Name: rapid freezing using sandwich freezing device for good ultrastructural preservation of biological specimens in electron microscopy
Uploaded: 2021-07-19T14:00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy at JoVE.com

BEMÆRK: Undersøgelsens protokol for humane prøver blev godkendt af Biomedical Research Ethics Committee of the Graduate School of Medicine, Chiba University (3085). Osmium tetroxid er et farligt kemikalie; den skal håndteres med handsker i røghætten. Figur 1 viser sandwichfrysningsanordningen og de nødvendige værktøjer28. Figur 2 viser de materialer, der er nødvendige for at udføre sandwichfrysningsforsøg. Glasglasglas fyldes med acetone, der indeholder osmiumtteoxid, og opbevares ved -80 °C, indtil de anvendes (Figur 2B). Kobberskiver er 3 mm i diameter, uden huller, har et bogstav på den ene side og er kommercielt tilgængelige (Figur 2C).
1. Hurtig frysning af celleaffjedring til frysesubstitution
BEMÆRK: Hele proceduren er vist i figur 3.
<ol><li>Celler<ol>
<li>Brug celle suspensioner af bakterier, gær (Figur 2A), dyrkede celler, og isolerede celler til sandwich frysning. BEMÆRK: Både levende og glutaraldehyd-faste celler kan bruges28.</li>
	</ol></li>
	<li>Fremstilling af flydende propan BEMÆRK: Brug cryogloves og beskyttelsesbriller ved håndtering af flydende nitrogen. Da propan er eksplosiv, skal man passe på ikke at bruge brande i samme rum, og vinduer skal holdes åbne.<ol>
<li>Fyld SFD'ens flydende nitrogenbeholder med flydende nitrogen (Figur 4A). Fyld væskepropbeholderen med flydende propan ved at indføre propangas ved hjælp af en fin dyse (Figur 4B, C). Fremskynde størkning af propan ved hjælp af en afkølet metalstang (Figur 1 og Figur 4D,E).</li>
	</ol></li>
	<li>Forberedelse af kobberskiver<ol>
<li>Placer kobberskiver på et diasglas med no-letter-side op (Figur 2D) og behandle med glød udledning på 10 Pa, 400 volt, 1 mA for 30 s (Figur 4F, G) for at gøre disken overflade hydrofil ved hjælp af en ion sputter apparat30.</li>
	</ol></li>
	<li>Sandwiching og frysning af cellen<ol>
<li>Celleaffjedringen overføres til et 2-mL centrifugerør (Figur 5A) og centrifuge ved 2.900 × g for 10 s ved stuetemperatur (Figur 5B, C). Fjern supernatanten, og ophæng pelleten for at opnå en tyk affjedring (se diskussion).</li>
		<li>Placer en lille mængde af celleaffjedringen (~0,02 μL) på en kobberskive (Figur 5D-F), dæk den med en anden kobberskive (Figur 5G), og tag diskene op med pincet (Figur 5H). BEMÆRK: For at måle ~0,02 μL af celleaffjedringen skal du observere 0,1 μL dråber af suspensionen under stereomikroskopet og opdele dem i dråber, der er 1/5th af dette volumen.</li>
		<li>Lav en brønd i midten af den faste propan med den tynde metalstang(Figur 5I). Sæt pincet i en SFD og fastfrys dem hurtigt ved at trykke på apparatets injektionsknap (Figur 5J, K). BEMÆRK: Man skal passe på ikke at tørre prøverne og ikke lægge de to diske helt over hinanden (ellers ville det blive meget vanskeligt at løsne dem i næste trin).</li>
	</ol></li>
	<li>Sandwiching og frysning af animalske og menneskelige væv<ol>
<li>Brug animalske og humane væv (~0,5 mm x 0,5 mm x 1,5 mm), der er fastgjort i 2,5 % glutaraldehyd-0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4) (figur 6A,B). Skær dem i 0,1- til 0,2 mm tykke sektioner med et barberblad under et stereomikroskop (Figur 6C,D).<ol>
<li>Placer en lille dråbe (~0,02 μL) glutaraldehydopløsning på en kobberdisk (Figur 6E, F). Brug derefter pincet til at placere et stykke væv i glutaraldehyd på kobberskiven (Figur 6G, H) og dække det med en anden kobberskive ( Figur6I-K).</li>
			<li>Fastfryse diskene med vævene i SFD'ens smeltende propan som beskrevet i punkt 1.4 (Figur 5J, K). BEMÆRK: Da glutaraldehyd er et farligt kemikalie, skal det håndteres iført handsker i røghætten. Væv bør ikke vaskes med buffere, når de placeres på en kobberskive, men holdes gennemblødt i glutaraldehydopløsning, fordi glutaraldehyd har en antifrysningseffekt1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Frysesubstitution med osmium acetone<ol>
<li>Diske overføres til flydende nitrogen i et arbejdsbad (Figur 7A, B). Brug et par pincet afkølet i flydende nitrogen, løsrive diskene fra hinanden for at eksponere prøven (Figur 7C-E).</li>
		<li>Anbring diskene med cellerne i et glasglas (Figur 7F), der er fyldt med 1 ml acetone indeholdende 2 % osmiumtetroxid (Figur 2B), der er anbragt i flydende nitrogen og størknet (Figur 4H).</li>
		<li>Overfør diskene til en dybfryser, og opbevar dem ved -80 °C i 2-4 dage for frysesubstitution af cellerne (Figur 3). Læg de brugte pincet i blød i vand ved stuetemperatur for at opvarme dem (figur 7G) til frysning af følgende prøver. BEMÆRK: Pincet til håndtering af prøven skal være varm (stuetemperatur), fordi kolde pincet kan fryse prøven før hurtig frysning, hvilket fører til dannelse af iskrystaller.</li>
	</ol></li>
	<li>Prøve opvarmning og indlejring<ol>
<li>Bring gradvist prøverne til stuetemperatur (2 timer ved -20 °C, 2 time ved 4 °C og 15 min ved stuetemperatur, figur 3 og figur 8A),og overfør diskene til 2 ml plastrør, der fyldes med 1 ml acetone (figur 3 og figur 8B, C).</li>
		<li>Forbered epoxyharpiks ved at blande reagenserne i en engangsplastbeholder ved hjælp af en omrører (Figur 8D-F).</li>
		<li>Byt acetone i trin 1.7.1 successivt med 30% harpiks (i acetone), 60% harpiks, og 90% harpiks ved stuetemperatur i 1 time hver. Derefter udveksles 90% harpiks med 100% harpiks ved 37 ° C natten over. Endelig integrere prøverne i 100% harpiks (Figur 8G-J) i silicium indlejring skimmel, og polymerisere dem ved 60 ° C for 24 h (Figur 3). BEMÆRK: Prøverne skal forblive fastgjort til kobberdisketterne under hele proceduren (for at gøre det lettere at dele). Brugen af et roterende eller rystende apparat anbefales ikke under indlejringsprocessen, fordi de ikke bidrager meget til harpiksens indtrængning i cellen. Desuden får vibrationerne fra apparatet nogle gange prøverne til at løsne sig fra kobberskiverne. Inkubation ved 37 ° C natten ville fremskynde indtrængning af harpiks i cellen på grund af termisk energi (harpiksen ville ikke polymerisere, fordi det ikke indeholder nogen accelerator).</li>
	</ol></li>
	<li>Trimning af prøveblokke<ol>
<li>Tag de polymeriserede blokke ud af siliciumindlejringsformene (Figur 9A). Skriv prøvenummeret på blokken (Figur 9B).</li>
		<li>Fjern kobberskiverne fra blokken med et barberblad (Figur 9C, D ), og trim deprøver,der er indlejret på blokoverfladen, til 0,7 mm x 0,7 mm ved hjælp af et ultralydsbeskæringsblad (Figur 9E) og barberblade (Figur 9F-H) under et stereomikroskop31.</li>
		<li>Sæt blokken i en prøveholder af en ultramikrotom (Figur 9I) og skær blokkens ansigt glat med en diamanttrimningskniv (Figur 9J,K).</li>
	</ol></li>
	<li>Skæring ultratynde sektioner<ol>
<li>Fjern blokken fra ultramikrotomen (Figur 10A)31, sæt den i et stereomikroskop, og trim den yderligere til 0,2 mm x 0,3 mm med et barberblad (Figur 10B, C).</li>
		<li>Påfør neopren på gitrene for at gøre dem klæbende (Figur 10D). Sæt blokken tilbage på ultramikrotomen, dæk ultramikrotomen med et plastikdæksel (Figur 10E)31, og skær 50-70-nm tykke sektioner (Figur 10F-H).</li>
		<li>Hent sektionerne ved hjælp af en løkke (Figur 10I), monter dem på 300 eller 400 mesh kobbergitre behandlet med neopren, og tør dem (Figur 10J).</li>
	</ol></li>
	<li>Farvning af sektioner og observation under elektronmikroskopet<ol>
<li>Sæt gitrene med sektioner i rillen på det halve silikonerør (Figur 11A)31, og blød i uranylacetatopløsning og blycitrat i 3 min hver til farvning (Figur 11B-E)32.</li>
		<li>For gær- og svampeprøver skal gitrene placeres på et filterpapir (4 mm x 4 mm), samle dem op med pincet og dække dem med plasmapolymeriseret naphthalenfilm33 på vandets overflade (Figur 11F, G). Sæt gitrene i et elektronmikroskop, og hold øje med 100 kV (Figur 11H, I).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hurtig frysning af vira og makromolekyler
<ol><li>Fremstilling af flydende ethan BEMÆRK: Brug cryogloves og beskyttelsesbriller ved håndtering af flydende nitrogen. Da ethan er eksplosivt, skal man passe på ikke at bruge brande i samme rum, og vinduer skal holdes åbne. Ethan bruges, fordi det fordamper i elektronmikroskopet, mens propan ikke gør.<ol>
<li>Fyld SFD'ens flydende nitrogenbeholder med flydende nitrogen. Fyld væskedehanbeholderen med flydende ethan ved at indføre ethangas gennem en fin dyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberedelse og hurtig frysning af mikrogrider og prøver<ol>
<li>Gør begge ansigter af mikrogrids hydrofile ved at behandle dem med glød udledning (10 Pa, 400 V, 1 mA) ved hjælp af en ion sputter apparat30.</li>
		<li>Sæt mikrogrebet i SFD'en, og påfør 2 μL af virus- eller makromolekylær suspension (1 mg protein/mL) på mikrogriderne. Fjern overskydende væske ved hjælp af filterpapir, og frysning hurtigt mikrogrebet ved at trykke på apparatets injektionsknap.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Indstilling af det frosne mikronet i en kryooverførselsholder og observation under elektronmikroskopet<ol>
<li>Overfør de frosne mikrogrider i flydende nitrogen, der er indstillet i en kryooverførselsholder, der er afkølet ved flydende nitrogentemperatur på forhånd, og observere under et elektronmikroskop ved lav temperatur34.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Følgende diskussion er baseret på mere end 120 sandwich fryse-fryse substitution eksperimenter på mere end 1.000 prøver og mere end 70 springet-frysning-cryo-elektron mikroskopi eksperimenter på mere end 75 prøver udført over 36 år.
Succesrate for god frysning ved sandwich frysning Succesraten for at opnå god frysning afhænger af prøverne. Saccharomyces cerevisiae (gær) celler dyrkes i YPD medium (1% gær ekstrakt, 2% peptone, 2% dextrose) gav næsten 100% succes for god frysning uden iskrystal dannelse10,11,15,35,36. Andre gærarter, herunder Shizosaccharomyces37,38,39,Cryptococcus14,40,41,42,43,44,45, Exophiala13,41,46,47,48, 49, Fusarium50,51,52, Aureobasidium53, Candida54,55, Fellomyces56, Aspergillus57og Trichosporon viste også god frysning. Bakterier, herunder Mycobacterium58,59 og E. coli16, viste også god frysning. Dyrkede celler og isolerede dyreceller viste god frysning for både levende og glutaraldehydfaste celler1,25,26,27,60. Glutaraldehydfaste dyre- og humane væv skåret til 0,1 til 0,2 mm tykkelse viste også god frysning det meste af tiden1,28.
Betingelser for god frysning Brug kun celler i det relevante vækststadium og tilstand. Celler i kultur bør være i den eksponentielle fase. Påfør meget små mængder celleops suspensioner af koncentrerede prøver (for S. cerevisiae, ~0,02 μL på 3-5 × 109 celler/mL) på kobberskiven. Glutaraldehydfaste skiver af animalsk eller humant væv skal også være meget små (helst 0,3 mm x 0,3 mm x 0,1 mm). Da det er svært at skære 0,1 mm tykke vævsskiver, skal du skære mange væv i skiver og vælge tynde og halvgennemsigtige skiver. Arbejd hurtigt, men omhyggeligt, og lad ikke prøverne tørre ud. Når du samler de stablede kobberskiver op med pincet, skal du ikke trykke for hårdt på diskene for at undgå at knuse celler og væv. Prøvebelastning er det vigtigste skridt for vellykket frysning, og de nødvendige betingelser er de samme som betingelserne for god frysning til højtryksfrysning. Læsere bør henvise til den fremragende anmeldelse af McDonald61.
Andre programmer Dette papir præsenterer elektron mikrografer af en bakterie, gær, kultiverede celler, isolerede dyreceller, humane væv, og viruspartikler. Vi observerede god frysning af glutaraldehyd-faste marine alger. Imidlertid blev cellestrukturerne i levende ferskvandsgrønalger ødelagt af iskrystalformation. Blanding af celler med 20% kvæg serum albumin (BSA) sikrede, at ultrastrukturen var velbevaret uden iskrystalskader. Brugen af 20% BSA var også gavnlig for at bevare ultrastrukturen af stilkeceller i en svamp. Forsøg med frysning af planteceller og væv ved at anvende 20% BSA er i gang. Selv om scanning elektronmikroskopi af sandwich fryse-fryse-erstattede prøver ikke er blevet forsøgt, observation af velbevarede cellestrukturer er blevet rapporteret tidligere9.
Bemærkninger om sandwichfrysningsmetoden Den tæt-til-indfødte ultrastruktur af celler observeres bedst ved hurtig frysning og frysesubstitution af levende celler. Iskrystalformation med SFD kan undgås ved at begrænse cellernes tykkelse til ≤30 μm1. Fastsættelse væv med glutaraldehyd ofte giver bedre bevarelse af cellestrukturen til observation suspension-dyrkede celler, fordi glutaraldehyd fiksering gør cellestrukturen mere stiv og forhindrer de mulige ultrastrukturelle ændringer under indsamling og centrifugering af levende celler1. Glutaraldehydfiksering gør det også muligt at forlænge frysedybden til helt op til 0,2 mm 1 ,svarendetil den, der opnås ved højtryksfrysningsmetoden (HPF). Derfor kan HPF-maskinen udskiftes med SFD til dybfrysning af dyre- og humane væv.
Fordi glutaraldehyd-faste væv kan opbevares i mere end 2 år28, sandwich frysning kan udføres i henhold til brugerens bekvemmelighed. Fastsættelse væv med glutaraldehyd letter også vævssektion, fordi vævene bliver mere stive med fiksering. I modsætning til HPF-maskinen kan SFD bruges til hurtig frysning af vira til kryo-elektronmikroskopi og til bakterier og eukaryote celler. Sammenlignet med HPF-maskinen er SFD desuden lille, bærbar, billigere og kan erhverves af flere laboratorier. Vi håber, at disse funktioner i SFD hjælpe flere laboratorier nå deres forskning mål28.
Funktioner af cellernes naturlige morfologi Cellestrukturerne er i deres naturlige tilstand , hvis de viser følgende udseende: Membranstrukturer i den ydre membran (Figur 12A, B), plasmamembran ( Figur12B,C; Figur 13A-D; og figur 14E), nuklear kuvert (figur 12C, figur 13B-Dog figur 14D-E), mitokondrier ( figur12C, figur 13Cog figur 14D) og vakuoler ( Figur12C) udviser glatte konturer. Kernen og vakuolerne er næsten cirkulære (Figur 12C). Ribosomer viser et klart elektrontæt udseende med en diameter på ~ 20 nm (Figur 12B,C; Figur 13C; og figur 14D). Cytoplasmaet er elektron lucent (figur 12B, C; Figur 13C; og figur 14D).
Effekt af glutaraldehydfiksering på cellemorfologi Glutaraldehyd fiksering blev udført for animalske eller menneskelige væv før sandwich frysning for at opnå i-krystal-fri ultrastruktur. De mikrografer, der opnås ved denne metode, viser udsøgt klare billeder svarende til dem, der opnås ved hurtig frysning af levende væv (Figur 14)1. Undersøgelserne af gærceller, dybhavsmikroorganismer og kultiverede celler viser, at deformationen af ultrastruktur hovedsagelig skyldes osmium tetroxidfiksering og dehydrering ved ethanol ved stuetemperatur1,17,18,28. Small rapporterede også, at selv om glutaraldehyd fiksering ikke ødelægger organiseringen af actin i dyrkede fibroblaster, osmium tetroxid fiksering og dehydrering af acetone eller ethanol ved stuetemperatur ødelægge actin organisation62.
Derfor bør der udføres en detaljeret undersøgelse af virkningerne af glutaraldehydfiksering på cellemorfologi. Ohno udviklet en in vivo kryofixation metode, hvori levende væv er hurtigt frosset uden at stoppe blodforsyningen63. Vævene blev fryse-erstattet og indlejret i epoxyharpiks, og ultratynde sektioner blev observeret. De mikroskopiske elektronbilleder viste den nærmeste-til-indfødte ultrastruktur af levende væv sammenlignet med dem, der opnås ved kemisk fiksering-konventionel dehydrering og ved hurtig frysning af frisk ufikset væv. Derfor kan det være interessant at sammenligne den ultrastruktur, der opnås ved glutaraldehydfikseringsfrysningssubstitution (den nuværende metode) og ved in vivo kryofixation-frysesubstitution for at undersøge virkningerne af glutaraldehydfiksering.
Hensyntagen til miljøet og øget eksperimentel effektivitet Vi bruger 2 ML plastrør til udskiftning af harpiksen. En mL fortyndet harpiks er nok til hvert substitutionstrin. De brugte plastrør kan kasseres efter hvert forsøg. Dette kan spare tid og kræfter til vask glas hætteglas, når de bruges til harpiks substitution. Derudover kan uranylacetatopløsning bruges gentagne gange til sektionsfarvning32. Efter farvning af sektionerne kan uranylacetatopløsningen gemmes og genbruges. Da uranylacetat er et radioaktivt stof, hjælper genbrugen med at undgå generering af affald og bidrager til miljøbeskyttelse.
Plasma-polymeriseret naphthalenfilm Plasma-polymeriseret naphthalen film er en tre-dimensionelt polymeriseret carbon film fremstillet af naphthalengas ved plasma-polymerisering under glød udledning33. Filmen er modstandsdygtig mod elektronbombardement og kemikalier, meget ren, gennemsigtig mod elektroner og har en flad overflade og amorf struktur. Således er den plasmapolymeriserede naphthalenfilm, som er kommercielt tilgængelig, fremragende og anbefales som en støttefilm.

Elektronmikroskopi er et kraftfuldt værktøj til at studere celle ultrastruktur. Kemisk fiksering med konventionelle dehydreringsprocedurer er blevet brugt til at observere ultrastrukturen af celler og væv. Denne metode bevarer dog ikke i tilstrækkelig grad cellernes ultrastruktur, og artefakter og udvinding af celleindhold observeres normalt. Hurtig frysning og frysesubstitution af celler og væv er bedre alternativer til bevarelse af cellestruktur.
Tre hovedmetoder er blevet anvendt til frysning af celler hurtigt1:1) frysning af dyk udføres ved at kaste prøver i et afkølet kryogen, såsom propan, og blev anvendt siden begyndelsen af 1950'erne2; 2) frysning af koldmetalblok udføres ved hurtigt at smække celler og væv på en metalblok, der er afkølet med flydende nitrogen eller flydende helium3,4; og 3) højtryksfrysning sker ved at fryse celler og væv med flydende nitrogen under højt tryk5,6,7.
Sandwichfrysning er en form for frysning af dyk, der udføres ved at sandwiche tynde biologiske materialer mellem to kobberskiver og hurtigt fryse dem ved at kaste dem i flydende propan8,9,10. I denne metode afkøles meget tynde prøver (et par mikrometer tykke) hurtigt med cryogen ved hjælp af et metal, der har god termisk ledningsevne fra begge sider. Således fjerner denne metode effektivt varme fra prøverne, hvilket gør det muligt at fryse celler stabilt uden iskrystalskader. Sandwichfrysning efterfulgt af frysesubstitution af levende gær og bakterieceller afslører den naturlige ultrastruktur af cellerne10,11,12,13,14,15,16.
For nylig har denne metode vist sig at være nyttig til at bevare klare cellebilleder af glutaraldehydfaste mikroorganismer17,18,19,20,21,22,23,24, dyrkede celler25,26,27og menneskelige celler og væv1,28 . Selv om disse undersøgelser er blevet udført ved hjælp af en håndlavet sandwich fryseanordning29, og applikationer til andre undersøgelser i andre laboratorier har været begrænset, en ny sandwich fryseanordning (SFD) er blevet fremstillet28 og er nu kommercielt tilgængelig.
Nærværende papir viser, hvordan man bruger SFD til hurtig frysning af biologiske prøver, herunder bakterier, gær, dyrkede celler, isolerede celler, dyre- og humane væv og vira. Også vist er forberedelsen af prøver til ultratynde skæring efter hurtig frysning, samt procedurer for frysesubstitution, harpiksindlejring, trimning af blokke, skæring af ultratynde sektioner, genfinering af sektioner, farvning og dækning af gitre med støttefilm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sandwich Freezing Device</td>
			<td>Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan</td>
			<td>MW-SFD-01</td>
			<td>with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL glass vials</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Scintillation counter vials for fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>3004</td>
			<td>0.1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer</td>
			<td>Sanyo Co. Ltd., Osaka</td>
			<td>MDF-C8V1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper disk</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged razor blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Feather, FAS-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-edged razor blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Feather, FA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shredded board</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Several pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers with polystyrene foam</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>One pair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>3052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propane gas</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Cryogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion sputter apparatus</td>
			<td>Hitachi high technologies, Tokyo</td>
			<td>Hitachi E102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For 1 mL, 200 &#956;L, and 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>Capsulefuge, PMC-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo et al.</td>
			<td>-</td>
			<td>SMZ 645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo et al.</td>
			<td>SM-LW 61 Ji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic container</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>50 mL and 200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Cryogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic syringes</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>340</td>
			<td>Quetol 812 set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon embedding mold</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>4217</td>
			<td>7 mm in diameter, 13 mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubater</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For 37 &#176;C and 60 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Tilting mechanism equipped, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Trimming Blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>5240</td>
			<td>EM-240, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna</td>
			<td>Ultracut S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2633, 2634</td>
			<td>300 mesh, 400 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Neoprene W solution</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect Loop</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2351</td>
			<td>Fot retrieving sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half Tube for section staining</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>463</td>
			<td>Refer to this pape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo</td>
			<td>DISMIC-03CP</td>
			<td>Cellulose acetate, 0.45 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid freezing using sandwich freezing device for good ultrastructural preservation of biological specimens in electron microscopy

Kemisk fiksering er blevet brugt til at observere ultrastrukturen af celler og væv. Denne metode bevarer imidlertid ikke i tilstrækkelig grad cellernes ultrastruktur. artefakter og udvinding af celleindhold observeres normalt. Hurtig frysning er et bedre alternativ til bevarelse af cellestruktur. Sandwichfrysning af levende gær eller bakterier efterfulgt af frysesubstitution er blevet brugt til at observere den udsøgte naturlige ultrastruktur af celler. For nylig er sandwichfrysning af glutaraldehyd-faste dyrkede celler eller humane væv også blevet brugt til at afsløre ultrastrukturen af celler og væv. 
Disse undersøgelser er hidtil blevet udført med en håndlavet sandwichfrysningsanordning, og ansøgninger til undersøgelser i andre laboratorier har været begrænsede. En ny sandwich fryseanordning er for nylig blevet fremstillet og er nu kommercielt tilgængelig. Dette papir viser, hvordan man bruger sandwichfrysningsanordningen til hurtig frysning af biologiske prøver, herunder bakterier, gær, dyrkede celler, isolerede celler, dyre- og humane væv og vira. Også vist er forberedelsen af prøver til ultratynde afsnit efter hurtig frysning og procedurer for frysesubstitution, harpiksindlejring, trimning af blokke, skæring af ultratynde sektioner, genfinering af sektioner, farvning og dækning af gitre med støttefilm.

Levende celler af mikroorganismer i suspension blev indsamlet ved centrifugering, klemt inde mellem to kobber diske, hurtigt frosset med SFD, fryse-erstattet, indlejret i epoxy harpiks, ultratynd-sektionsafsnittet, farves, og observeret under en elektron mikroskop ved at følge de procedurer, der er beskrevet ovenfor. Figur 12 viser ultratynde dele af Escherichia coli (bakterier, figur 12A, B)16 og Saccharomyces cerevisiae (gær, figur 12C)15. Bemærk, at billederne er meget klare og viser naturlig morfologi.
Glutaraldehyd-faste celle suspensioner af dyrkede celler og isolerede dyreceller blev indsamlet og hurtigt frosset med SFD, fryse-erstattet, og observeret under en elektron mikroskop ved at følge de procedurer, der er beskrevet ovenfor. Figur 13 viser ultratynde dele af dyrkede celler (Figur 13A-C)1,28 og isolerede celler fra musens bughule ( Figur13D)28. Figur 14 viser ultratynde dele af huden på mennesker (Figur 14A-D) og buffy coat ( Figur14E)1. Bemærk, at billederne også er meget klare og viser naturlig morfologi. Figur 15 viser hepatitis B-viruskernepartikler, der hurtigt fryses med SFD og observeres ved kryoelektronmikroskopi34. Som med de andre celler er billederne meget klare og viser naturlig morfologi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig01.jpg"> Figur 1: Sandwichfrysningsenhed28 og de nødvendige værktøjer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig01large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig02.jpg"> Figur 2: Materialer, der er nødvendige for at udføre sandwichfrysningsforsøg. Vægtstang = 10 μm. (B) Glasglas (10 ml), der indeholder 1 ml acetone med 2% osmium tetroxid. (C) Kobberskiver, der viser en overflade uden bogstav (venstre) og en overflade med et bogstav (højre). Skalastang = 3 mm. Scanning elektronmikroskopi. (D) Kobberskiver uden bogstav-side op blev placeret på et glas dias med dobbeltsidet tape (*). Vægtstang = 3 mm. (E) En dobbeltkantet barbermaskine og en ødelagt dobbeltkantet barbermaskine til udskæring af dyre- og humane væv, en enkantet barbermaskine til trimning af blokke og strimlet bord til udskæring af dyre- og humane væv. (F) Pincet med ekstruderet polystyren skum for at beskytte fingrene mod kulden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig03.jpg"> Figur 3: Prøveforberedelse af celleaffjedring ved hjælp af sandwichfrysningsmetoden. Forkortelser: r.t. = stuetemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig04.jpg"> Figur 4: Fremstilling af flydende propan, kobberskiver og fiksativ. (A) Flydende nitrogen (pil) blev hældt i sandwichfrysningsanordningens flydende nitrogenbeholder. (B) Propangas blev indført i en flydende propanbeholder gennem en fin dyse. (C) Flydende propan (pil). (D) En metalstang (pil) blev brugt til at afkøle flydende propan for at fremskynde størkningen af flydende propan. (E) Størknet propan (pil). (F) Ion sputter apparat (pil) til fremstilling af kobber diske hydrofil med glød udledning. (G) Glød udledning. (H) Glasglas anbringes i flydende nitrogen i et arbejdsbad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig05.jpg"> Figur 5: Hurtig frysning af celleophæng (gær) ved hjælp af sandwichfrysningsanordningen. (B) Mikrocentrifuge. (C) Pellet af Saccharomyces cerevisiae i centrifugerøret (pil). (D) Overførsel af prøven med en mikropipette fra centrifugerøret. (E) Placering af prøven på kobberskiven. (F) En lille dråbe af en prøve på kobberskiven (pil). (G) Dækker prøven med en anden kobberskive. (H) Picking de to diske op med pincet. (I) At lave en brønd i den faste propan ved hjælp af den tynde metalstang. (J) Dykfrysning af prøven ved at trykke på injektionsknappen. (K) Frysningen er fuldført. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig06.jpg"> Figur 6: Forberedelse af en prøve af humant væv (hud). (A, B) Human hudvæv fastgjort i glutaraldehyd i en petriskål. Skalastang = 5 mm. (C, D) Væv (pil) blev skåret ved hjælp af to tveæggede barbermaskiner på et strimlet bord. (E, F) En lille dråbe glutaraldehydopløsning (pil) blev placeret på en kobberdisk. (G, H) Et stykke hudvæv blev placeret på kobberskiven ved hjælp af pincet. (I) En anden disk blev brugt til at dække kobberskiven med hudvævet. Desandwichede diske blev samlet op med pincet. (K) De klemte diske blev forsigtigt holdt med pincet. Bemærk kløften mellem pincetspidserne (pilen), der opretholdes for at undgå at knuse vævene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig07.jpg"> Figur 7: Overførsel af prøven til flydende nitrogen og løsrivelse af diskene. (A) Overførsel af diske (pil) til flydende nitrogen i et arbejdsbad. (B) Diske i flydende nitrogen (pil). (C)Pincet blev anbragt i flydende nitrogen for at afkøle dem i arbejdsbadet. (D, E) Afmontering af kobberdisketterne (pile) ved hjælp af pincet. (F) Overførsel af disken (pilen) til glasglasset med pincet. (G) Opvarmning af pincet i vand til frysning af den næste prøve. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig08.jpg"> Figur 8: Prøveopvarmning og indlejring. (A) Prøver i glasglasglas ved stuetemperatur. (B) Overførsel af diske (pil) til et 2 mL plastrør med pincet. (C) Kobberskiver (pil) i acetone i et plastikrør. (D) Måling af harpikser med et injektionsrør (pil). (E) Overførsel af harpiksen til en engangskop (pil). (F) Blanding af harpiks ved hjælp af en omrører. (G) En lille mængde harpiks blev placeret i hullerne i silikoneindlejringsformen. (H) Overskydende harpiks i gitrene blev fjernet med filterpapir. (I, J) Kobberskiver med prøver blev placeret i bunden af hullerne i indlejringsformen med prøvesiden op. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig08large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig09.jpg"> Figur 9: Trimning af prøveblokken. (A) Udtagning af polymeriserede blokke fra indlejringsformene. (B) Prøvenummeret blev skrevet på blokken. (C, D) Kobberskiven blev fjernet fra blokken med en barbermaskine. Skalastang til (D) = 1 mm. (E-G) Prøven blev trimmet med et ultralydsskæreblad og et barberblad. Skalastang for (G) = 1 mm. (H) Høj forstørrelse af (G). Et individuelt lyspunkt er en celle. Celler blev integreret i et enkelt lag10. Vægtstang = 10 μm. (I-K) Overfladen af blokken blev skåret glat med en diamanttrimningskniv. Skalalinje for (K) = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig09large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig10.jpg"> Figur 10: Opskæring af ultratynde sektioner. (A) Prøveblokken er fjernet fra mikrotomet31. (B, C) Prøven blev yderligere trimmet med et barberblad. Skalastang for (C) = 0,5 mm. (D) Neopren blev anvendt på gitre for at få dem til at holde fast. (E) Ultramicrotomet var dækket af plast for at undgå luftstrøm under ultratyndsnit. Diamantknivbåden var fyldt med vand. (G, H) Ultratynde sektioner blev skåret til en tykkelse på 70 nm. Skalastang for (H) = 1 mm. (I, J) Sektionerne blev hentet ved hjælp af en løkke og derefter tørret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig10large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig11.jpg"> Figur 11: Farvningssektioner. (A) Gitrene blev placeret i rillen på det halve silikonerør. (B) De blev gennemblødt i uranylacetat til farvning. (C) Det anvendte uranylacetat blev indsamlet på selvlukkende voksagtig film. (D) Gitsterne blev vasket med en vandstråle og (E) derefter gennemblødt i blycitrat. (F) Plasmapolymeriseret naphthalenfilm blev flød på vand og (G) anvendes til at dække et gitter, der er anbragt på 4 mm x 4 mm filterpapir. (H) Gitteret blev anbragt i en prøveholder og (I) observeret i et elektronmikroskop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig11large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig12.jpg"> Figur 12: Ultratynde dele af Escherichia coli (bakterier, A, B) og Saccharomyces cerevisiae (gær, C). (A) Bemærk at prøverne er indlejret tæt og homogent og ikke viser nogen deformation. (B, C) Membranstrukturer viser klar og glat morfologi, og ribosomer er klare nok til, at hver partikel kan opregnes16. (C) Gærkernen og vakuolerne viser en sand cirkelform, som kan være deres naturlige morfologi. Mitokondrierens matrix viser et elektrontæt udseende, som kan være karakteristisk for levende celler, der er fastgjort ved hurtig frysning. Skalastænger = 1 μm. Forkortelser: CW = cellevæg; ER = endoplasmisk reticulum; NM = atommembran; NP = nukleare porer; OM = ydre membran; PM = plasmamembraner; R = ribosomer; N = kerne; M = mitokondrier. (B) gengives fra Yamada et al.16 med tilladelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig12large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig13.jpg"> Figur 13: Ultratynde afsnit. (A-C) K562 kultiverede celler. (D) En isoleret mastcelle fra musen. (A) Bemærk at prøverne er indlejret tæt og homogent og ikke viser nogen deformation. Skalastang = 20 μm. (B-D) Ved høj forstørrelse observeres kerne, nukleolus, atommembran, kerne porer, endoplasmisk reticulum, mitokondrier, ribosomer og granulater tydeligt. Skalastænger = 2 μm (B), 500 nm (C), 2 μm (D). Forkortelser: N = kerne; Nu = nucleolus; NM = nuklear membran, NP = kerneporer; ER = endoplasmisk reticulum; M = mitokondrier; R = ribosomer; G = granulater; D = opdeling af celler. (A) gengives fra Yamaguchi et al.1 med tilladelse. (B-D) gengives fra Yamaguchi et al.28 med tilladelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig13large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig14.jpg"> Figur 14: Ultratynde afsnit. (A-E) Bemærk, at vævs- og cellebilleder er klare og naturlige og viser god kontrast, selvom sektionerne er meget tynde (50 nm). Mitokondrierens matrix viser et tæt udseende, som ligner det, der gælder for tætte mitokondriematricer af hurtigt frosne levende celler (D). Skalastænger = 10 μm (A, E), 200 nm (B-D). Forkortelser: D = desmosomes; ER = endoplasmisk reticulum; K = keratinocyte; KF = keratinfibre; M = mitokondrier; N = kerne; NM = atommembran; P = blodplade; R = ribosomer; W = hvide blodlegemer. Gengivet fra Yamaguchi et al.28 med tilladelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig14large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig15.jpg"> Figur 15: Hepatitis B-virus (HBV) kernepartikler, der hurtigt fryses med flydende ethan ved hjælp af sandwichfrysningsanordningen og observeres ved kryoelektronmikroskopi. Sfæriske hule partikler er HBV kernepartikler. Skalalinje = 100 nm. Forkortelser: HBV = hepatitis B-virus; I = is. Gengivet fra Yamaguchi et al.28 med tilladelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig15large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy at JoVE.com

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Her viser vi, hvordan man bruger sandwichfrysningsanordningen til hurtig frysning af biologiske prøver, herunder bakterier, gær, dyrkede celler, isolerede celler, dyre- og humane væv og vira. Vi viser også, hvordan man forbereder prøver til ultratynde afsnit efter hurtig frysning.

Hurtig frysning ved hjælp af Sandwich Frysning Device for god ultrastrukturel bevarelse af biologiske prøver i ElektronMikroskopi

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

For at observere cellernes udsøgte naturlige ultrastruktur er det nødvendigt at fastgøre celler ved hurtig frysning. Sandwichfrysning er en af de bedste metoder til frysning af celler uden at danne iskrystaller. Denne protokol viser brugen af sandwich frysning enhed, og beskriver også proceduren for fremstilling af ultra tynde dele af fryse-erstattede prøver efter sandwich frysning.Begynd at forberede flydende propan ved at fylde sandwichfrysningsanordningens flydende nitrogenbeholder eller SFD med flydende nitrogen. Fyld den flydende propanbeholder med flydende propan ved at indføre propangas ved hjælp af en fin dyse. Fremskynde størkning af propan ved hjælp af en afkølet metal bar.For at forberede den flade type og kurv type kobberskiver, placere dem på et glas dias med ingen bogstav side op og behandle med glød udledning på 10 pascals, 400 volt, en milliampere i 30 sekunder for at gøre disken overflade hydrofil ved hjælp af en ion spotter apparat. Overfør celleaffjedringen til et to millilitercentrifugerør og centrifuge ved 2.900 gange G i 10 sekunder ved stuetemperatur. Fjern supernatanten og ophæng pelleten for at opnå en tyk affjedring.Placer en lille mængde eller ca. 0,02 mikroliter af celleaffjedringen på en kobberskive. Dæk den med en anden kobberskive og tag diskene op med pincet. Lav en brønd i midten af den faste propan med den tynde metalstang.Sæt pincet i en SFD og hurtigt fryse dem ved at trykke på injektionsknappen på apparatet. Læg de brugte pincet i stuetemperaturvand for at opvarme dem for at fryse følgende prøver. Brug animalske og humane væv, der er fastgjort i 2,5%glutaraldehyd, 0,1 molarphosphatbuffer på pH 7.4.Skær dem i 0,1 til 0,2 millimeter tykke sektioner med et barberblad under et stereomikroskop. Placer en lille dråbe af glutaraldehydopløsningen på kurven type kobberskive, og brug derefter pincet til at placere et stykke væv i glutaraldehyd på kobberskiven og dække den med den flade kobberskive. Fastfryse skiverne med vævene i SFD'ens smeltende propan som påvist tidligere.Overfør skiverne til flydende nitrogen i et arbejdsbad. Brug et par pincet afkølet i flydende nitrogen, fjern skiverne fra hinanden for at udsætte prøven. Placer skiverne med cellerne i et glas hætteglas, der er fyldt med en milliliter acetone, der indeholder 2% osmium tetroxid, der er blevet placeret i flydende nitrogen og størknet.Overfør skiverne til en dybfryser og hold dem på minus 80 grader Celsius i to til fire dage for frysesubstitution af cellerne. Gradvist bringe prøverne til stuetemperatur ved at inkubere dem i to timer ved minus 20 grader Celsius, to timer ved fire grader Celsius og 15 minutter ved stuetemperatur. Overfør skiverne til to milliliter plastrør, der er fyldt med en milliliter acetone.Forbered epoxyharpiks ved at blande reagenserne i en engangsplastbeholder ved hjælp af en omrører. Byt acetone successivt med 30% harpiks i acetone, 60% harpiks og 90% harpiks ved stuetemperatur i en time hver, og byt derefter 90% harpiks med 100% harpiks ved 37 grader Celsius natten over. Endelig integrere prøverne i 100% harpiks i silicium indlejring skimmel og polymerisere dem ved 60 grader Celsius i 24 timer.Tag de polymeriserede blokke ud af siliciumindlejringsformene, og skriv prøvenummeret på blokken. Fjern kobberskiverne fra blokken med et barberblad og trim prøverne indlejret på blokoverfladen ved hjælp af et ultralydsbeskæringsblad og barberblade under et stereomikroskop. Derefter påføres tape på prøveblokpatronen og prøveholderen af mikrotomen og skær båndet ved grænsen.Fjern blokken fra ultramikrotomen, sæt den i et stereomikroskop, og trim den yderligere til 0,2 millimeter med 0,3 millimeter ved hjælp af et barberblad. Påfør neopren på gitre for at gøre dem klæbende. Sæt blokken tilbage på ultramikrotomen ved at justere de tapede dele.Dæk ultramikrotomen med et plastikdæksel og skær 50 til 70 nanometer tykke sektioner. Hent sektionerne ved hjælp af en løkke. Monter dem på 300 eller 400 mesh kobbergitre behandlet med neopren og tør dem.Sæt gitrene med sektioner i rillen i det halve silikonerør. Læg prøverne i blød i uranylacetatopløsning i tre minutter. Saml den brugte uranylopløsning og opbevar den i en sprøjte.Vask prøverne i et halvt rør med en vandstråle, og blød derefter prøverne i blycitrat i tre minutter. For gær og svampeprøver skal du placere gitrene på et filterpapir, samle dem op med pincet og dække dem med plasmapolymeriseret naphthalenfilm på vandoverfladen. Sæt gitterne i prøveholderen på et elektronmikroskop, sæt derefter prøveholderen i elektronmikroskopet og observeres ved 100 kilovolt.Ultra tynde dele af både E.coli og S.cerevisiae, når de observeres under elektronmikroskopet, viste naturlig morfologi og klare billeder. Ultra tynde dele af kultiverede celler hurtigt frosset ved hjælp af SFD blev observeret under elektronmikroskopet. Billederne af ultra tynde dele af den menneskelige hud var meget klare og viste naturlig morfologi.Hepatitis B-viruskernepartikler blev hurtigt frosset med SFD og observeret ved kryoelektronmikroskopi. Det vigtigste at huske er, at du skal anvende meget lille mængde celler på kobberskiverne, så iskrystaldannelse forhindres ved frysning. Ved at fastgøre animalsk væv med glutaraldehyd på forhånd opnås god frysning i en dybde på ca. 200 mikrometer svarende til den dybde, der opnås ved højtryksfrysning.Denne teknik baner vejen for en forsker til at observere den udsøgte naturlige ultra struktur af celler nemt til lave omkostninger.

Research

JoVE Journal

Biology

Freezing Human ES Cells

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Tissue Triage og Frysning af modeller af Skeletmuskel Sygdom

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Grundlæggende tekniske elementer af Freeze-fraktur / Freeze-etch i Biologisk Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Højtryks-Frysning og Quick Freeze Substitution af plantevævene for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Plunge Nedfrysning: Et værktøj for Ultrastrukturelle og immunlokalisering Studier af Suspension Celler i Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Karakterisering af Forkalkning Events med Live Optiske og elektronmikroskopi teknikker i en Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...