Name: rapid freezing using sandwich freezing device for good ultrastructural preservation of biological specimens in electron microscopy
Uploaded: 2021-07-19T14:00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy at JoVE.com

NOTE: Le protocole de l’étude pour les échantillons humains a été approuvé par le Comité d’éthique de la recherche biomédicale de la Graduate School of Medicine de l’Université Chiba (3085). Le tétroxyde d’osmium est un produit chimique dangereux; il doit être manipulé avec des gants dans la hotte. La figure 1 montre le dispositif de congélation sandwich et les outils nécessaires28. La figure 2 montre les matériaux nécessaires pour effectuer des expériences de congélation en sandwich. Les flacons en verre sont remplis d’acétone contenant du tétroxyde d’osmium et maintenus à -80 °C jusqu’à leur utilisation(figure 2B). Les disques de cuivre ont un diamètre de 3 mm, sans trous, ont une lettre sur un côté et sont disponibles dans le commerce(Figure 2C).
1. Congélation rapide des suspensions cellulaires pour la substitution par congélation
REMARQUE : L’ensemble de la procédure est illustré à la figure 3.
<ol><li>Cellules<ol>
<li>Utilisez des suspensions cellulaires de bactéries, de levures(figure 2A),de cellules cultivées et de cellules isolées pour la congélation en sandwich. REMARQUE: Les cellules vivantes et les cellules fixes au glutaraldéhyde peuvent être utilisées28.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation du propane liquide REMARQUE: Utilisez des cryogloves et des lunettes lorsque vous manipulez de l’azote liquide. Comme le propane est explosif, il faut veiller à ne pas utiliser de feux dans la même pièce et les fenêtres doivent rester ouvertes.<ol>
<li>Remplir le récipient d’azote liquide du SFD avec de l’azote liquide (Figure 4A). Remplissez le contenant de propane liquide avec du propane liquide en introduisant du gaz propane à l’aide d’une buse fine(Figure 4B,C). Accélérer la solidification du propane à l’aide d’une barre métallique refroidie(Figure 1 et Figure 4D,E).</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de disques de cuivre<ol>
<li>Placez les disques de cuivre sur un verre coulissant avec le côté sans lettre vers le haut(Figure 2D)et traitez avec une décharge luminescente à 10 Pa, 400 volts, 1 mA pendant 30 s (Figure 4F, G) pour rendre la surface du disque hydrophile à l’aide d’un appareil de pulvérisation d’ions30.</li>
	</ol></li>
	<li>Prise en sandwich et congélation de la suspension cellulaire<ol>
<li>Transférer la suspension de la cellule dans un tube de centrifugeuse de 2 mL(figure 5A)et centrifuger à 2 900 × g pendant 10 s à température ambiante(figure 5B,C). Retirez le surnageant et suspendez la pastille pour obtenir une suspension épaisse (voir la discussion).</li>
		<li>Placez une petite quantité de la suspension de la cellule (~0,02 μL) sur un disque de cuivre (Figure 5D-F ), recouvrez-la d’un autre disque de cuivre (Figure 5G) et ramassez les disques avec une pince à épiler (Figure 5H). REMARQUE: Pour mesurer ~ 0,02 μL de la suspension cellulaire, observez 0,1 μL de gouttes de suspension sous le stéréomicroscope et divisez-les en gouttelettes qui représentent1/5 ème de ce volume.</li>
		<li>Faire un puits au centre du propane solide avec la fine barre métallique(Figure 5I). Placez les pinces dans un SFD et congelez-les rapidement en appuyant sur le bouton d’injection de l’appareil (Figure 5J, K). REMARQUE: Il faut veiller à ne pas sécher les spécimens et à ne pas poser complètement les deux disques l’un sur l’autre (sinon, les détacher deviendrait très difficile à l’étape suivante).</li>
	</ol></li>
	<li>Prise en sandwich et congélation de tissus animaux et humains<ol>
<li>Utiliser des tissus animaux et humains (~0,5 mm x 0,5 mm x 1,5 mm) fixés dans un tampon phosphate de glutaraldéhyde-0,1 M à 2,5 % (pH 7,4)(Figure 6A,B). Découpez-les en sections de 0,1 à 0,2 mm d’épaisseur avec une lame de rasoir sous un stéréomicroscope (Figure 6C, D).<ol>
<li>Placer une petite goutte (~0,02 μL) de solution de glutaraldéhyde sur un disque de cuivre (Figure 6E, F). Ensuite, utilisez une pince à épiler pour placer un morceau de tissu dans le glutaraldéhyde sur le disque de cuivre (Figure 6G, H) et le recouvrir d’un autre disque de cuivre ( Figure6I-K).</li>
			<li>Congeler rapidement les disques avec les tissus dans le propane en fusion du SFD, comme décrit à la section 1.4 (Figure 5J, K). REMARQUE: Comme le glutaraldéhyde est un produit chimique dangereux, il doit être manipulé avec des gants dans la hotte. Les tissus ne doivent pas être lavés avec des tampons lorsqu’ils sont placés sur un disque de cuivre, mais conservés trempés dans une solution de glutaraldéhyde car le glutaraldéhyde a un effet antigel1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Congélation-substitution par de l’acétone d’osmium<ol>
<li>Transférer les disques dans l’azote liquide dans un bain de travail (Figure 7A, B). À l’aide d’une pince à épiler refroidie à l’azote liquide, détachez les disques les uns des autres pour exposer l’échantillon(Figure 7C-E).</li>
		<li>Placer les disques avec les cellules dans un flacon en verre (Figure 7F) qui est rempli de 1 mL d’acétone contenant 2% de tétroxyde d’osmium (Figure 2B) qui a été placé dans de l’azote liquide et solidifié (Figure 4H).</li>
		<li>Transférer les disques dans un congélateur et les conserver à -80 °C pendant 2 à 4 jours pour la substitution par congélation des cellules (Figure 3). Faire tremper les pinces usagées dans de l’eau à température ambiante pour les réchauffer(figure 7G)pour la congélation des échantillons suivants. REMARQUE: Les pinces à épiler pour manipuler l’échantillon doivent être chaudes (température ambiante) car les pinces froides peuvent geler l’échantillon avant une congélation rapide, entraînant la formation de cristaux de glace.</li>
	</ol></li>
	<li>Réchauffement et intégration des échantillons<ol>
<li>Amener progressivement les échantillons à température ambiante (2 h à -20 °C, 2 h à 4 °C et 15 min à température ambiante, Figure 3 et Figure 8A),et transférer les disques dans des tubes en plastique de 2 mL remplis de 1 mL d’acétone(Figure 3 et Figure 8B,C).</li>
		<li>Préparer la résine époxy en mélangeant les réactifs dans un récipient en plastique jetable à l’aide d’un agitateur (Figure 8D-F).</li>
		<li>Échangez l’acétone à l’étape 1.7.1 successivement avec 30% de résine (dans l’acétone), 60% de résine et 90% de résine à température ambiante pendant 1 h chacune. Ensuite, échangez la résine à 90% avec la résine à 100% à 37°C pendant la nuit. Enfin, incorporez les échantillons dans de la résine à 100 %(Figure 8G-J)dans le moule d’enrobage en silicium, et polymérisez-les à 60°C pendant 24 h(Figure 3). REMARQUE: Les échantillons doivent rester attachés aux disques de cuivre tout au long de la procédure (pour faciliter le sectionnement). L’utilisation d’un appareil rotatif ou d’agitation n’est pas recommandée pendant le processus d’encastrement car ils contribuent peu à la pénétration de la résine dans la cellule. De plus, la vibration de l’appareil provoque parfois le détachement des échantillons des disques de cuivre. Une incubation à 37°C pendant la nuit accélérerait la pénétration de la résine dans la cellule en raison de l’énergie thermique (la résine ne polymériserait pas car elle ne contient aucun accélérateur).</li>
	</ol></li>
	<li>Rognage de blocs d’échantillons<ol>
<li>Retirez les blocs polymérisés des moules d’enrobage de silicium (Figure 9A). Écrivez le numéro de spécimen sur le bloc (Figure 9B).</li>
		<li>Retirez les disques de cuivre du bloc à l’aide d’une lame de rasoir (Figure 9C, D) et coupez les échantillons incorporés sur la surface du bloc à 0,7 mm x 0,7 mm à l’aide d’une lame de coupe à ultrasons ( Figure9E) et de lames de rasoir (Figure 9F-H) sous un stéréomicroscope31.</li>
		<li>Placez le bloc dans un porte-spécimen d’un ultramicrotome (Figure 9I) et coupez la face du bloc en douceur avec un couteau de coupe en diamant (Figure 9J, K).</li>
	</ol></li>
	<li>Découpe de sections ultraminces<ol>
<li>Retirez le bloc de l’ultramicrotome (Figure 10A)31, placez-le dans un stéréomicroscope et coupez-le encore à 0,2 mm x 0,3 mm avec une lame de rasoir (Figure 10B, C).</li>
		<li>Appliquez du néoprène sur les grilles pour les rendre adhésives (Figure 10D). Remettez le bloc sur l’ultramicrotome, couvrez l’ultramicrotome avec un couvercle en plastique (Figure 10E)31et coupez des sections de 50 à 70 nm d’épaisseur (Figure 10F-H).</li>
		<li>Récupérez les sections à l’aide d’une boucle (Figure 10I), montez-les sur des grilles de cuivre de 300 ou 400 mailles traitées au néoprène et séchez-les (Figure 10J).</li>
	</ol></li>
	<li>Coloration des sections et observation au microscope électronique<ol>
<li>Placer les grilles avec des sections dans la rainure du demi-tube en silicone (Figure 11A)31, et tremper dans une solution d’acétate d’uranyle et de citrate de plomb pendant 3 min chacune pour la coloration (Figure 11B-E)32.</li>
		<li>Pour les échantillons de levure et de champignons, placez les grilles sur un papier filtre (4 mm x 4 mm), ramassez-les avec une pince à épiler et recouvrez-les d’un film de naphtalène polymérisé au plasma33 à la surface de l’eau (Figure 11F, G). Insérez les grilles dans un microscope électronique et observez à 100 kV(Figure 11H,I).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Congélation rapide des virus et des macromolécules
<ol><li>Préparation de l’éthane liquide REMARQUE: Utilisez des cryogloves et des lunettes lorsque vous manipulez de l’azote liquide. Comme l’éthane est explosif, il faut veiller à ne pas utiliser de feux dans la même pièce et les fenêtres doivent rester ouvertes. L’éthane est utilisé parce qu’il s’évapore au microscope électronique alors que le propane ne le fait pas.<ol>
<li>Remplissez le récipient d’azote liquide du SFD avec de l’azote liquide. Remplissez le récipient d’éthane liquide avec de l’éthane liquide en introduisant du gaz éthane à travers une buse fine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation et congélation rapide des micro-réseaux et des spécimens<ol>
<li>Rendre les deux faces des micro-réseaux hydrophiles en les traitant avec une décharge luminescente (10 Pa, 400 V, 1 mA) à l’aide d’un appareil de pulvérisation ionique30.</li>
		<li>Placez le microréseau dans le SFD et appliquez 2 μL du virus ou de la suspension macromoléculaire (1 mg de protéine/mL) sur les microréseaux. Éliminez l’excès de liquide à l’aide de papier filtre et congelez rapidement le microréseau en appuyant sur le bouton d’injection de l’appareil.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mise en place du microréseau congelé dans un support de cryo-transfert et observation au microscope électronique<ol>
<li>Transférer les micro-réseaux congelés dans de l’azote liquide, placé dans un support de cryo-transfert refroidi au préalable à la température de l’azote liquide, et observer au microscope électronique à basse température34.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

La discussion suivante est basée sur plus de 120 expériences de substitution de congélation-congélation sandwich sur plus de 1 000 échantillons et plus de 70 expériences de cryo-microscopie électronique sur plus de 75 échantillons menées sur 36 ans.
Taux de réussite pour une bonne congélation par congélation sandwich Le taux de réussite dans l’obtention d’une bonne congélation dépend des échantillons. Les cellules de Saccharomyces cerevisiae (levure) cultivées en milieu YPD (1% d’extrait de levure, 2% de peptone, 2% de dextrose) ont donné près de 100% de succès pour une bonne congélation sans formation de cristaux de glace10,11,15,35,36. Autres espèces de levures, y compris Shizosaccharomyces37,38,39,Cryptococcus14,40,41,42,43,44,45, Exophiala13,41,46,47,48, 49, Fusarium50,51,52, Aureobasidium53, Candida54,55, Fellomyces56, Aspergillus57, et Trichosporon, ont également montré une bonne congélation. Les bactéries, y compris Mycobacterium58,59 et E. coli16, ont également montré une bonne congélation. Les cellules cultivées et les cellules animales isolées ont montré une bonne congélation pour les cellules vivantes et les cellules fixées au glutaraldéhyde1,25, 26,27,60. Les tissus animaux et humains fixés au glutaraldéhyde et tranchés à 0,1 à 0,2 mm d’épaisseur ont également montré une bonne congélation la plupart du temps1,28.
Conditions pour une bonne congélation Utilisez uniquement des cellules au stade et dans l’état de croissance appropriés. Les cellules en culture doivent être en phase exponentielle. Appliquer de très petites quantités de suspensions cellulaires d’échantillons concentrés (pour S. cerevisiae,~0,02 μL de 3-5 × 109 cellules/mL) sur le disque de cuivre. Les tranches de tissus animaux ou humains fixées au glutaraldéhyde doivent également être très petites (de préférence 0,3 mm x 0,3 mm x 0,1 mm). Parce qu’il est difficile de couper des tranches de tissu de 0,1 mm d’épaisseur, coupez de nombreux tissus et choisissez des tranches minces et semi-transparentes. Travaillez rapidement mais soigneusement et ne laissez pas les échantillons sécher. En ramassant les disques de cuivre empilés avec une pince à épiler, n’appuyez pas trop fort sur les disques pour éviter d’écraser les cellules et les tissus. Le chargement des échantillons est l’étape la plus importante pour une congélation réussie, et les conditions requises sont les mêmes que les conditions d’une bonne congélation pour la congélation à haute pression. Les lecteurs devraient se référer à l’excellente critique de McDonald61.
Autres applications Cet article présente des micrographies électroniques d’une bactérie, d’une levure, de cellules cultivées, de cellules animales isolées, de tissus humains et de particules virales. Nous avons observé une bonne congélation des algues marines fixées au glutaraldéhyde. Cependant, les structures cellulaires des algues vertes d’eau douce vivantes ont été détruites par la formation de cristaux de glace. Le mélange de cellules avec 20% d’albumine sérique bovine (BSA) a permis de s’assurer que l’ultrastructure était bien conservée sans dommage aux cristaux de glace. L’utilisation de 20% de BSA a également été bénéfique pour préserver l’ultrastructure des cellules de tige d’un champignon. Des expériences sur la congélation de cellules et de tissus végétaux par l’application de 20% de BSA sont en cours. Bien que la microscopie électronique à balayage d’échantillons sandwich congelés-congelés-substitués n’ait pas été tentée, l’observation de structures cellulaires bien préservées a été rapportée précédemment9.
Notes sur la méthode de congélation sandwich L’ultrastructure proche de la structure native des cellules est mieux observée par la congélation rapide et la substitution par congélation des cellules vivantes. La formation de cristaux de glace avec le SFD peut être évitée en limitant l’épaisseur des cellules à ≤30 μm1. La fixation des tissus avec du glutaraldéhyde permet souvent une meilleure préservation de la structure cellulaire pour l’observation des cellules cultivées en suspension, car la fixation du glutaraldéhyde rend la structure cellulaire plus rigide et empêche les changements ultrastructuraux possibles lors de la collecte et de la centrifugation des cellules vivantes1. La fixation du glutaraldéhyde permet également d’étendre la profondeur de congélation jusqu’à 0,2 mm1,similaire à celle obtenue par la méthode de congélation à haute pression (HPF). Par conséquent, la machine HPF peut être remplacée par la SFD pour la surgélation des tissus animaux et humains.
Parce que les tissus fixés au glutaraldéhyde peuvent être conservés pendant plus de 2 ans28, la congélation en sandwich peut être effectuée selon la commodité de l’utilisateur. La fixation des tissus avec du glutaraldéhyde facilite également le sectionnement des tissus car les tissus deviennent plus rigides avec la fixation. Contrairement à la machine HPF, le SFD peut être utilisé pour la congélation rapide de virus pour la cryo-microscopie électronique et pour les bactéries et les cellules eucaryotes. De plus, par rapport à la machine HPF, le SFD est petit, portable, moins cher et peut être acquis par plus de laboratoires. Nous espérons que ces caractéristiques du SFD aideront davantage de laboratoires à atteindre leurs objectifs de recherche28.
Caractéristiques de la morphologie naturelle des cellules Les structures cellulaires sont à l’état naturel si elles présentent l’aspect suivant : Structures membranaires de la membrane externe (Figure 12A, B), Membrane plasmique ( Figure12B,C; Figure 13A-D; et figure 14E), enveloppe nucléaire (Figure 12C, Figure 13B-D, et Figure 14D-E), mitochondries ( Figure12C, Figure 13Cet Figure 14D), et les vacuoles ( Figure12C) montrent des contours lisses. Le noyau et les vacuoles sont presque circulaires(Figure 12C). Les ribosomes présentent un aspect clair et dense en électrons avec un diamètre d’environ 20 nm (Figure 12B,C; Figure 13C; et Figure 14D). Le cytoplasme est électron-lucent (Figure 12B,C; Figure 13C; et Figure 14D).
Effet de la fixation du glutaraldéhyde sur la morphologie cellulaire La fixation du glutaraldéhyde a été réalisée pour les tissus animaux ou humains avant la congélation en sandwich afin d’obtenir une ultrastructure sans cristaux de glace. Les micrographies obtenues par cette méthode montrent des images d’une clarté exquise similaires à celles obtenues par la congélation rapide de tissus vivants (Figure 14)1. Les études sur les cellules de levure, les micro-organismes d’eau profonde et les cellules cultivées montrent que la déformation de l’ultrastructure est principalement due à la fixation du tétroxyde d’osmium et à la déshydratation par l’éthanol à température ambiante1,17,18,28. Small a également signalé que, bien que la fixation du glutaraldéhyde ne détruise pas l’organisation de l’actine dans les fibroblastes cultivés, la fixation du tétroxyde d’osmium et la déshydratation par l’acétone ou l’éthanol à température ambiante détruisent l’organisation de l’actine62.
Par conséquent, une étude détaillée sur les effets de la fixation du glutaraldéhyde sur la morphologie cellulaire devrait être réalisée. Ohno a développé une méthode de cryofixation in vivo dans laquelle les tissus vivants sont rapidement congelés sans arrêter l’approvisionnement en sang63. Les tissus ont été substitués par congélation et incorporés dans de la résine époxy, et des sections ultraminces ont été observées. Les images microscopiques électroniques ont montré l’ultrastructure la plus proche du natif des tissus vivants par rapport à celles obtenues par fixation chimique - déshydratation conventionnelle et par congélation rapide de tissus frais non fixés. Par conséquent, il peut être intéressant de comparer l’ultrastructure obtenue par substitution de glutaraldéhyde fixation-gel (la présente méthode) et celles obtenues par substitution cryofixation-gel in vivo pour examiner les effets de la fixation du glutaraldéhyde.
Prise en compte de l’environnement et augmentation de l’efficacité expérimentale Nous utilisons des tubes en plastique de 2 mL pour la substitution de la résine. Un mL de résine diluée suffit pour chaque étape de substitution. Les tubes en plastique usagés peuvent être jetés après chaque expérience. Cela peut économiser du temps et des efforts pour laver les flacons en verre lorsqu’ils sont utilisés pour la substitution de résine. De plus, la solution d’acétate d’uranyle peut être utilisée à plusieurs reprises pour la coloration de section32. Après avoir teint les sections, la solution d’acétate d’uranyle peut être conservée et réutilisée. L’acétate d’uranyle étant une substance radioactive, sa réutilisation permet d’éviter la production de déchets et contribue à la protection de l’environnement.
Film de naphtalène polymérisé au plasma Le film de naphtalène polymérisé au plasma est un film de carbone polymérisé tridimensionnel fabriqué à partir de gaz naphtalène par polymérisation plasma sous décharge luminescente33. Le film est résistant au bombardement d’électrons et aux produits chimiques, très propre, transparent contre les électrons, et a une surface plane et une structure amorphe. Ainsi, le film de naphtalène polymérisé au plasma, disponible dans le commerce, est excellent et est recommandé comme film de support.

La microscopie électronique est un outil puissant pour étudier l’ultrastructure cellulaire. La fixation chimique avec les procédures de déshydratation conventionnelles a été utilisée pour observer l’ultrastructure des cellules et des tissus. Cependant, cette méthode ne préserve pas adéquatement l’ultrastructure des cellules, et des artefacts et l’extraction du contenu cellulaire sont généralement observés. La congélation rapide et la substitution par congélation des cellules et des tissus sont de meilleures alternatives pour la préservation de la structure cellulaire.
Trois méthodes principales ont été utilisées pour congeler rapidement les cellules1: 1) la congélation par immersion est réalisée en plongeant les échantillons dans un cryogène refroidi, tel que le propane, et est utilisée depuis le début des années 19502; 2) la congélation froide d’un bloc métallique est réalisée en claquant rapidement des cellules et des tissus sur un bloc métallique refroidi à l’azote liquide ou àl’héliumliquide 3,4; et 3) la congélation à haute pression se fait en congelant les cellules et les tissus avec de l’azote liquide sous haute pression5,6,7.
La congélation sandwich est un type de congélation par immersion réalisée en prenant en sandwich des matières biologiques minces entre deux disques de cuivre et en les congelant rapidement en plongeant dans du propane liquide8,9,10. Dans cette méthode, des échantillons très minces (quelques micromètres d’épaisseur) sont rapidement refroidis avec du cryogène à l’aide d’un métal qui a une bonne conductivité thermique des deux côtés. Ainsi, cette méthode élimine efficacement la chaleur des échantillons, ce qui permet de congeler de manière stable les cellules sans endommager les cristaux de glace. La congélation sandwich, suivie de la congélation-substitution de levures vivantes et de cellules bactériennes, révèle l’ultrastructure naturelle des cellules10,11,12,13,14,15,16.
Récemment, cette méthode s’est avérée utile pour préserver des images cellulaires claires de micro-organismes fixés au glutaraldéhyde17,18,19,20 , 21,22,23,24, cellules cultivées25,26,27, et cellules et tissus humains1,28 . Bien que ces études aient été réalisées à l’aide d’un dispositif de congélation sandwich fait à la main29, et que les applications à d’autres études dans d’autres laboratoires aient été limitées, un nouveau dispositif de congélation sandwich (SFD) a été fabriqué28 et est maintenant disponible dans le commerce.
Le présent article montre comment utiliser le SFD pour la congélation rapide d’échantillons biologiques, y compris des bactéries, des levures, des cellules cultivées, des cellules isolées, des tissus animaux et humains et des virus. On voit également la préparation d’échantillons pour la coupe ultramince après congélation rapide, ainsi que les procédures de substitution par congélation, d’incorporation de résine, de rognage de blocs, de coupe de sections ultraminces, de récupération de sections, de coloration et de recouvrement de grilles avec des films de support.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sandwich Freezing Device</td>
			<td>Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan</td>
			<td>MW-SFD-01</td>
			<td>with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL glass vials</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Scintillation counter vials for fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>3004</td>
			<td>0.1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer</td>
			<td>Sanyo Co. Ltd., Osaka</td>
			<td>MDF-C8V1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper disk</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged razor blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Feather, FAS-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-edged razor blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Feather, FA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shredded board</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Several pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers with polystyrene foam</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>One pair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>3052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propane gas</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Cryogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion sputter apparatus</td>
			<td>Hitachi high technologies, Tokyo</td>
			<td>Hitachi E102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For 1 mL, 200 &#956;L, and 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>Capsulefuge, PMC-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo et al.</td>
			<td>-</td>
			<td>SMZ 645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo et al.</td>
			<td>SM-LW 61 Ji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic container</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>50 mL and 200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Cryogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic syringes</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>340</td>
			<td>Quetol 812 set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon embedding mold</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>4217</td>
			<td>7 mm in diameter, 13 mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubater</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For 37 &#176;C and 60 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Tilting mechanism equipped, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Trimming Blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>5240</td>
			<td>EM-240, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna</td>
			<td>Ultracut S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2633, 2634</td>
			<td>300 mesh, 400 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Neoprene W solution</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect Loop</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2351</td>
			<td>Fot retrieving sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half Tube for section staining</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>463</td>
			<td>Refer to this pape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo</td>
			<td>DISMIC-03CP</td>
			<td>Cellulose acetate, 0.45 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid freezing using sandwich freezing device for good ultrastructural preservation of biological specimens in electron microscopy

La fixation chimique a été utilisée pour observer l’ultrastructure des cellules et des tissus. Cependant, cette méthode ne préserve pas adéquatement l’ultrastructure des cellules; les artefacts et l’extraction du contenu cellulaire sont généralement observés. La congélation rapide est une meilleure alternative pour la préservation de la structure cellulaire. La congélation en sandwich de levures ou de bactéries vivantes suivie d’une substitution par congélation a été utilisée pour observer l’ultrastructure naturelle exquise des cellules. Récemment, la congélation en sandwich de cellules cultivées fixées au glutaraldéhyde ou de tissus humains a également été utilisée pour révéler l’ultrastructure des cellules et des tissus. 
Jusqu’à présent, ces études ont été réalisées avec un dispositif de congélation sandwich fait à la main, et les applications aux études dans d’autres laboratoires ont été limitées. Un nouveau dispositif de congélation sandwich a récemment été fabriqué et est maintenant disponible dans le commerce. Le présent article montre comment utiliser le dispositif de congélation sandwich pour la congélation rapide d’échantillons biologiques, y compris des bactéries, des levures, des cellules cultivées, des cellules isolées, des tissus animaux et humains et des virus. On voit également la préparation d’échantillons pour la coupe ultramince après congélation rapide et les procédures de substitution par congélation, d’incorporation de résine, de rognage de blocs, de coupe de sections ultraminces, de récupération de sections, de coloration et de recouvrement de grilles avec des films de support.

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Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Nous montrons ici comment utiliser le dispositif de congélation sandwich pour la congélation rapide d’échantillons biologiques, y compris des bactéries, des levures, des cellules cultivées, des cellules isolées, des tissus animaux et humains et des virus. Nous montrons également comment préparer des échantillons pour la section ultramince après une congélation rapide.

Congélation rapide à l’aide d’un dispositif de congélation sandwich pour une bonne conservation ultrastructurale des échantillons biologiques en microscopie électronique

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Afin d’observer l’ultrastructure naturelle exquise des cellules, il est nécessaire de fixer les cellules par congélation rapide. La congélation en sandwich est l’une des meilleures méthodes pour congeler les cellules sans former de cristaux de glace. Ce protocole démontre l’utilisation d’un dispositif de congélation sandwich et décrit également la procédure de fabrication de sections ultra minces d’échantillons substitués par congélation après congélation sandwich.Commencez à préparer le propane liquide en remplissant le contenant d’azote liquide du dispositif de congélation sandwich ou du SFD avec de l’azote liquide. Remplissez le contenant de propane liquide avec du propane liquide en introduisant du gaz propane à l’aide d’une buse fine. Accélérer la solidification du propane à l’aide d’une barre métallique refroidie.Pour préparer les disques de cuivre de type plat et de type panier, placez-les sur une lame de verre avec le côté sans lettre vers le haut et traitez avec une décharge lumineuse à 10 pascals, 400 volts, un milliampère pendant 30 secondes pour rendre la surface du disque hydrophile à l’aide d’un appareil d’observation d’ions. Transférer la suspension de la cellule dans un tube de centrifugeuse de deux millilitres et centrifuger à 2 900 fois G pendant 10 secondes à température ambiante. Retirez le surnageant et suspendez la pastille pour obtenir une suspension épaisse.Placez une petite quantité ou environ 0,02 microlitre de la suspension cellulaire sur un disque de cuivre. Couvrez-le avec un autre disque en cuivre et ramassez les disques avec une pince à épiler. Faites un puits au centre du propane solide avec la fine barre métallique.Placez la pince à épiler dans un SFD et congelez-les rapidement en appuyant sur le bouton d’injection de l’appareil. Faire tremper les pinces usagées dans de l’eau à température ambiante pour les réchauffer afin de congeler les spécimens suivants. Utiliser des tissus animaux et humains fixés dans du glutaraldéhyde à 2,5 %, un tampon phosphate molaire de 0,1 de pH 7,4.Découpez-les en sections de 0,1 à 0,2 millimètre d’épaisseur avec une lame de rasoir au stéréomicroscope. Placez une petite goutte de la solution de glutaraldéhyde sur le disque de cuivre de type panier, puis utilisez une pince à épiler pour placer un morceau de tissu dans le glutaraldéhyde sur le disque de cuivre et recouvrez-le du disque plat en cuivre. Congelez rapidement les disques avec les tissus dans le propane en fusion du SFD, comme démontré précédemment.Transférer les disques dans l’azote liquide dans un bain de travail. À l’aide d’une pince à épiler refroidie à l’azote liquide, détachez les disques les uns des autres pour exposer l’échantillon. Placez les disques avec les cellules dans un flacon en verre rempli d’un millilitre d’acétone contenant du tétroxyde d’osmium à 2% qui a été placé dans de l’azote liquide et solidifié.Transférez les disques dans un congélateur et conservez-les à moins 80 degrés Celsius pendant deux à quatre jours pour la substitution du gel des cellules. Amenez progressivement les spécimens à la température ambiante en les incubant pendant deux heures à moins 20 degrés Celsius, deux heures à quatre degrés Celsius et 15 minutes à température ambiante. Transférez les disques dans deux tubes en plastique millilitres remplis d’un millilitre d’acétone.Préparez la résine époxy en mélangeant les réactifs dans un récipient en plastique jetable à l’aide d’un agitateur. Échangez l’acétone successivement avec 30% de résine dans de l’acétone, 60% de résine et 90% de résine à température ambiante pendant une heure chacun, puis échangez la résine de 90% avec 100% de résine à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Enfin, incorporez les échantillons dans de la résine à 100% dans le moule d’encastrement en silicium et polymérisez-les à 60 degrés Celsius pendant 24 heures.Retirez les blocs polymérisés des moules d’enrobage de silicium et écrivez le numéro d’échantillon sur le bloc. Retirez les disques de cuivre du bloc avec une lame de rasoir et coupez les échantillons incrustés sur la surface du bloc à l’aide d’une lame de coupe à ultrasons et de lames de rasoir sous un stéréomicroscope. Ensuite, appliquez du ruban adhésif sur le mandrin du bloc d’échantillon et le porte-échantillon du microtome et coupez le ruban à la limite.Retirez le bloc de l’ultra microtome, placez-le dans un stéréomicroscope et coupez-le encore à 0,2 millimètre par 0,3 millimètre à l’aide d’une lame de rasoir. Appliquez du néoprène sur les grilles pour les rendre adhésives. Remettez le bloc sur le microtome ultra en alignant les pièces scotchées.Couvrez l’ultra microtome avec un couvercle en plastique et coupez des sections de 50 à 70 nanomètres d’épaisseur. Récupérez les sections à l’aide d’une boucle. Montez-les sur des grilles de cuivre de 300 ou 400 mailles traitées au néoprène et séchez-les.Réglez les grilles avec des sections dans la rainure du demi-tube en silicone. Faire tremper les échantillons dans une solution d’acétate d’uranyle pendant trois minutes. Recueillir la solution d’uranyle utilisée et la conserver dans une seringue.Lavez les spécimens dans un demi-tube avec un jet d’eau, puis faites tremper les spécimens dans du citrate de plomb pendant trois minutes. Pour les spécimens de levure et de champignons, placez les grilles sur un papier filtre, ramassez-les avec une pince à épiler et recouvrez-les d’un film de naphtalène polymérisé au plasma à la surface de l’eau. Insérez les grilles dans le porte-spécimen d’un microscope électronique, puis insérez le porte-échantillon dans le microscope électronique et observez à 100 kilovolts.Des sections ultra minces d’E. coli et de S.cerevisiae lorsqu’elles ont été observées au microscope électronique ont montré une morphologie naturelle et des images claires. Des sections ultra minces de cellules cultivées rapidement congelées à l’aide de SFD ont été observées au microscope électronique. Les images de sections ultra minces de la peau humaine étaient très claires et montraient une morphologie naturelle.Les particules du noyau du virus de l’hépatite B ont été rapidement congelées avec du SFD et observées par cryomicroscopie électronique. La chose la plus importante à retenir est que vous devez appliquer une très petite quantité de cellules sur les disques de cuivre afin d’éviter la formation de cristaux de glace lors de la congélation. En fixant préalablement les tissus animaux avec du glutaraldéhyde, une bonne congélation à une profondeur d’environ 200 micromètres est obtenue de manière similaire à la profondeur obtenue par congélation à haute pression.Cette technique ouvre la voie à un chercheur pour observer l’ultrastructure naturelle exquise des cellules facilement à faible coût.

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