الشكل 6I-K).</li>
			<li>تجميد بسرعة الأقراص مع الأنسجة في البروبان ذوبان SFD، كما هو موضح في القسم 1.4(الشكل 5J،K). ملاحظة: كما glutaraldehyde مادة كيميائية خطيرة، ينبغي التعامل معها ارتداء قفازات في غطاء محرك السيارة الدخان. لا ينبغي غسل الأنسجة مع المخازن المؤقتة عند وضعها على قرص نحاسي ولكن أبقى غارقة في محلول الجلوتارالدهيد لأن الجلوتارالدهيد له تأثير مضادللتجميد 1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>تجميد استبدال مع أسيتون أوسميوم<ol>
<li>نقل الأقراص إلى النيتروجين السائل في حمام عمل (الشكل 7A، ب). باستخدام زوج من ملاقط تبريد في النيتروجين السائل، فصل الأقراص من بعضها البعض لفضح العينة (الشكل 7C-E).</li>
		<li>ضع الأقراص مع الخلايا في قارورة زجاجية(الشكل 7F)التي تمتلئ 1 مل من الأسيتون تحتوي على 2٪ من التيتروكسيد osmium (الشكل 2B) التي تم وضعها في النيتروجين السائل وseded (الشكل 4H).</li>
		<li>نقل الأقراص إلى الفريزر العميق والاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام لتجميد استبدال الخلايا (الشكل 3). نقع ملاقط المستخدمة في الماء في درجة حرارة الغرفة لتدفئتها (الشكل 7G) لتجميد العينات التالية. ملاحظة: يجب أن تكون ملاقط للتعامل مع العينة دافئة (درجة حرارة الغرفة) لأن الملاقط الباردة قد تجمد العينة قبل التجميد السريع ، مما يؤدي إلى تكوين بلورات الثلج.</li>
	</ol></li>
	<li>عينة الاحترار والتضمين<ol>
<li>جلب تدريجيا العينات إلى درجة حرارة الغرفة (2 ساعة في -20 درجة مئوية، 2 ساعة في 4 درجة مئوية، و 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، الشكل 3 والشكل 8A)،ونقل الأقراص إلى أنابيب بلاستيكية 2 مل التي تمتلئ 1 مل من الأسيتون (الشكل 3 والشكل 8B، C).</li>
		<li>إعداد راتنج الايبوكسي عن طريق خلط الكواشف في حاوية بلاستيكية يمكن التخلص منها باستخدام ستيرر(الشكل 8D-F).</li>
		<li>تبادل الأسيتون في الخطوة 1.7.1 على التوالي مع 30٪ الراتنج (في الأسيتون)، 60٪ الراتنج، و 90٪ الراتنج في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة لكل منهما. ثم تبادل الراتنج 90٪ مع 100٪ الراتنج في 37°C بين عشية وضحاها. وأخيرا، تضمين العينات في راتنج 100٪ (الشكل 8G-J) في قالب تضمين السيليكون، وبوليمرة لهم في 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة (الشكل 3). ملاحظة: يجب أن تظل العينات متصلة بالأقراص النحاسية طوال الإجراء بأكمله (لتسهيل عملية القسمة). لا ينصح باستخدام جهاز دوار أو اهتزاز أثناء عملية التضمين لأنها تساهم قليلا في اختراق الراتنج في الخلية. وعلاوة على ذلك، فإن الاهتزاز من الجهاز يؤدي في بعض الأحيان العينات لفصل من الأقراص النحاسية. الحضانة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها من شأنه أن يسرع اختراق الراتنج في الخلية بسبب الطاقة الحرارية (الراتنج لن يبوليمر لأنه لا يحتوي على أي مسرع).</li>
	</ol></li>
	<li>تقليم كتل العينة<ol>
<li>إخراج كتل بلمرة من قوالب تضمين السيليكون (الشكل 9A). اكتب رقم العينة على الكتلة (الشكل 9B).</li>
		<li>إزالة أقراص النحاس من كتلة مع شفرة حلاقة (الشكل 9C، D) وتقليم العينات جزءا لا يتجزأ من سطح الكتلة إلى 0.7 ملم × 0.7 ملم باستخدام شفرة التشذيب بالموجات فوق الصوتية ( الشكل9E) وشفرات الحلاقة (الشكل 9F-H) تحت مجسم31.</li>
		<li>تعيين كتلة في حامل عينة من ultramicrotome (الشكل 9I) وقطع وجه كتلة بسلاسة مع سكين تقليم الماس (الشكل 9J، ك).</li>
	</ol></li>
	<li>قطع أقسام فائقة النحافة<ol>
<li>إزالة كتلة من ultramicrotome (الشكل 10A)31، تعيينها في مجسم ، وتقليم مزيد من 0.2 ملم × 0.3 ملم مع شفرة حلاقة (الشكل 10B، C).</li>
		<li>تطبيق النيوبرين على الشبكات لجعلها لاصقة (الشكل 10D). تعيين كتلة مرة أخرى على ultramicrotome، وتغطية ultramicrotome مع غطاء من البلاستيك (الشكل 10E)31، وقطع 50-70 نانومتر سميكة أقسام (الشكل 10F-H).</li>
		<li>استرداد المقاطع باستخدام حلقة (الشكل 10I)، جبل لهم على 300 أو 400 شبكات النحاس شبكة تعامل مع النيوبرين، وتجفيفها (الشكل 10J).</li>
	</ol></li>
	<li>تلطيخ المقاطع والمراقبة تحت المجهر الإلكتروني<ol>
<li>تعيين الشبكات مع أقسام في الأخدود من أنبوب سيليكون نصف (الشكل 11A)31، ونقع في محلول خلات أورانيل والرصاص سيترات لمدة 3 دقائق لكل لتلطيخ (الشكل 11B-E)32.</li>
		<li>للخميرة والعينات الفطرية، ووضع الشبكات على ورقة تصفية (4 ملم × 4 ملم)، والتقاطها مع ملاقط، وتغطيتها مع البلازما البوليمرات النفثالين فيلم33 على سطح الماء (الشكل 11F،G). إدراج الشبكات في المجهر الإلكتروني ومراقبة في 100 كيلو فولت (الشكل 11H، I).</li>
	</ol></li>
</ol>2. التجميد السريع للفيروسات والجزيئات الكلية
<ol><li>إعداد الإيثان السائل ملاحظة: استخدام cryogloves ونظارات واقية عند التعامل مع النيتروجين السائل. وبما أن الإيثان متفجر، ينبغي الحرص على عدم استخدام الحرائق في نفس الغرفة، وينبغي إبقاء النوافذ مفتوحة. يستخدم الإيثان لأنه يتبخر في المجهر الإلكتروني في حين أن البروبان لا يفعل ذلك.<ol>
<li>ملء حاوية النيتروجين السائل من SFD مع النيتروجين السائل. ملء حاوية الإيثان السائل مع الإيثان السائل عن طريق إدخال غاز الإيثان من خلال فوهة غرامة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد وتجميد سريع للشبكات الصغيرة والعينات<ol>
<li>جعل كلا الوجهين من hydrophilic microgrids عن طريق التعامل معها مع توهج التفريغ (10 السلطة الفلسطينية، 400 V، 1 MA) باستخدام جهاز بصق أيون30.</li>
		<li>تعيين الشبكة الصغرى في SFD وتطبيق 2 ميكرولتر من الفيروس أو تعليق الجزيئية الكلية (1 ملغ البروتين / مل) على الشبكات الدقيقة. إزالة السائل الزائد باستخدام ورقة تصفية وتجميد بسرعة microgrid عن طريق الضغط على زر الحقن للجهاز.</li>
	</ol>
</li>
	<li>وضع الشبكة الصغرى المجمدة في حامل نقل التبريد والمراقبة تحت المجهر الإلكتروني<ol>
<li>نقل الشبكات الدقيقة المجمدة في النيتروجين السائل، وضعت في حامل نقل التبريد تبريده في درجة حرارة النيتروجين السائل مسبقا، ومراقبة تحت المجهر الإلكتروني في درجة حرارة منخفضة34.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

وتستند المناقشة التالية إلى أكثر من 120 تجربة استبدال تجميد تجميد السندويشات على أكثر من 000 1 عينة وأكثر من 70 تجربة مجهرية لتجميد التجميد والإلكترونات على أكثر من 75 عينة أجريت على مدى 36 عاما.
معدل النجاح لتجميد جيدة عن طريق تجميد شطيرة يعتمد معدل النجاح في تحقيق تجميد جيد على العينات. Saccharomyces cerevisiae (الخميرة) الخلايا المستزرعة في المتوسط YPD (1٪ استخراج الخميرة، 2٪ بيبتون، 2٪ dextrose) أعطى ما يقرب من 100٪ نجاح لتجميد جيدة دون تشكيل الكريستال الجليد10،11،15،35،36. أنواع الخميرة الأخرى، بما في ذلك شيزوساككروميس37،38،39،كريبتوكوس14،40،41،42،43،44،45، إكسوفيالا13،41،46،47،48، 49، فوساريوم50،51،52، أوريوباسيديوم53، كانديدا54،55، فيلوميس56، أسبرجر 57، وتريتشوسبورون ، كما أظهرت تجميد جيدة. البكتيريا، بما في ذلك البكتيريا الفطرية58و59 و E. القولونية16،وأظهرت أيضا تجميد جيدة. وأظهرت الخلايا المستزرعة والخلايا الحيوانية المعزولة تجميد جيد لكل من الخلايا الحية والغلوتارالدهيد الثابتة1،25،26،27،60. Glutaraldehyde ثابتة الحيوانات والأنسجة البشرية شرائح إلى 0.1 إلى 0.2 ملم سمك أظهرت أيضا تجميد جيدة معظم الوقت1,28.
شروط لتجميد جيد استخدام الخلايا فقط في مرحلة النمو المناسبة وحالة. يجب أن تكون الخلايا في الثقافة في المرحلة الأسية. تطبيق كميات صغيرة جدا من تعليق الخلية من العينات المركزة (لS. cerevisiae، ~ 0.02 ميكرولتر من 3-5 × 109 خلايا / مل) على القرص النحاسي. يجب أن تكون شرائح الغلوتارالدهيد الثابتة من الأنسجة الحيوانية أو البشرية صغيرة جدا (يفضل أن تكون 0.3 مم × 0.3 مم × 0.1 مم). لأن قطع شرائح الأنسجة سميكة 0.1 ملم من الصعب، شريحة العديد من الأنسجة واختيار شرائح رقيقة ونصف شفافة. العمل بسرعة ولكن بعناية، ولا تدع العينات تجف. في التقاط الأقراص النحاسية مكدسة مع ملاقط، لا تضغط على الأقراص من الصعب جدا لتجنب سحق الخلايا والأنسجة. تحميل العينات هو الخطوة الأكثر أهمية لتجميد ناجحة، والظروف المطلوبة هي نفس الشروط لتجميد جيدة لتجميد الضغط العالي. القراء يجب أن تشير إلى استعراض ممتاز من قبل ماكدونالد61.
تطبيقات أخرى تعرض هذه الورقة ميكروجرافات إلكترونية للبكتيريا والخميرة والخلايا المستزرعة والخلايا الحيوانية المعزولة والأنسجة البشرية وجسيمات الفيروس. لاحظنا تجميد جيد للطحالب البحرية الثابتة الغلوتارارالدهايد. ومع ذلك، تم تدمير هياكل الخلية من الطحالب الخضراء المياه العذبة الحية من قبل تشكيل الكريستال الجليد. خلط الخلايا مع 20٪ ألبوم مصل البقر (BSA) يضمن أن البنية الفوقية كانت محفوظة بشكل جيد مع عدم وجود ضرر بلوري جليدي. وكان استخدام 20٪ BSA مفيدة أيضا للحفاظ على البنية الفوقية للخلايا ساق من الفطر. التجارب على تجميد الخلايا النباتية والأنسجة عن طريق تطبيق 20٪ BSA جارية. على الرغم من أن المسح المجهري الإلكتروني لعينات التجميد التجميد البديلة لم تتم محاولة، وقد تم الإبلاغ عن مراقبة هياكل الخلايا المحفوظة جيدا سابقا9.
ملاحظات حول طريقة تجميد الشطائر من الأفضل ملاحظة البنية الفوقية للخلايا القريبة من الأصل من خلال التجميد السريع واستبدال الخلايا الحية بالتجميد. يمكن تجنب تشكيل بلورة الجليد مع SFD عن طريق الحد من سمك الخلايا إلى ≤30 ميكرومتر1. إصلاح الأنسجة مع الجلوتارالدهيد غالبا ما تسفر عن الحفاظ على أفضل من بنية الخلية لمراقبة الخلايا المستزرعة تعليق لأن تثبيت الجلوتارالدهيد يجعل بنية الخلية أكثر صلابة ويمنع التغيرات الهيكلية المفرطة المحتملة أثناء جمع والطرد المركزي من الخلايا الحية1. كما يسمح تثبيت الغلوتاراندهيد بتمديد عمق التجميد إلى 0.2 مم1، على غرار ما حققته طريقة التجميد عالي الضغط (HPF). لذلك ، يمكن استبدال آلة HPF ب SFD للتجميد العميق للأنسجة الحيوانية والبشرية.
لأن الأنسجة glutaraldehyde الثابتة يمكن تخزينها لأكثر من 2 سنوات28، يمكن إجراء تجميد شطيرة وفقا لراحة المستخدم. إصلاح الأنسجة مع الجلوتارالدهايد يسهل أيضا تقسيم الأنسجة لأن الأنسجة تصبح أكثر صلابة مع التثبيت. على عكس جهاز HPF ، يمكن استخدام SFD للتجميد السريع للفيروسات للفحص المجهري للإلكترون المبرد وللبكتيريا والخلايا النواة. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع جهاز HPF، فإن SFD صغيرة ومحمولة وأقل تكلفة، ويمكن الحصول عليها من قبل المزيد من المختبرات. نأمل أن تساعد هذه السمات من SFD المزيد من المختبرات تحقيق أهدافها البحثية28.
ملامح مورفولوجيا الطبيعية للخلايا هياكل الخلية هي في حالتها الطبيعية إذا كانت تظهر المظهر التالي: هياكل الغشاء من الغشاء الخارجي (الشكل 12A, B), غشاء البلازما ( الشكل12B,C; الشكل 13A-D; والشكل 14E), المغلف النووي (الشكل 12C, الشكل 13B-D, والشكل 14D-E), الميتوكوندريا (الشكل 12C, الشكل 13C, والشكل 14D), وvacuoles (الشكل 12C) تظهر ملامح سلسة. النواة و vacuoles دائرية تقريبا (الشكل 12C). الريبوسومات تظهر مظهر واضح الإلكترون الكثيفة مع قطر ~ 20 نانومتر (الشكل 12B, C; الشكل 13C؛ والشكل 14D). السيتوبلازم هو إلكترون لوسنت (الشكل 12B، C؛ الشكل 13C؛ والشكل 14D).
تأثير تثبيت الغلوتارارالدهايد على مورفولوجيا الخلايا تم إجراء تثبيت الغلوتارانديهيد للأنسجة الحيوانية أو البشرية قبل تجميد السندويشات للحصول على بنية فائقة خالية من الكريستال الجليدي. تظهر الصور الدقيقة التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة صورا واضحة بشكل رائع مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها عن طريق التجميد السريع للأنسجة الحية (الشكل 14)1. الدراسات على خلايا الخميرة، والكائنات الحية الدقيقة في أعماق البحار، والخلايا المستزرعة تبين أن تشوه ultrastructure يرجع أساسا إلى تثبيت التيتروكسيد أوسميوم والجفاف عن طريق الإيثانول في درجة حرارة الغرفة1،17،18،28. الصغيرة ذكرت أيضا أنه على الرغم من تثبيت الغلوتارالدهيد لا يدمر تنظيم أكتين في الخلايا الليفية المستزرعة، تثبيت التيتروكسيد أوسميوم والجفاف عن طريق الأسيتون أو الإيثانول في درجة حرارة الغرفة تدمير actin المنظمة62.
ومن ثم، ينبغي إجراء دراسة مفصلة عن آثار تثبيت الجلوتارالدهيد على مورفولوجيا الخلايا. Ohno وضعت في الجسم الحي طريقة cryofixation حيث يتم تجميد الأنسجة الحية بسرعة دون وقف إمدادات الدم63. تم استبدال الأنسجة بالتجميد وتضمينها في راتنج الايبوكسي ، ولوحظت أقسام فائقة النحافة. وأظهرت الصور المجهرية الإلكترونية البنية الفوقية الأقرب إلى الأصلية للأنسجة الحية مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها عن طريق الجفاف الكيميائي التقليدي والتجمد السريع للأنسجة الطازجة غير المثبتة. لذلك، قد يكون من المثير للاهتمام مقارنة البنية الفائقة التي تم الحصول عليها عن طريق استبدال تثبيت تجميد الغلوتارالدهيد (الطريقة الحالية) وتلك التي يتم استبدالها في الجسم الحي تجميد التبريد لدراسة آثار تثبيت الجلوتارارالدهيد.
مراعاة البيئة وزيادة الكفاءة التجريبية نحن نستخدم أنابيب بلاستيكية 2 مل لاستبدال الراتنج. مل واحد من الراتنج المخفف يكفي لكل خطوة استبدال. يمكن التخلص من الأنابيب البلاستيكية المستخدمة بعد كل تجربة. وهذا يمكن أن يوفر الوقت والجهد لغسل قوارير الزجاج عندما يتم استخدامها لاستبدال الراتنج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام محلول خلات أورانيل مرارا وتكرارا لقسمتلطيخ 32. بعد تلطيخ المقاطع ، يمكن حفظ محلول خلات أورانيل وإعادة استخدامه. وبما أن خلات الأورانيل مادة مشعة، فإن إعادة استخدامها تساعد على تجنب توليد النفايات وتساهم في حماية البيئة.
البلازما البوليمرات فيلم النفثالين البلازما بلمرة فيلم النفثالين هو فيلم الكربون ثلاثي الأبعاد البوليمرات المصنوعة من غاز النفثالين عن طريق بلازما البلمرة تحت توهجالتفريغ 33. الفيلم مرن ضد قصف الإلكترونات والمواد الكيميائية ، نظيفة جدا وشفافة ضد الإلكترونات ، ولها سطح مستو وبنية غير متبلورة. وهكذا، فإن فيلم النفثالين البلازمي البلمرة، وهو متاح تجاريا، ممتاز ويوصى به كفيلم دعم.

المجهر الإلكتروني هو أداة قوية لدراسة البنية الفوقية للخلايا. وقد استخدم التثبيت الكيميائي مع إجراءات الجفاف التقليدية لمراقبة البنية الفوقية للخلايا والأنسجة. ومع ذلك، لا تحافظ هذه الطريقة بشكل كاف على البنية الفوقية للخلايا، وعادة ما يتم ملاحظة القطع الأثرية واستخراج محتويات الخلية. التجميد السريع واستبدال تجميد الخلايا والأنسجة هي بدائل أفضل للحفاظ على بنية الخلية.
وقد استخدمت ثلاث طرق رئيسية لتجميد الخلايا بسرعة1: 1) يتم تنفيذ يغرق تجميد العينات في cryogen تبريد, مثل البروبان, واستخدمت منذ أوائل 1950s2; 2) يتم إجراء تجميد كتلة معدنية باردة من قبل الخلايا والأنسجة انتقد بسرعة على كتلة معدنية تبريدها مع النيتروجين السائل أو الهيليوم السائل3،4؛ و 3) ويتم تجميد الضغط العالي عن طريق تجميد الخلايا والأنسجة مع النيتروجين السائل تحت ضغط عال5،6،7.
تجميد الساندويتش هو نوع من تجميد الغطس الذي تقوم به sandwiching المواد البيولوجية رقيقة بين اثنين من الأقراص النحاس وتجميد بسرعة لهم عن طريق الغطس في البروبان السائل8،9،10. في هذه الطريقة ، يتم تبريد العينات الرقيقة جدا (سمكها بضعة ميكرومترات) بسرعة مع cryogen باستخدام معدن يحتوي على الموصلية الحرارية الجيدة من كلا الجانبين. وهكذا، فإن هذه الطريقة تزيل الحرارة بشكل فعال من العينات، مما يجعل من الممكن تجميد الخلايا بشكل ثابت دون تلف بلوري جليدي. تجميد الشطائر، يليه تجميد استبدال الخميرة الحية والخلايا البكتيرية، ويكشف عن البنية الفائقة الطبيعية للخلايا10،11،12،13،14،15،16.
في الآونة الأخيرة، تم العثور على هذه الطريقة لتكون مفيدة للحفاظ على صور الخلايا واضحة من الكائنات الحية الدقيقة glutaraldehyde الثابتة17،18،19،20،21،22،23،24، الخلايا المستزرعة25،26،27، والخلايا والأنسجة البشرية1،28 . على الرغم من أن هذه الدراسات قد أجريت باستخدام جهاز تجميد شطيرة مصنوعةيدويا 29، وكانت التطبيقات لدراسات أخرى في مختبرات أخرى محدودة ، فقد تم تصنيع جهاز تجميد ساندويتش جديد (SFD)28 وهو متاح الآن تجاريا.
وتبين هذه الورقة كيفية استخدام SFD للتجميد السريع للعينات البيولوجية، بما في ذلك البكتيريا والخميرة والخلايا المستزرعة والخلايا المعزولة والأنسجة الحيوانية والبشرية والفيروسات. كما يظهر إعداد عينات للتقطيع فائقة بعد التجميد السريع ، وكذلك إجراءات استبدال التجميد ، وتضمين الراتنج ، وتقليم الكتل ، وقطع الأجزاء فائقة التقنية ، واستعادة المقاطع ، والتلطيخ ، وتغطية الشبكات مع أفلام الدعم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sandwich Freezing Device</td>
			<td>Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan</td>
			<td>MW-SFD-01</td>
			<td>with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL glass vials</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Scintillation counter vials for fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>3004</td>
			<td>0.1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer</td>
			<td>Sanyo Co. Ltd., Osaka</td>
			<td>MDF-C8V1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper disk</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged razor blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Feather, FAS-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-edged razor blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Feather, FA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shredded board</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Several pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers with polystyrene foam</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>One pair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>3052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propane gas</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Cryogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion sputter apparatus</td>
			<td>Hitachi high technologies, Tokyo</td>
			<td>Hitachi E102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For 1 mL, 200 &#956;L, and 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>Capsulefuge, PMC-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo et al.</td>
			<td>-</td>
			<td>SMZ 645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo et al.</td>
			<td>SM-LW 61 Ji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic container</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>50 mL and 200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Cryogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic syringes</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>340</td>
			<td>Quetol 812 set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon embedding mold</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>4217</td>
			<td>7 mm in diameter, 13 mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubater</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For 37 &#176;C and 60 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Tilting mechanism equipped, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Trimming Blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>5240</td>
			<td>EM-240, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna</td>
			<td>Ultracut S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2633, 2634</td>
			<td>300 mesh, 400 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Neoprene W solution</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect Loop</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2351</td>
			<td>Fot retrieving sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half Tube for section staining</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>463</td>
			<td>Refer to this pape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo</td>
			<td>DISMIC-03CP</td>
			<td>Cellulose acetate, 0.45 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid freezing using sandwich freezing device for good ultrastructural preservation of biological specimens in electron microscopy

وقد استخدم التثبيت الكيميائي لمراقبة البنية الفوقية للخلايا والأنسجة. ومع ذلك، لا يحافظ هذا الأسلوب بشكل كاف على البنية الفوقية للخلايا؛ وعادة ما يلاحظ القطع الأثرية واستخراج محتويات الخلية. التجميد السريع هو بديل أفضل للحفاظ على بنية الخلية. وقد استخدمت تجميد شطيرة من الخميرة الحية أو البكتيريا تليها تجميد استبدال لمراقبة ultrastructure الطبيعية الرائعة من الخلايا. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام تجميد ساندويتش الخلايا المستزرعة الثابتة بالجلوتارالدهيد أو الأنسجة البشرية للكشف عن البنية الفائقة للخلايا والأنسجة. 
وقد أجريت هذه الدراسات حتى الآن باستخدام جهاز لتجميد السندويشات المصنوع يدويا، وكانت التطبيقات المقدمة للدراسات في مختبرات أخرى محدودة. وقد تم مؤخرا جهاز تجميد شطيرة جديدة ملفقة ومتاحة الآن تجاريا. وتبين هذه الورقة كيفية استخدام جهاز تجميد الساندويتشات للتجميد السريع للعينات البيولوجية، بما في ذلك البكتيريا والخميرة والخلايا المستزرعة والخلايا المعزولة والأنسجة الحيوانية والبشرية والفيروسات. كما يظهر إعداد عينات للتقطيع فائقة بعد التجميد السريع وإجراءات استبدال التجميد ، وتضمين الراتنج ، وتقليم الكتل ، وقطع الأجزاء فائقة التقنية ، واستعادة المقاطع ، والتلطيخ ، وتغطية الشبكات بأحلام الدعم.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy at JoVE.com

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

هنا نعرض كيفية استخدام جهاز تجميد شطيرة للتجميد السريع للعينات البيولوجية، بما في ذلك البكتيريا والخميرة والخلايا المستزرعة والخلايا المعزولة والأنسجة الحيوانية والبشرية، والفيروسات. كما نعرض كيفية إعداد العينات للقسمة فائقة بعد التجميد السريع.

التجميد السريع باستخدام جهاز تجميد ساندويتش للحفاظ على البنية الفائقة جيدة من العينات البيولوجية في المجهر الإلكترون

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

من أجل مراقبة بنية فائقة طبيعية رائعة من الخلايا، فمن الضروري لإصلاح الخلايا عن طريق التجميد السريع. تجميد شطيرة هي واحدة من أفضل الطرق لتجميد الخلايا دون تشكيل بلورات الجليد. يوضح هذا البروتوكول استخدام جهاز تجميد الساندويتشات ، ويصف أيضا إجراء صنع أقسام رقيقة جدا من العينات البديلة بالتجميد بعد تجميد السندويشات.البدء في إعداد البروبان السائل عن طريق ملء حاوية النيتروجين السائل من جهاز تجميد شطيرة أو SFD مع النيتروجين السائل. ملء حاوية البروبان السائل مع البروبان السائل عن طريق إدخال غاز البروبان باستخدام فوهة غرامة. تسريع تماسك البروبان باستخدام شريط معدني مبرد.لإعداد نوع مسطح وأقراص النحاس نوع السلة، وضعها على شريحة زجاجية مع عدم وجود جانب حرف حتى وعلاج مع توهج التفريغ في 10 باسكال، 400 فولت، ميلي أمبير واحد لمدة 30 ثانية لجعل سطح القرص hydrophilic باستخدام جهاز مراقب أيون. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي اثنين ملليلتر والطرد المركزي في 2, 900 مرات G لمدة 10 ثانية في درجة حرارة الغرفة. إزالة supernatant وتعليق بيليه للحصول على تعليق سميكة.ضع كمية صغيرة أو حوالي 0.02 ميكرولتر من تعليق الخلية على قرص نحاسي. تغطية ذلك مع قرص نحاسي آخر والتقاط الأقراص مع ملاقط. جعل بئر في وسط البروبان الصلبة مع شريط معدني رقيقة.تعيين ملاقط في SFD وتجميدها بسرعة عن طريق الضغط على زر الحقن للجهاز. نقع ملاقط المستخدمة في الماء درجة حرارة الغرفة لتسخينها لتجميد العينات التالية. استخدام الأنسجة الحيوانية والبشرية ثابتة في 2.5٪ غلوتارالدهيد، 0.1 ضرس الفوسفات العازلة من الحموضة 7.4.شريحة لهم إلى 0.1 إلى 0.2 ملليمتر أقسام سميكة مع شفرة حلاقة تحت المجهر ستيريو. ضع قطرة صغيرة من محلول الجلوتارالدهيد على قرص النحاس من نوع السلة ، ثم استخدم الملاقط لوضع قطعة من الأنسجة في الجلوتارالدهيد على القرص النحاسي وتغطيتها بالقرص النحاسي المسطح. تجميد بسرعة الأقراص مع الأنسجة في البروبان ذوبان SFD كما هو موضح في وقت سابق.نقل الأقراص إلى النيتروجين السائل في حمام العمل. باستخدام زوج من الملاقط المبردة في النيتروجين السائل، فصل الأقراص من بعضها البعض لفضح العينة. ضع الأقراص مع الخلايا في قارورة زجاجية مليئة ميليلتر واحد من الأسيتون يحتوي على 2٪ من التيتروكسيد أوسميوم التي تم وضعها في النيتروجين السائل وتماسكها.نقل الأقراص إلى ثلاجة عميقة والاحتفاظ بها في ناقص 80 درجة مئوية لمدة يومين إلى أربعة أيام لتجميد استبدال الخلايا. جلب تدريجيا العينات إلى درجة حرارة الغرفة عن طريق احتضانها لمدة ساعتين في ناقص 20 درجة مئوية، ساعتين في أربع درجات مئوية، و 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل الأقراص إلى اثنين من أنابيب بلاستيكية ملليلتر التي تمتلئ ملليلتر واحد من الأسيتون.إعداد راتنج الايبوكسي عن طريق خلط الكواشف في وعاء بلاستيكي يمكن التخلص منه باستخدام ستيرر. تبادل الأسيتون على التوالي مع 30٪ الراتنج في الأسيتون، 60٪ الراتنج و 90٪ الراتنج في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة لكل منهما، ثم تبادل الراتنج 90٪ مع 100٪ الراتنج في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. وأخيرا، تضمين العينات في الراتنج 100٪في قالب تضمين السيليكون وبوليمرة لهم في 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.إخراج كتل البوليمرات من قوالب تضمين السيليكون وكتابة رقم العينة على الكتلة. إزالة أقراص النحاس من كتلة مع شفرة حلاقة وتقليم العينات جزءا لا يتجزأ من سطح الكتلة باستخدام شفرة التشذيب بالموجات فوق الصوتية وشفرات الحلاقة تحت المجهر ستيريو. بعد ذلك، تطبيق الشريط على تشاك كتلة العينة وحامل العينة من microtome وقطع الشريط عند الحدود.إزالة كتلة من microtome فائقة، تعيينها في المجهر ستيريو، وتقليم كذلك إلى 0.2 ملليمتر في 0.3 ملليمتر باستخدام شفرة حلاقة. تطبيق النيوبرين على الشبكات لجعلها لاصقة. أعد ضبط الكتلة على الميكروتومي الفائق عن طريق محاذاة الأجزاء المسجلة.تغطية microtome فائقة مع غطاء من البلاستيك وقطع 50 إلى 70 مقطعا سميكة نانومتر. استرداد المقاطع باستخدام حلقة. جبل لهم على 300 أو 400 شبكات النحاس شبكة تعامل مع النيوبرين وتجفيفها.تعيين الشبكات مع أقسام في الأخدود من أنبوب سيليكون نصف. نقع العينات في محلول خلات أورانيل لمدة ثلاث دقائق. جمع محلول أورانيل المستخدمة وتخزينها في حقنة.غسل العينات في أنبوب نصف مع طائرة المياه، ثم نقع العينات في سترات الرصاص لمدة ثلاث دقائق. بالنسبة لعينات الخميرة والفطريات ، ضع الشبكات على ورقة تصفية ، والتقطها بالملاقط ، وغطيها بفيلم النفثالين البلازمي على سطح الماء. أدخل الشبكات في حامل العينة من المجهر الإلكتروني ، ثم أدخل حامل العينة في المجهر الإلكتروني ولاحظ في 100 كيلوفولت.وأظهرت أقسام رقيقة جدا من كل من الإشريكية القولونية وS.cerevisiae عندما لوحظ تحت المجهر الإلكتروني مورفولوجيا الطبيعية والصور واضحة. ولوحظت أقسام رقيقة جدا من الخلايا المستزرعة المجمدة بسرعة باستخدام SFD تحت المجهر الإلكتروني. كانت صور الأجزاء الرقيقة جدا من جلد الإنسان واضحة جدا وأظهرت مورفولوجيا طبيعية.تم تجميد الجسيمات الأساسية لفيروس التهاب الكبد B بسرعة مع SFD ولاحظها المجهر الإلكتروني المبرد. أهم شيء هو أن نتذكر أنه يجب تطبيق كمية صغيرة جدا من الخلايا على أقراص النحاس بحيث يتم منع تشكيل الكريستال الجليد عند التجميد. من خلال إصلاح الأنسجة الحيوانية مع الجلوتارالدهيد مسبقا ، يتم تحقيق تجميد جيد على عمق حوالي 200 ميكرومتر على غرار العمق الذي تحققه تجميد الضغط العالي.تمهد هذه التقنية الطريق للباحث لمراقبة البنية الطبيعية الرائعة للخلايا بسهولة بتكلفة منخفضة.

Research

JoVE Journal

Biology

Freezing Human ES Cells

تجميد الخلايا البشرية ES

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

فلاش التجميد وCryosectioning E12.5 مخ الفأر

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

تجميد والذوبان ، وخلايا تغليف للنقل

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

تجميد والذوبان الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

متجانسة الكشف السريع عن طريق فحوصات البيولوجي المغناطيسي نظام Biosensing التحوير

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

الفرز الأنسجة وتجميد لنماذج من الأمراض العضلات الهيكلية

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

العناصر الفنية الأساسية من تجميد كسر / تجميد حفر في البيولوجية المجهر الإلكتروني

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

جنبا إلى جنب تجميد الضغط العالي والسريع تجميد استبدال الأنسجة النباتية للنقل المجهر الإلكتروني

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

يغرق التجميد: أداة لدراسات التركيبية وImmunolocalization من خلايا تعليق في نقل المجهر

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

توصيف تكلس الأحداث عن طريق لايف البصرية والمجهر الإلكتروني تقنيات في Tubeworm البحرية

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...