Name: rapid freezing using sandwich freezing device for good ultrastructural preservation of biological specimens in electron microscopy
Uploaded: 2021-07-19T14:00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy at JoVE.com

הערה: פרוטוקול המחקר לדגימות אנושיות אושר על ידי ועדת האתיקה למחקר ביו-רפואי של בית הספר לרפואה לתארים מתקדמים, אוניברסיטת צ'יבה (3085). אוסמיום טסטרוקסיד הוא כימיקל מסוכן; זה צריך להיות מטופל לובש כפפות במכסה המנוע האדים. איור 1 מציג את מכשיר הקפאת הכריכים ואת הכלים הדרושים28. איור 2 מראה את החומרים הדרושים לביצוע ניסויים בהקפאת כריך. בקבוקוני זכוכית מלאים באצטון המכיל אוסמיום טסטרוקסיד ונשמרים ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש(איור 2B). דיסקי נחושת בקוטר 3 מ"מ, ללא חורים, יש אות בצד אחד, והם זמינים מסחרית(איור 2C).
1. הקפאה מהירה של השעיות תאים להחלפת הקפאה
הערה: ההליך כולו מוצג באיור 3.
<ol><li>תאים<ol>
<li>השתמשו בהשעיות תאים של חיידקים, שמרים (איור 2A), תאים מתורבתים ותאים מבודדים להקפאת כריך. הערה: ניתן להשתמש הן בתאים חיים והן בתאים קבועים של גלוטרדהיד28.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת פרופן נוזלי הערה: השתמש cryogloves ומשקפי מגן בעת טיפול חנקן נוזלי. כמו פרופאן הוא נפץ, יש להקפיד לא להשתמש בשריפות באותו החדר, וחלונות צריכים להישמר פתוחים.<ol>
<li>מלאו את מיכל החנקן הנוזלי של ה-SFD בחנקן נוזלי(איור 4A). מלאו את מיכל הפרופן הנוזלי בפרופן נוזלי על ידי החדרת גז פרופן באמצעות זרבובית עדינה(איור 4B,C). האצו את התגבשות הפרופן באמצעות מוט מתכת מקורר(איור 1 ואיור 4D,E).</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת דיסקי נחושת<ol>
<li>הניחו דיסקי נחושת על זכוכית שקופית עם הצד ללא אותיותלמעלה (איור 2D)ופינקו בפריקה זוהרת ב- 10 Pa, 400 וולט, 1 mA ל - 30 s (איור 4F,G) כדי להפוך את משטח הדיסק הידרופילי באמצעות מנגנון יון מקרטעת30.</li>
	</ol></li>
	<li>כריך וצליפה-הקפאה של השעיית התא<ol>
<li>העבירו את מתלה התא לצינור צנטריפוגה בגודל 2 מ"ל(איור 5A)וצנטריפוגה ב-2,900 × גרם ל-10 מעלות בטמפרטורת החדר(איור 5B,C). הסר את supernatant, ולהשעות את הכדור כדי לקבל מתלה עבה (ראה דיון).</li>
		<li>הניחו כמות קטנה של מתלה התא (~0.02 μL) על דיסק נחושת(איור 5D-F),כסו אותו בדיסק נחושת אחר(איור 5G),ובחרו את הדיסקים עם פינצטה(איור 5H). הערה: כדי למדוד ~ 0.02 μL של השעיית התא, לצפות 0.1 טיפות μL של ההשעיה תחת סטריאוטימיקרופ ולחלק אותם טיפות כי הם 1/5th של נפח זה.</li>
		<li>הפוך באר במרכז הפרופן המוצק עם מוט המתכת הדק(איור 5I). הגדר את פינצטה ב- SFD והקפיא אותם במהירות על ידי לחיצה על כפתור ההזרקה של המנגנון (איור 5J,K). הערה: יש להקפיד לא לייבש את הדגימות ולא להניח את שני הדיסקים לחלוטין זה על זה (אחרת, ניתוקם יהיה קשה מאוד בשלב הבא).</li>
	</ol></li>
	<li>כריך וצלילה הקפאה של בעלי חיים ורקמות אנושיות<ol>
<li>השתמש ברקמות בעלי חיים ובני אדם (~ 0.5 מ"מ x 0.5 מ"מ x 1.5 מ"מ) קבוע ב 2.5% glutaraldehyde-0.1 M חוצץ פוספט (pH 7.4) (איור 6A,B). פרוס אותם למקטעים בעובי 0.1 עד 0.2 מ"מ עם סכין גילוח מתחת לסטריאומיקוסקופ(איור 6C,D).<ol>
<li>הנח טיפה קטנה (~ 0.02 μL) של פתרון glutaraldehyde על דיסק נחושת (איור 6E, F). לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להניח פיסת רקמה בגלוטארלדהיד על דיסק הנחושת(איור 6G,H)ולכסות אותה בדיסק נחושת אחר (איור 6I-K).</li>
			<li>להקפיא במהירות את הדיסקים עם הרקמות בפרופאן ההיתוך של SFD, כמתואר בסעיף 1.4 (איור 5J,K). הערה: כמו glutaraldehyde הוא כימי מסוכן, זה צריך להיות מטופל לובש כפפות במכסה המנוע אדים. רקמות לא צריך להיות שטף עם חוצצים כאשר להציב על דיסק נחושת אבל נשמר ספוג פתרון glutaraldehyde כי glutaraldehyde יש אפקט אנטי הקפאה1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>הקפאה-החלפה עם אוסמיום אצטון<ol>
<li>מעבירים את הדיסקים לחנקן נוזלי באמבט עבודה(איור 7A,B). באמצעות זוג פינצטה מקורר בחנקן נוזלי, לנתק את הדיסקים אחד מהשני כדי לחשוף את הדגימה (איור 7C-E).</li>
		<li>מקם את הדיסקים עם התאים ב בקבוקון זכוכית (איור 7F) כי הוא מלא 1 מ"ל של אצטון המכיל 2% osmium tetroxide (איור 2B)כי כבר להציב חנקן נוזלי מוצק (איור 4H).</li>
		<li>העבירו את הדיסקים למקפיא עמוק ושמו אותם בטמפרטורה של -80°C למשך יומיים-ארבעה להקפאת התאים(איור 3). השרו את פינצטה משומשת במים בטמפרטורת החדר כדי לחמם אותם (איור 7G) להקפאת הדגימות הבאות. הערה: פינצטה לטיפול בדגימה צריכה להיות חמה (טמפרטורת החדר) מכיוון שפינצטה קרה עלולה להקפיא את הדגימה לפני הקפאה מהירה, מה שמוביל להיווצרות גבישי קרח.</li>
	</ol></li>
	<li>התחממות והטבעה לדוגמה<ol>
<li>הביאו בהדרגה את הדגימות לטמפרטורת החדר (2 שעות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס, 2 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-15 דקות בטמפרטורת החדר, איור 3 ואיור 8A),והעבירו את הדיסקים לצינורות פלסטיק בגודל 2 מ"ל המלאים ב-1 מ"ל שלאצטון (איור 3 ואיור 8B,C).</li>
		<li>הכן שרף אפוקסי על ידי ערבוב ריאגנטים במיכל פלסטיק חד פעמי באמצעות מערבל(איור 8D-F).</li>
		<li>החליפו את האצטון בשלב 1.7.1 ברציפות עם 30% שרף (באצטון), 60% שרף, ו 90% שרף בטמפרטורת החדר עבור 1 שעה כל אחד. לאחר מכן, להחליף את שרף 90% עם 100% שרף ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לבסוף, הטמינו את הדגימות ב-100%שרף (איור 8G-J)בתבנית הטמעת הסיליקון, והטמינו אותן ב-60 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות(איור 3). הערה: הדגימות צריכות להישאר מחוברות לדיסקים הנחושת לאורך כל ההליך (כדי להקל על החתך). השימוש במנגנון מסתובב או רועד אינו מומלץ במהלך תהליך ההטבעה מכיוון שהם תורמים מעט לחדירת השרף לתא. יתר על כן, הרטט מהמנגנון לפעמים גורם לדגימות להתנתק מדיסק הנחושת. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בן לילה היה להאיץ את החדירה של שרף לתוך התא בשל אנרגיה תרמית (השרף לא פולימר כי זה לא מכיל כל מאיץ).</li>
	</ol></li>
	<li>חיתוך בלוקים של דגימות<ol>
<li>הוציאו את הבלוקים הפולימריים מתבניות הסיליקון(איור 9A). כתוב את מספר הדגימה על הבלוק (איור 9B).</li>
		<li>הסר את דיסקי הנחושת מהבלוק עם סכין גילוח (איור 9C,D)ולחתוך את הדגימות מוטבע על פני השטח בלוק ל 0.7 מ"מ x 0.7 מ"מ באמצעות להב חיתוך קולי (איור 9E) וסכיני גילוח (איור 9F-H) תחת סטרימוקרופ31.</li>
		<li>מניחים את הבלוק במחזיק דגימה של אולטרה-מיקרודום(איור 9I)וחתכו את פני הבלוק בצורה חלקה עם סכין חיתוך יהלום(איור 9J,K).</li>
	</ol></li>
	<li>חיתוך מקטעים דקים במיוחד<ol>
<li>הסר את הבלוק מהמיקרוביום האולטרה-מיקרודום (איור 10A)31,הגדר אותו בסטריאומיקרוסקופ וחתוך אותו עוד יותר ל- 0.2 מ"מ x 0.3 מ"מ עם סכין גילוח (איור 10B, C).</li>
		<li>החל ניאופרן על הרשתות כדי להפוך אותם דבק(איור 10D). החזירו את הבלוק לאולטרה-מיקרודום, כסו את האולטרה-מיקרודום בכיסוי פלסטיק(איור 10E)31וחתכו קטעים בעובי 50-70 ננומטר(איור 10F-H).</li>
		<li>אחזרו את המקטעים באמצעות לולאה(איור 10I),הרכיבו אותם על רשתות נחושת של רשת 300 או 400 שטופלו בניאופרן, וייבשו אותם(איור 10J).</li>
	</ol></li>
	<li>הכתמת מקטעים ותצפית מתחת למיקרוסקופ האלקטרונים<ol>
<li>הגדר את הרשתות עם קטעים בחריץ של צינור חצי סיליקון (איור 11A)31,ולהשרות בתמיסת אצטט אורניל וצטט עופרת במשך 3 דקות כל אחד להכתמה (איור 11B-E)32.</li>
		<li>עבור שמרים ודגימות פטרייתיות, מניחים את הרשתות על נייר סינון (4 מ"מ x 4 מ"מ), מרימים אותן עם פינצטה, ומכסים אותן בסרט נפטליןפלזמה 33 על פני המים(איור 11F,G). הכנס את הרשתות למיקרוסקופ אלקטרונים והתבונן ב- 100 kV (איור 11H,I).</li>
	</ol></li>
</ol>2. הקפאה מהירה של וירוסים ומקרומולקולים
<ol><li>הכנת אתאן נוזלי הערה: השתמש cryogloves ומשקפי מגן בעת טיפול חנקן נוזלי. כמו אתאן הוא נפץ, יש להקפיד לא להשתמש בשריפות באותו החדר, וחלונות צריך להישמר פתוח. אתאן משמש כי הוא מתאדה במיקרוסקופ האלקטרונים בעוד פרופן לא.<ol>
<li>מלא את מיכל החנקן הנוזלי של ה- SFD בחנקן נוזלי. מלא את מיכל האתאן הנוזלי באתאן נוזלי על ידי החדרת גז אתאן דרך זרבובית עדינה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה והקפאה מהירה של מיקרוגרידים ודגימות<ol>
<li>הפוך את שני הפנים של הידרופילי microgrids על ידי טיפול בהם עם פריקה זוהרת (10 Pa, 400 V, 1 mA) באמצעות מנגנון יון sputter30.</li>
		<li>הגדר את microgrid ב- SFD ולהחיל 2 μL של הנגיף או השעיה macromolecular (1 חלבון מ"ג / מ"ל) על microgrids. הסר נוזל עודף באמצעות נייר מסנן ולהקפיא במהירות את microgrid על ידי לחיצה על כפתור ההזרקה של המנגנון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגדרת המיקרוגריד הקפוא במחזיק העברת הקפאה ותצפית מתחת למיקרוסקופ האלקטרונים<ol>
<li>מעבירים את המיקרוגרידים הקפואים בחנקן נוזלי, מוגדרים במחזיק העברת קריו מקורר בטמפרטורת חנקן נוזלי מראש, וצופים תחת מיקרוסקופ אלקטרונים בטמפרטורה נמוכה34.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

הדיון הבא מבוסס על יותר מ-120 ניסויי החלפת הקפאת סנדוויץ' ביותר מ-1,000 דגימות ויותר מ-70 ניסויים במיקרוסקופיה הקפאת-הקפאה-אלקטרונים ביותר מ-75 דגימות שנערכו במשך 36 שנים.
שיעור הצלחה להקפאה טובה על ידי הקפאת כריך שיעור ההצלחה בהשגת הקפאה טובה תלוי בדגימות. תאי Saccharomyces cerevisiae (שמרים) בתרבית בינונית YPD (1% תמצית שמרים, 2% פפטונה, 2% דקסטרוז) נתנו כמעט 100% הצלחה להקפאה טובה ללא היווצרות גביש קרח10,11,15,35,36. מינים אחרים של שמרים, כולל Shizosaccharomyces37,38,39,Cryptococcus14,40,41,42,43,44,45, Exophiala13,41,46,47,48, 49, Fusarium50,51,52, Aureobasidium53, קנדידה54,55, פלומייס56, אספרגילוס57, ו Trichosporon, גם הראה הקפאה טובה. חיידקים, כולל Mycobacterium58,59 ו- E. coli16, הראו גם הקפאה טובה. תאים בתרבית ותאי בעלי חיים מבודדים הראו הקפאה טובה הן לתאים חיים והן לתאים קבועים של גלוטרדהיד1,25,26,27,60. רקמות בעלי חיים ורקמות אנושיות קבועות של גלוטארלדהיד פרוסות לעובי של 0.1 עד 0.2 מ"מ הראו גם הקפאה טובה רוב הזמן1,28.
תנאים להקפאה טובה השתמש רק בתאים בשלב הגדילה ובמצב המתאימים. תאים בתרבית צריכים להיות בשלב המעריכי. החל כמויות קטנות מאוד של השעיות תאים של דגימות מרוכזות (עבור S. cerevisiae, ~ 0.02 μL של 3-5 × 109 תאים / מ"ל) על דיסק הנחושת. פרוסות קבועות גלוטרדהיד של רקמות בעלי חיים או בני אדם צריכות להיות גם קטנות מאוד (רצוי 0.3 מ"מ x 0.3 מ"מ x 0.1 מ"מ). מכיוון שקשה לחתוך פרוסות רקמות בעובי 0.1 מ"מ, פורסים רקמות רבות ובוחרים פרוסות דקות ושקופות למחצה. עבוד במהירות אך בזהירות, ואל תתנו לדגימות להתייבש. באיסוף דיסקי נחושת מוערמים עם פינצטה, לא ללחוץ על הדיסקים קשה מדי כדי למנוע ריסוק התאים והרקמות. טעינת דגימה היא הצעד החשוב ביותר להקפאה מוצלחת, והתנאים הנדרשים זהים לתנאים להקפאה טובה להקפאה בלחץ גבוה. הקוראים צריכים להתייחס לביקורת המצוינת של מקדונלד61.
יישומים אחרים מאמר זה מציג מיקרוגרפים אלקטרונים של חיידק, שמרים, תאים בתרבית, תאים בעלי חיים מבודדים, רקמות אנושיות וחלקיקי וירוס. ראינו הקפאה טובה של אצות ימיות קבועות של גלוטרדהיד. עם זאת, מבני התאים של אצות ירוקות במים מתוקים חיים נהרסו על ידי היווצרות גביש קרח. ערבוב תאים עם אלבומין סרום בקר 20% (BSA) הבטיח כי ההשמדה האולטרה-מבנית נשמרה היטב ללא נזק לקרח. השימוש של 20% BSA היה מועיל גם לשימור אולטרה מבנה של תאי גבעול של פטרייה. ניסויים על הקפאת תאים ורקמות צמח על ידי החלת 20% BSA נמשכים. למרות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים של דגימות הקפאה-הקפאה סנדוויץ 'לא נוסה, תצפית של מבני תאים שמורים היטב דווחה בעבר9.
הערות על שיטת הקפאת הכריך ההשמדה האולטרה-מבנית של התאים היא הטובה ביותר על ידי הקפאה מהירה והקפאה של תאים חיים. היווצרות גבישי קרח עם SFD ניתן להימנע על ידי הגבלת עובי התאים ≤30 מיקרומטר1. תיקון רקמות עם גלוטרלדהיד לעתים קרובות מניב שימור טוב יותר של מבנה התא להתבוננות בתאים בתרבית השעיה מכיוון קיבעון glutaraldehyde הופך את מבנה התא נוקשה יותר ומונע את השינויים האולטרה-מבניים האפשריים במהלך איסוף וצנטריפוגה של תאים חיים1. קיבוע גלוטרדהיד מאפשר גם את הארכת עומק ההקפאה עד 0.2 מ"מ1, בדומה לזו שהושגה בשיטת הקפאה בלחץ גבוה (HPF). לכן, ניתן להחליף את מכונת HPF ב- SFD להקפאה עמוקה של רקמות בעלי חיים ובני אדם.
כי רקמות קבוע glutaraldehyde ניתן לאחסן במשך יותר מ 2 שנים28, הקפאת כריך יכול להתבצע על פי הנוחות של המשתמש. תיקון רקמות עם glutaraldehyde גם מקל על חלוקת רקמות כי הרקמות להיות נוקשה יותר עם קיבעון. שלא כמו מכונת HPF, ה- SFD יכול לשמש להקפאה מהירה של וירוסים למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית ולתאים אאוקריוטים. יתר על כן, בהשוואה למכונת HPF, ה- SFD קטן, נייד, פחות יקר, וניתן לרכוש אותו על ידי מעבדות נוספות. אנו מקווים כי תכונות אלה של SFD לעזור מעבדות נוספות להשיג את מטרות המחקר שלהם28.
תכונות של המורפולוגיה הטבעית של תאים מבני התאים נמצאים במצבם הטבעי אם הם מראים את המראה הבא: מבני הממברנה של הממברנה החיצונית (איור 12A, B), קרום פלזמה ( איור12B,C; איור 13א-ד; ואיור 14E), מעטפת גרעינית (איור 12C, איור 13B-D, ואיור 14D-E), מיטוכונדריה ( איור12C, איור 13C, ואיור 14D), וחלילים ( איור12C) להראות קווי המתאר החלקים. הגרעין והחיילות כמעט עגולים(איור 12C). ריבוזומים מראים מראה ברור של אלקטרון צפוף בקוטר של כ-20 ננומטר(איור 12B,C; איור 13C; ואיור 14D). הציטופלסמה היא אלקטרון-רווחי (איור 12B, C; איור 13C; ואיור 14D).
ההשפעה של קיבוע גלוטרדהיד על מורפולוגיה של תאים קיבוע גלוטרדהיד בוצע עבור רקמות בעלי חיים או בני אדם לפני הקפאת כריך כדי להשיג אולטרה-מבנה נטול קריסטל קרח. המיקרוגרפים שהתקבלו בשיטה זו מראים תמונות ברורות להפליא דומות לאלה שהושגו על ידי הקפאה מהירה של רקמות חיות (איור 14)1. המחקרים על תאי שמרים, מיקרואורגניזמים במעמקי הים ותאים מתורבתים מראים כי העיוות של אולטרה מבנה נובע בעיקר קיבעון אוסמיום tetroxide והתייבשות על ידי אתנול בטמפרטורת החדר1,17,18,28. סמול דיווח גם כי למרות קיבוע glutaraldehyde אינו להרוס את הארגון של actin בפיברובלסטים תרבותיים, קיבוע אוסמיום tetroxide והתייבשות על ידי אצטון או אתנול בטמפרטורת החדר להרוס actin ארגון62.
לפיכך, מחקר מפורט על ההשפעות של קיבוע glutaraldehyde על מורפולוגיה התא צריך להתבצע. אונו פיתחה שיטת קריופיקסיציה in vivo שבה רקמות חיות קפואות במהירות מבלי לעצור את אספקת הדם63. הרקמות הוחלפו בהקפאה והוטמעו בשרף אפוקסי, וקטעים אולטרה-דקים נצפו. התמונות המיקרוסקופיות של האלקטרונים הראו את ההשמדה האולטרה-מבנית הקרובה ביותר לילידית של רקמות חיות בהשוואה לאלו שהושגו על ידי התייבשות כימית-קונבנציונלית ועל ידי הקפאה מהירה של רקמות טריות שלא התמלאו. לכן, זה עשוי להיות מעניין להשוות את ההשמדה ultrastructure המתקבל על ידי תחליף קיבוע גלוטרלדהיד (השיטה הנוכחית) ואלה על ידי in vivo cryofixation-הקפאת תחליף כדי לבחון את ההשפעות של קיבוע glutaraldehyde.
התחשבות בסביבה ויעילות ניסיונית מוגברת אנו משתמשים בצינורות פלסטיק 2 מ"ל להחלפת השרף. ML אחד של שרף מדולל מספיק לכל שלב החלפה. צינורות הפלסטיק המשומשים עשויים להיות מושלכים לאחר כל ניסוי. זה יכול לחסוך זמן ומאמץ לשטיפת בקבוקוני זכוכית כאשר הם משמשים להחלפת שרף. בנוסף, פתרון אצטט אורניל ניתן להשתמש שוב ושוב עבור סעיף כתמים32. לאחר הכתמת החלקים, ניתן לשמור ולהשתמש מחדש בפתרון אצטט אורניל. כמו אצטט אורניל הוא חומר רדיואקטיבי, השימוש החוזר שלה מסייע למנוע את הדור של פסולת ותורם להגנה על הסביבה.
סרט נפטלין עם פילם פילמרי פלזמה סרט נפטלין פלזמה-פילמרי הוא סרט פחמן פולימרי תלת מימדי עשוי גז נפטלין על ידי פילמור פלזמה תחתפריקה זוהרת 33. הסרט עמיד בפני הפגזת אלקטרונים וכימיקלים, נקי מאוד, שקוף מפני אלקטרונים, ויש לו משטח שטוח ומבנה אמורפי. לכן, סרט נפטלין פלזמה פולימר, אשר זמין מסחרית, הוא מעולה ומומלץ כסרט תמיכה.

מיקרוסקופיית אלקטרונים היא כלי רב עוצמה לחקר אולטרה-מבנה תאים. קיבעון כימי עם הליכי התייבשות קונבנציונליים שימש לצפייה אולטרה מבנה של תאים ורקמות. עם זאת, שיטה זו אינה משמרת כראוי את ההשמדה האולטרה של תאים, וחפצים ואת החילוץ של תוכן התא נצפים בדרך כלל. הקפאה מהירה והקפאה של תאים ורקמות הן חלופות טובות יותר לשימור מבנה התא.
שלוש שיטות עיקריות שימשו להקפאת תאים במהירות1: 1) הקפאת צלילה מבוצעת על ידי צלילה דגימות לתוך קריוגן מקורר, כגון פרופאן, והיה בשימוש מאז תחילת שנות ה -502; 2) הקפאת בלוק מתכת קרה מבוצעת על ידי טריקה מהירה של תאים ורקמות על בלוק מתכת מקורר עם חנקן נוזלי או הליום נוזלי3,4; ו 3) הקפאה בלחץ גבוה נעשית על ידי הקפאת תאים ורקמות עם חנקן נוזלי בלחץ גבוה5,6,7.
הקפאת כריך היא סוג של הקפאת צלילה המתבצעת על ידי כריכת חומרים ביולוגיים דקים בין שני דיסקים נחושת והקפאתם במהירות על ידי צלילה לתוך פרופן נוזלי8,9,10. בשיטה זו, דגימות דקות מאוד (בעובי של כמה מיקרומטרים) מקוררות במהירות עם קריוגן באמצעות מתכת שיש לה מוליכות תרמית טובה משני הצדדים. לכן, שיטה זו מסירה ביעילות חום מן הדגימות, מה שמאפשר להקפיא בייצוב תאים ללא נזק לקרח. הקפאת כריך, ואחריה הקפאת החלפה של שמרים חיים ותאי חיידקים, מגלה את ההשמדה הטבעית של תאים10,11,12,13,14,15,16.
לאחרונה, שיטה זו נמצאה שימושית לשימור תמונות תאים ברורים של מיקרואורגניזמים קבועים גלוטרלדהיד17,18,19,20,21,22,23,24, תאים מתורבתים25,26,27, ותאים ורקמות אנושיים1,28 . למרות שמחקרים אלה בוצעו באמצעות מכשיר הקפאת כריך בעבודת יד29, ויישומים למחקרים אחרים במעבדות אחרות הוגבלו, מכשיר הקפאת כריך חדש (SFD) כברמפוברק 28 והוא זמין כעת מסחרית.
המאמר הנוכחי מראה כיצד להשתמש ב- SFD להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות, כולל חיידקים, שמרים, תאים בתרבית, תאים מבודדים, רקמות בעלי חיים ובני אדם, ווירוסים. כמו כן מוצגת הכנת דגימות לחתך אולטרה-דק לאחר הקפאה מהירה, כמו גם נהלים להחלפת הקפאה, הטמעת שרף, חיתוך בלוקים, חיתוך מקטעים דקים במיוחד, שחזור מקטעים, כתמים וכיסוי של רשתות עם סרטי תמיכה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sandwich Freezing Device</td>
			<td>Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan</td>
			<td>MW-SFD-01</td>
			<td>with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL glass vials</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Scintillation counter vials for fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>3004</td>
			<td>0.1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer</td>
			<td>Sanyo Co. Ltd., Osaka</td>
			<td>MDF-C8V1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper disk</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged razor blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Feather, FAS-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-edged razor blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Feather, FA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shredded board</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Several pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers with polystyrene foam</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>One pair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>3052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propane gas</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Cryogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion sputter apparatus</td>
			<td>Hitachi high technologies, Tokyo</td>
			<td>Hitachi E102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For 1 mL, 200 &#956;L, and 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>Capsulefuge, PMC-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo et al.</td>
			<td>-</td>
			<td>SMZ 645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo et al.</td>
			<td>SM-LW 61 Ji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic container</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>50 mL and 200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Cryogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic syringes</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>340</td>
			<td>Quetol 812 set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon embedding mold</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>4217</td>
			<td>7 mm in diameter, 13 mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubater</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For 37 &#176;C and 60 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Tilting mechanism equipped, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Trimming Blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>5240</td>
			<td>EM-240, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna</td>
			<td>Ultracut S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2633, 2634</td>
			<td>300 mesh, 400 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Neoprene W solution</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect Loop</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2351</td>
			<td>Fot retrieving sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half Tube for section staining</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>463</td>
			<td>Refer to this pape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo</td>
			<td>DISMIC-03CP</td>
			<td>Cellulose acetate, 0.45 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid freezing using sandwich freezing device for good ultrastructural preservation of biological specimens in electron microscopy

קיבעון כימי שימש להתבוננות אולטרה מבנה של תאים ורקמות. עם זאת, שיטה זו אינה משמרת כראוי את ההשמדה האולטרה של תאים; חפצים ומיצוי של תוכן התא נצפים בדרך כלל. הקפאה מהירה היא חלופה טובה יותר לשימור מבנה התא. הקפאת כריך של שמרים חיים או חיידקים ואחריו הקפאה-תחליף שימשה להתבוננות אולטרה-מבנה טבעי מעודן של תאים. לאחרונה, הקפאת כריך של תאים בתרבית קבוע glutaraldehyde או רקמות אנושיות שימש גם כדי לחשוף את ההשמדה ultrastructure של תאים ורקמות. 
מחקרים אלה בוצעו עד כה עם מכשיר הקפאת כריך בעבודת יד, ויישומים למחקרים במעבדות אחרות הוגבלו. מכשיר חדש להקפאת כריך מפוברק לאחרונה וכעת זמין מסחרית. המאמר הנוכחי מראה כיצד להשתמש במכשיר הקפאת הכריך להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות, כולל חיידקים, שמרים, תאים מתורבתים, תאים מבודדים, רקמות בעלי חיים ובני אדם, ווירוסים. כמו כן מוצגת הכנת דגימות לחתך אולטרה-דק לאחר הקפאה מהירה והליכים להחלפת הקפאה, הטבעת שרף, חיתוך בלוקים, חיתוך מקטעים אולטרה-דקים, שחזור מקטעים, כתמים וכיסוי של רשתות עם סרטי תמיכה.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy at JoVE.com

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

כאן אנו מראים כיצד להשתמש במכשיר הקפאת הכריך להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות, כולל חיידקים, שמרים, תאים בתרבית, תאים מבודדים, רקמות בעלי חיים ובני אדם, ווירוסים. אנו גם מראים כיצד להכין דגימות לחתך אולטרה-דק לאחר הקפאה מהירה.

הקפאה מהירה באמצעות מכשיר הקפאת כריך לשימור אולטרה-מבני טוב של דגימות ביולוגיות במיקרוסקופיית אלקטרונים

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

על מנת להתבונן במבנה האולטרה הטבעי המעודן של תאים, יש צורך לתקן תאים על ידי הקפאה מהירה. הקפאת כריך היא אחת השיטות הטובות ביותר להקפאת תאים מבלי ליצור גבישי קרח. פרוטוקול זה מדגים את השימוש במכשיר הקפאת כריך, וגם מתאר את ההליך להכנת חלקים דקים במיוחד של דגימות שהוחלף בהקפאה לאחר הקפאת כריך.התחל להכין פרופן נוזלי על ידי מילוי מיכל החנקן הנוזלי של מכשיר הקפאת הכריך או SFD עם חנקן נוזלי. מלא את מיכל פרופן נוזלי עם פרופן נוזלי על ידי החדרת גז פרופן באמצעות זרבובית עדינה. להאיץ את התגבשות פרופאן באמצעות מוט מתכת מקורר.כדי להכין את הסוג השטוח ואת דיסקי נחושת סוג הסל, למקם אותם על שקופית זכוכית עם צד ללא אותיות למעלה ולטפל עם פריקה זוהרת ב 10 פסקל, 400 וולט, מיליאמפר אחד במשך 30 שניות כדי להפוך את משטח הדיסק הידרופילי באמצעות מנגנון תצפיתן יונים. העבר את ההשעיה התאית לצינור צנטריפוגה שני מיליליטר וצנטריפוגה ב 2, 900 פעמים G במשך 10 שניות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ולהשעות את הכדור כדי לקבל מתלה עבה.מניח כמות קטנה או כ 0.02 microliters של השעיית התא על דיסק נחושת. לכסות אותו עם דיסק נחושת אחר ולאסוף את הדיסקים עם פינצטה. הפוך באר במרכז הפרופן המוצק עם מוט המתכת הדק.הגדר את פינצטה ב- SFD והקפיא אותם במהירות על ידי לחיצה על כפתור ההזרקה של המנגנון. השרו את פינצטה משומשת במי טמפרטורת החדר כדי לחמם אותם להקפיא את הדגימות הבאות. השתמש ברקמות בעלי חיים ובני אדם קבוע ב 2.5%glutaraldehyde, 0.1 חוצץ פוספט טחון של pH 7.4.פורסים אותם לחלקים בעובי 0.1 עד 0.2 מילימטר עם סכין גילוח מתחת למיקרוסקופ סטריאו. מניחים טיפה קטנה של תמיסת glutaraldehyde על דיסק נחושת סוג הסל, ולאחר מכן להשתמש פינצטה למקם חתיכת רקמה glutaraldehyde על דיסק נחושת לכסות אותו עם דיסק נחושת שטוח. להקפיא במהירות את הדיסקים עם הרקמות בפרופאן ההיתוך של SFD כפי שהודגם קודם לכן.מעבירים את הדיסקים לחנקן נוזלי באמבט עובד. בעזרת פינצטה מקוררת בחנקן נוזלי, נתק את הדיסקים זה מזה כדי לחשוף את הדגימה. מניחים את הדיסקים עם התאים ב בקבוקון זכוכית כי הוא מלא מיליליטר אחד של אצטון המכיל 2%osmium tetroxide כי כבר ממוקם חנקן נוזלי מוצק.מעבירים את הדיסקים למקפיא עמוק ושומרים אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך יומיים עד ארבעה ימים להקפאת החלפת התאים. בהדרגה להביא את הדגימות לטמפרטורת החדר על ידי דגירה אותם במשך שעתיים במינוס 20 מעלות צלזיוס, שעתיים בארבע מעלות צלזיוס, ו 15 דקות בטמפרטורת החדר. העבר את הדיסקים לשני צינורות פלסטיק מיליליטר כי הם מלאים מיליליטר אחד של אצטון.הכן שרף אפוקסי על ידי ערבוב ריאגנטים במיכל פלסטיק חד פעמי באמצעות מערבל. החליפו את האצטון ברציפות עם 30% שרף באצטון, 60% שרף ו-90% שרף בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כל אחד, ואז החליפו את השרף 90% עם 100% שרף ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. לבסוף, הטמע את הדגימות ב 100% שרף בתבנית הטמעת סיליקון ופולימר אותם ב 60 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.מוציאים את הבלוקים הפולימריים מתבניות הסיליקון ומכתבים את מספר הדגימה בבלוק. הסר את דיסקי הנחושת מהבלוק עם סכין גילוח ולחתוך את הדגימות מוטבע על פני השטח בלוק באמצעות להב חיתוך קולי וסכיני גילוח תחת מיקרוסקופ סטריאו. לאחר מכן, החל סרט הדבקה על צ'אק בלוק הדגימה ומחזיק הדגימה של המיקרוטום וחתכו את הקלטת בגבול.הסר את הבלוק מן המיקרוטום אולטרה, להגדיר אותו במיקרוסקופ סטריאו, לקצץ אותו עוד יותר ל 0.2 מילימטרים על 0.3 מילימטרים באמצעות סכין גילוח. החל neoprene על הרשתות כדי להפוך אותם דבק. הגדר את הבלוק בחזרה למיקרוטומיה האולטרה על-ידי יישור החלקים המודבקים.לכסות את המיקרוטומיה האולטרה עם כיסוי פלסטיק לחתוך 50 עד 70 ננומטר קטעים בעובי. אחזר את המקטעים באמצעות לולאה. הר אותם על 300 או 400 רשתות נחושת רשת שטופלו neoprene ולייבש אותם.הגדר את הרשתות עם מקטעים בחריץ של צינור חצי סיליקון. משרים את הדגימות בתמיסת אצטט אורניל במשך שלוש דקות. לאסוף את פתרון אורניל בשימוש ולאחסן אותו במזרק.לשטוף את הדגימות בחצי צינור עם סילון מים, ולאחר מכן להשרות את הדגימות ציטוט עופרת במשך שלוש דקות. עבור שמרים ודגימות פטרייתיות, מניחים את הרשתות על נייר מסנן, להרים אותם עם פינצטה, ולכסות אותם עם סרט נפטלין פלזמה פולימר על פני המים. הכנס את הרשתות למחזיק הדגימה של מיקרוסקופ אלקטרונים, ולאחר מכן הכנס את מחזיק הדגימה למיקרוסקופ האלקטרונים והתבונן ב-100 קילו-וולט.חלקים דקים במיוחד של E.coli ו- S.cerevisiae כאשר נצפו תחת מיקרוסקופ האלקטרונים הראו מורפולוגיה טבעית ותמונות ברורות. חלקים דקים במיוחד של תאים בתרבית שהוקפאו במהירות באמצעות SFD נצפו תחת מיקרוסקופ האלקטרונים. התמונות של חלקים דקים במיוחד של העור האנושי היו ברורות מאוד והראו מורפולוגיה טבעית.חלקיקי הליבה של וירוס הפטיטיס B הוקפאו במהירות עם SFD ונצפתו על ידי מיקרוסקופיה אלקטרונית קריו. הדבר החשוב ביותר לזכור הוא שאתה צריך להחיל כמות קטנה מאוד של תאים על דיסקי נחושת, כך היווצרות גביש קרח נמנע על הקפאה. על ידי תיקון רקמות בעלי חיים עם glutaraldehyde מראש, הקפאה טובה בעומק של כ -200 מיקרומטר מושגת בדומה לעומק שהושג על ידי הקפאה בלחץ גבוה.טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקר להתבונן במבנה האולטרה הטבעי המעודן של תאים בקלות בעלות נמוכה.

Research

JoVE Journal

Biology

Freezing Human ES Cells

הקפאת ES תאים אנושיים

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

פלאש מקפיא Cryosectioning E12.5 מוח עכבר

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

הקפאה, הפשרה, ותאי אריזות התחבורה

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

מקפיא הפשרה בתאי גזע עובריים אנושיים

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

איתור מהיר של מבחני אחידים ביולוגית באמצעות מערכת מגנטית biosensing אפנון

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Triage רקמות ומקפיאים למודלים של מחלות שרירי שלד

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

טכני אלמנטים בסיסיים של ההקפאה-בר / הקפאה-לחרוט בביולוגי מיקרוסקופית אלקטרונים

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

אפיון של אירועים קלציפיקציה שימוש אופטי חיה מיקרוסקופית אלקטרונים טכניקות בתוך ימית תולעת-שפופרת

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...