Name: rapid freezing using sandwich freezing device for good ultrastructural preservation of biological specimens in electron microscopy
Uploaded: 2021-07-19T14:00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy at JoVE.com

MERK: Studiens protokoll for menneskelige prøver ble godkjent av Biomedical Research Ethics Committee ved Graduate School of Medicine, Chiba University (3085). Osmium tetroxide er et farlig kjemikalie; den skal håndteres med hansker i avtrekkshetten. Figur 1 viser sandwichfryseenheten og de nødvendige verktøyene28. Figur 2 viser materialene som er nødvendige for å utføre sandwichfrysende eksperimenter. Hetteglassene i glass er fylt med aceton som inneholder osmiumteroksid og oppbevares ved -80 °C til bruk (figur 2B). Kobberskiver er 3 mm i diameter, uten hull, har en bokstav på den ene siden og er kommersielt tilgjengelige (Figur 2C).
1. Rask frysing av cellesuspensjoner for fryseerstatning
MERK: Hele prosedyren er vist i figur 3.
<ol><li>Celler<ol>
<li>Bruk cellesuspensjoner av bakterier, gjær (figur 2A), dyrkede celler og isolerte celler for smørbrødfrysing. MERK: Både levende og glutaraldehydfaste celler kan brukes28.</li>
	</ol></li>
	<li>Fremstilling av flytende propan MERK: Bruk kryoginier og vernebriller ved håndtering av flytende nitrogen. Siden propan er eksplosiv, bør det tas hensyn til ikke å bruke branner i samme rom, og vinduer skal holdes åpne.<ol>
<li>Fyll den flytende nitrogenbeholderen til SFD med flytende nitrogen (Figur 4A). Fyll den flytende propanbeholderen med flytende propan ved å introdusere propangass ved hjelp av en fin dyse (Figur 4B,C). Akselerer størkningen av propan ved hjelp av en avkjølt metallstang (Figur 1 og Figur 4D,E).</li>
	</ol></li>
	<li>Forberedelse av kobberskiver<ol>
<li>Plasser kobberskiver på et glideglass med ikke-bokstavsiden opp (Figur 2D) og behandle med glødeutladning ved 10 Pa, 400 volt, 1 mA i 30 s (Figur 4F,G) for å gjøre diskoverflaten hydrofil ved hjelp av et ionsprutapparat30.</li>
	</ol></li>
	<li>Sandwiching og dykkfrysing av cellefjæringen<ol>
<li>Overfør cellesuspensjonen til et sentrifugerør på 2 ml (figur 5A) og sentrifuge ved 2900 × g i 10 s ved romtemperatur (Figur 5B,C). Fjern supernatanten, og suspender pelletsen for å få en tykk suspensjon (se diskusjon).</li>
		<li>Plasser en liten mengde av celleopphenget (~0,02 μL) på en kobberskive (Figur 5D-F), dekk den med en annen kobberskive (Figur 5G), og plukk opp diskene med pinsett (Figur 5H). MERK: For å måle ~0,02 μL av cellefjæringen, observere 0,1 μL dråper av suspensjonen under stereomikroskopet og dele dem i dråper som er 1/5th av dette volumet.</li>
		<li>Lag en brønn i midten av den faste propanen med den tynne metallstangen (Figur 5I). Sett pinsettene i en SFD og frys dem raskt ved å trykke på injeksjonsknappen på apparatet (Figur 5J,K). MERK: Det bør tas hensyn til ikke å tørke prøvene og ikke legge de to diskene helt over hverandre (ellers ville det bli svært vanskelig å løsne dem i neste trinn).</li>
	</ol></li>
	<li>Sandwiching og dykkfrysing av dyr og menneskelig vev<ol>
<li>Bruk dyre- og menneskevev (~0,5 mm x 0,5 mm x 1,5 mm) festet i 2,5 % glutaraldehyd-0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4) (Figur 6A, B). Skjær dem i 0,1- til 0,2 mm tykke seksjoner med et barberblad under et stereomikroskop (Figur 6C,D).<ol>
<li>Plasser en liten dråpe (~0,02 μL) glutaraldehydoppløsning på en kobberskive (Figur 6E, F). Bruk deretter pinsett til å plassere et stykke vev i glutaraldehyden på kobberskiven (Figur 6G,H) og dekk det med en annen kobberskive (Figur 6I-K).</li>
			<li>Frys diskene raskt med vevet i SFDs smeltepropan, som beskrevet i avsnitt 1.4 (Figur 5J,K). MERK: Siden glutaraldehyd er et farlig kjemikalie, bør det håndteres med hansker i avtrekkshetten. Vev bør ikke vaskes med buffere når de plasseres på en kobberskive, men holdes gjennomvåt i glutaraldehydoppløsning fordi glutaraldehyd har en antifrysende effekt1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Fryseerstatning med osmiumaceton<ol>
<li>Overfør diskene til flytende nitrogen i et arbeidsbad (Figur 7A, B). Bruk et par pinsett avkjølt i flytende nitrogen, løsne diskene fra hverandre for å eksponere prøven (Figur 7C-E).</li>
		<li>Plasser diskene med cellene i et hetteglass med glass (figur 7F) som er fylt med 1 ml aceton som inneholder 2 % osmiumtreetroksid (figur 2B) som er plassert i flytende nitrogen og størknet (Figur 4H).</li>
		<li>Overfør diskene til en dypfryser og hold dem ved -80 °C i 2-4 dager for fryseerstatning av cellene (figur 3). Bløtlegg de brukte pinsettene i vann ved romtemperatur for å varme dem (Figur 7G) for frysing av følgende prøver. MERK: Pinsett for håndtering av prøven skal være varm (romtemperatur) fordi kalde pinsett kan fryse prøven før rask frysing, noe som fører til dannelse av iskrystaller.</li>
	</ol></li>
	<li>Prøveoppvarming og innebygging<ol>
<li>Ta prøvene gradvis til romtemperatur (2 t ved -20 °C, 2 t ved 4 °C og 15 minutter ved romtemperatur, figur 3 og figur 8A), og overfør diskene til 2 ml plastrør som er fylt med 1 ml aceton (figur 3 og figur 8B,C).</li>
		<li>Forbered epoksyharpiks ved å blande reagensene i en engangs plastbeholder ved hjelp av en rører (Figur 8D-F).</li>
		<li>Bytt aceton i trinn 1.7.1 suksessivt med 30% harpiks (i aceton), 60% harpiks og 90% harpiks ved romtemperatur i 1 time hver. Bytt deretter 90% harpiks med 100% harpiks ved 37 °C over natten. Til slutt bygger du inn prøvene i 100 % harpiks (Figur 8G-J) i silisiuminnbyggingsformen og polymeriserer dem ved 60 °C i 24 timer (figur 3). MERK: Prøvene skal forbli festet til kobberskivene gjennom hele prosedyren (for å gjøre seksjonering enklere). Bruk av et roterende eller ristende apparat anbefales ikke under innbyggingsprosessen fordi de bidrar lite til penetrasjon av harpiksen i cellen. Videre får vibrasjonen fra apparatet noen ganger prøvene til å løsne fra kobberskivene. Inkubasjon ved 37 °C over natten ville akselerere inntrengningen av harpiksen i cellen på grunn av termisk energi (harpiksen ville ikke polymerisere fordi den ikke inneholder noen akselerator).</li>
	</ol></li>
	<li>Trimming av prøveblokker<ol>
<li>Ta ut de polymeriserte blokkene fra silisiuminnbyggingsformene (Figur 9A). Skriv prøvenummeret på blokken (Figur 9B).</li>
		<li>Fjern kobberskivene fra blokken med et barberblad (Figur 9C,D) og trim prøvene som er innebygd på blokkoverflaten til 0,7 mm x 0,7 mm ved hjelp av et ultralydtrimmeblad (Figur 9E) og barberblader (Figur 9F-H) under et stereomikroskop31.</li>
		<li>Sett blokken i en prøveholder av en ultramikrotomi (Figur 9I) og skjær ansiktet på blokken jevnt med en diamantkniv (Figur 9J,K).</li>
	</ol></li>
	<li>Skjære ultratynne seksjoner<ol>
<li>Fjern blokken fra ultramikrotomet (Figur 10A)31, sett den i et stereomikroskop og trim den videre til 0,2 mm x 0,3 mm med et barberblad (Figur 10B,C).</li>
		<li>Påfør neopren på gitteret for å gjøre dem selvklebende (Figur 10D). Sett blokken tilbake på ultramikrotomet, dekk til ultramikrotomet med et plastdeksel (Figur 10E)31, og kutt 50-70 nm tykke seksjoner (Figur 10F-H).</li>
		<li>Hent delene ved hjelp av en løkke (Figur 10I), monter dem på 300 eller 400 kobbergitter i nettet som behandles med neopren, og tørk dem (Figur 10J).</li>
	</ol></li>
	<li>Farging av seksjoner og observasjon under elektronmikroskopet<ol>
<li>Sett gitteret med seksjoner i sporet på det halve silikonrøret (Figur 11A)31, og suge i uranylacetatoppløsning og blysitrat i 3 min hver for farging (Figur 11B-E)32.</li>
		<li>For gjær og soppprøver, plasser gitteret på et filterpapir (4 mm x 4 mm), plukk dem opp med pinsett, og dekk dem med plasmapolymerisert naftalenfilm33 på overflaten av vannet (Figur 11F,G). Sett gitteret inn i et elektronmikroskop og observer ved 100 kV (Figur 11H,I).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Rask frysing av virus og makromolekyler
<ol><li>Fremstilling av flytende etan MERK: Bruk kryoginier og vernebriller ved håndtering av flytende nitrogen. Siden etan er eksplosivt, bør det tas hensyn til ikke å bruke branner i samme rom, og vinduer skal holdes åpne. Etan brukes fordi det fordamper i elektronmikroskopet mens propan ikke gjør det.<ol>
<li>Fyll den flytende nitrogenbeholderen til SFD med flytende nitrogen. Fyll den flytende etanbeholderen med flytende etan ved å introdusere etangass gjennom en fin dyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberedelse og rask frysing av mikronett og prøver<ol>
<li>Lag begge ansiktene på mikronettene hydrofile ved å behandle dem med glødeutladning (10 Pa, 400 V, 1 mA) ved hjelp av et ion sputterapparat30.</li>
		<li>Sett mikrogridet i SFD og påfør 2 μL av viruset eller makromolekylær suspensjon (1 mg protein/ml) på mikronettene. Fjern overflødig væske ved hjelp av filterpapir og frys mikronettet raskt ved å trykke på apparatets injeksjonsknapp.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Innstilling av det frosne mikronettet i en kryooverføringsholder og observasjon under elektronmikroskopet<ol>
<li>Overfør de frosne mikronettene i flytende nitrogen, sett i en kryooverføringsholder avkjølt ved flytende nitrogentemperatur på forhånd, og observer under et elektronmikroskop ved lav temperatur34.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Følgende diskusjon er basert på mer enn 120 sandwich frysefrysende substitusjonsforsøk på mer enn 1000 prøver og mer enn 70 dypfrysing-kryo-elektronmikroskopieksperimenter på mer enn 75 prøver utført over 36 år.
Suksessrate for god frysing ved smørbrødfrysing Graden av suksess for å oppnå god frysing avhenger av prøvene. Saccharomyces cerevisiae (gjær) celler dyrket i YPD medium (1% gjær ekstrakt, 2% peptone, 2% dextrose) ga nesten 100% suksess for god frysing uten iskrystalldannelse10,11,15,35,36. Andre gjærarter, inkludert Shizosaccharomyces37,38,39,Cryptococcus14,40,41,42,43,44,45, Exophiala13,41,46,47,48, 49, Fusarium50,51,52, Aureobasidium53, Candida54,55, Fellomyces56, Aspergillus57og Trichosporon, viste også god frysing. Bakterier, inkludert Mycobacterium58,59 og E. coli16, viste også god frysing. Dyrkede celler og isolerte dyreceller viste god frysing for både levende og glutaraldehydfaste celler1,25,26,27,60. Glutaraldehydfast dyr og humant vev skivet til 0,1 til 0,2 mm tykkelse viste også god frysing mesteparten av tiden1,28.
Forhold for god frysing Bruk bare celler i riktig vekststadium og -tilstand. Celler i kultur bør være i eksponentiell fase. Påfør svært små mengder cellesuspensjoner av konsentrerte prøver (for S. cerevisiae, ~ 0,02 μL 3-5 × 109 celler / ml) på kobberskiven. Glutaraldehydfaste skiver av dyr eller humant vev bør også være svært små (helst 0, 3 mm x 0, 3 mm x 0, 1 mm). Fordi kutting av 0,1 mm tykke vevsskiver er vanskelig, skjær mange vev og velg tynne og halv gjennomsiktige skiver. Arbeid raskt, men forsiktig, og ikke la prøvene tørke ut. Ved å plukke opp stablede kobberskiver med pinsett, ikke trykk diskene for hardt for å unngå å knuse cellene og vevene. Prøvelasting er det viktigste trinnet for vellykket frysing, og forholdene som kreves er de samme som betingelsene for god frysing for høytrykksfrysing. Lesere bør referere til den utmerkede anmeldelsen av McDonald61.
Andre applikasjoner Dette dokumentet presenterer elektronmikrografer av en bakterie, gjær, dyrkede celler, isolerte dyreceller, humant vev og viruspartikler. Vi observerte god frysing av glutaraldehydfaste marine alger. Imidlertid ble cellestrukturene til levende ferskvannsgrønne alger ødelagt av iskrystalldannelse. Blanding av celler med 20% bovint serumalbumin (BSA) sørget for at ultrastrukturen var godt bevart uten iskrystallskader. Bruken av 20% BSA var også gunstig for å bevare ultrastruktur av stilkceller av en sopp. Eksperimenter på frysing av planteceller og vev ved å bruke 20% BSA pågår. Selv om skanning av elektronmikroskopi av sandwichfrysing-fryse-erstattede prøver ikke er forsøkt, observasjon av godt bevarte cellestrukturer har blitt rapportert tidligere9.
Merknader om sandwichfrysingsmetoden Den nær-til-innfødte ultrastruktur av celler observeres best ved rask frysing og fryse-substitusjon av levende celler. Iskrystalldannelse med SFD kan unngås ved å begrense tykkelsen på cellene til ≤30 μm1. Å fikse vev med glutaraldehyd gir ofte bedre bevaring av cellestrukturen for å observere suspensjonskulturerte celler fordi glutaraldehydfiksering gjør cellestrukturen stivere og forhindrer mulige ultrastrukturelle endringer under innsamling og sentrifugering av levende celler1. Glutaraldehydfiksering gjør det også mulig å forlenge frysedybden til så mye som 0,2 mm1, tilsvarende det som oppnås ved høytrykksfrysingsmetoden (HPF). Derfor kan HPF-maskinen erstattes med SFD for dyp frysing av dyr og menneskelig vev.
Fordi glutaraldehydfast vev kan lagres i mer enn 2 år28, kan sandwichfrysing utføres i henhold til brukerens bekvemmelighet. Å fikse vev med glutaraldehyd letter også vevsseksjon fordi vevet blir stivere med fiksering. I motsetning til HPF-maskinen kan SFD brukes til rask frysing av virus for kryo-elektronmikroskopi og for bakterier og eukaryote celler. Sammenlignet med HPF-maskinen er SFD dessuten liten, bærbar, billigere og kan anskaffes av flere laboratorier. Vi håper at disse funksjonene i SFD hjelper flere laboratorier med å nå sine forskningsmål28.
Funksjoner av den naturlige morfologien til celler Cellestrukturer er i sin naturlige tilstand hvis de viser følgende utseende: Membranstrukturer av den ytre membranen (Figur 12A, B), plasmamembran ( Figur12B,C; Figur 13A-D; og Figur 14E), kjernefysisk konvolutt (Figur 12C, Figur 13B-Dog Figur 14D-E), mitokondrier ( Figur12C, Figur 13Cog Figur 14D) og vakuoler ( figur12C) viser jevne konturer. Kjernen og vakuolene er nesten sirkulære (Figur 12C). Ribosomer viser et klart elektrontett utseende med en diameter på ~ 20 nm (Figur 12B,C; Figur 13C; og figur 14D). Cytoplasma er elektron-lucent (Figur 12B,C; Figur 13C; og figur 14D).
Effekt av glutaraldehydfiksering på cellemorfologi Glutaraldehydfiksering ble utført for animalsk eller menneskelig vev før sandwichfrysing for å oppnå iskrystallfri ultrastruktur. Mikrografene oppnådd ved denne metoden viser utsøkt klare bilder som ligner de som oppnås ved rask frysing av levende vev (Figur 14)1. Studiene på gjærceller, dyphavsmikroorganismer og dyrkede celler viser at deformasjonen av ultrastruktur hovedsakelig skyldes osmium tetroksidfiksering og dehydrering ved etanol ved romtemperatur1,17,18,28. Small rapporterte også at selv om glutaraldehydfiksering ikke ødelegger organiseringen av aktin i dyrkede fibroblaster, osmium tetroxide fiksering og dehydrering ved aceton eller etanol ved romtemperatur ødelegge actin organisasjon62.
Derfor bør en detaljert studie om effekten av glutaraldehydfiksering på cellemorfologi utføres. Ohno utviklet en in vivo kryofixasjonsmetode der levende vev raskt fryses uten å stoppe blodtilførselen63. Vevet ble frysesubstituttet og innebygd i epoksyharpiks, og ultratynne seksjoner ble observert. De elektronmikroskopiske bildene viste den nærmeste til innfødte ultrastruktur av levende vev sammenlignet med de som ble oppnådd ved kjemisk fiksering-konvensjonell dehydrering og ved rask frysing av friske uløste vev. Derfor kan det være interessant å sammenligne ultrastruktur oppnådd ved glutaraldehydfikseringsfrysing (den nåværende metoden) og de ved in vivo kryofixation-fryse substitusjon for å undersøke effekten av glutaraldehydfiksering.
Hensynet til miljøet og økt eksperimentell effektivitet Vi bruker 2 ml plastrør til utskifting av harpiksen. En ml fortynnet harpiks er nok for hvert substitusjonstrinn. De brukte plastrørene kan kastes etter hvert eksperiment. Dette kan spare tid og krefter for vasking av hetteglass av glass når de brukes til harpikserstatning. I tillegg kan uranylacetatoppløsning brukes gjentatte ganger til seksjonsfarging32. Etter farging av seksjonene kan uranylacetatoppløsningen lagres og brukes på nytt. Siden uranylacetat er et radioaktivt stoff, bidrar gjenbruken til å unngå generering av avfall og bidrar til beskyttelse av miljøet.
Plasmapolymerisert naftalenfilm Plasmapolymerisert naftalenfilm er en tredimensjonalt polymerisert karbonfilm laget av naftalengass ved plasmapolymerisering under glødutslipp33. Filmen er motstandsdyktig mot elektronbombardement og kjemikalier, veldig rent, gjennomsiktig mot elektroner, og har en flat overflate og amorf struktur. Dermed er den plasmapolymeriserte naftalenfilmen, som er kommersielt tilgjengelig, utmerket og anbefales som støttefilm.

Elektronmikroskopi er et kraftig verktøy for å studere celle ultrastruktur. Kjemisk fiksering med konvensjonelle dehydreringsprosedyrer har blitt brukt til å observere ultrastruktur av celler og vev. Denne metoden bevarer imidlertid ikke tilstrekkelig ultrastruktur av celler, og artefakter og utvinning av celleinnhold observeres vanligvis. Rask frysing og fryse-substitusjon av celler og vev er bedre alternativer for bevaring av cellestruktur.
Tre hovedmetoder har blitt brukt for fryseceller raskt1: 1) frysing utføres ved å kaste prøver inn i et avkjølt kryogen, som propan, og ble brukt siden tidlig på 1950-tallet2; 2) kaldmetall blokkfrysing utføres ved raskt å smelle celler og vev på en metallblokk avkjølt med flytende nitrogen eller flytende helium3,4; og 3) høytrykksfrysing gjøres ved å fryse celler og vev med flytende nitrogen under høyt trykk5,6,7.
Sandwichfrysing er en type dypfrysing utført ved å smøre tynne biologiske materialer mellom to kobberskiver og raskt fryse dem ved å stupe i flytende propan8,9,10. I denne metoden avkjøles svært tynne prøver (noen få mikrometer tykke) raskt med kryogen ved hjelp av et metall som har god termisk ledningsevne fra begge sider. Dermed fjerner denne metoden effektivt varme fra prøvene, noe som gjør det mulig å fryse celler uten iskrystallskader. Sandwichfrysing, etterfulgt av fryse-substitusjon av levende gjær og bakterieceller, avslører den naturlige ultrastrukturen til cellene10,11,12,13,14,15,16.
Nylig har denne metoden vist seg å være nyttig for å bevare klare cellebilder av glutaraldehydfaste mikroorganismer17,18,19,20,21,22,23,24, dyrkede celler25,26,27og menneskelige celler og vev1,28 . Selv om disse studiene har blitt utført ved hjelp av en håndlaget sandwich fryseenhet29, og søknader til andre studier i andre laboratorier har vært begrenset, en ny sandwich fryseenhet (SFD) har blitt fabrikkert28 og er nå kommersielt tilgjengelig.
Det nåværende dokumentet viser hvordan du bruker SFD for rask frysing av biologiske prøver, inkludert bakterier, gjær, dyrkede celler, isolerte celler, animalske og menneskelige vev og virus. Også vist er forberedelsen av prøver for ultratynne seksjonering etter rask frysing, samt prosedyrer for fryse-substitusjon, harpiksinnbygging, trimming av blokker, kutting av ultratynne seksjoner, gjenoppretting av seksjoner, farging og tildekking av rutenett med støttefilmer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sandwich Freezing Device</td>
			<td>Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan</td>
			<td>MW-SFD-01</td>
			<td>with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL glass vials</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Scintillation counter vials for fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>3004</td>
			<td>0.1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer</td>
			<td>Sanyo Co. Ltd., Osaka</td>
			<td>MDF-C8V1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper disk</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged razor blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Feather, FAS-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-edged razor blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Feather, FA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shredded board</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Several pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers with polystyrene foam</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>One pair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>3052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propane gas</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Cryogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion sputter apparatus</td>
			<td>Hitachi high technologies, Tokyo</td>
			<td>Hitachi E102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For 1 mL, 200 &#956;L, and 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>Capsulefuge, PMC-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo et al.</td>
			<td>-</td>
			<td>SMZ 645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo et al.</td>
			<td>SM-LW 61 Ji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic container</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>50 mL and 200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Cryogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic syringes</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>340</td>
			<td>Quetol 812 set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon embedding mold</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>4217</td>
			<td>7 mm in diameter, 13 mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubater</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For 37 &#176;C and 60 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Tilting mechanism equipped, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Trimming Blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>5240</td>
			<td>EM-240, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna</td>
			<td>Ultracut S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2633, 2634</td>
			<td>300 mesh, 400 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Neoprene W solution</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect Loop</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2351</td>
			<td>Fot retrieving sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half Tube for section staining</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>463</td>
			<td>Refer to this pape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo</td>
			<td>DISMIC-03CP</td>
			<td>Cellulose acetate, 0.45 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid freezing using sandwich freezing device for good ultrastructural preservation of biological specimens in electron microscopy

Kjemisk fiksering har blitt brukt til å observere ultrastruktur av celler og vev. Denne metoden bevarer imidlertid ikke ultrastrukturen til celler tilstrekkelig; artefakter og utvinning av celleinnhold observeres vanligvis. Rask frysing er et bedre alternativ for bevaring av cellestruktur. Sandwichfrysing av levende gjær eller bakterier etterfulgt av fryseerstatning har blitt brukt til å observere den utsøkte naturlige ultrastrukturen til celler. Nylig har sandwichfrysing av glutaraldehydfaste dyrkede celler eller humant vev også blitt brukt til å avsløre ultrastruktur av celler og vev. 
Disse studiene har så langt blitt utført med en håndlaget sandwich fryseenhet, og søknader til studier i andre laboratorier har vært begrenset. En ny sandwich fryseenhet har nylig blitt fabrikkert og er nå kommersielt tilgjengelig. Det nåværende papiret viser hvordan du bruker sandwichfrysingsenheten for rask frysing av biologiske prøver, inkludert bakterier, gjær, dyrkede celler, isolerte celler, dyre- og menneskevev og virus. Også vist er forberedelsen av prøver for ultratynne seksjonering etter rask frysing og prosedyrer for fryse-substitusjon, harpiksinnbygging, trimming av blokker, kutting av ultratynne seksjoner, gjenoppretting av seksjoner, farging og belegg av rutenett med støttefilmer.

Levende celler av mikroorganismer i suspensjon ble samlet inn ved sentrifugering, smurt mellom to kobberskiver, raskt frosset med SFD, fryseerstatning, innebygd i epoksyharpiks, ultrathin-seksjonert, farget og observert under et elektronmikroskop ved å følge prosedyrene beskrevet ovenfor. Figur 12 viser ultratynne deler av Escherichia coli (bakterier, figur 12A,B)16 og Saccharomyces cerevisiae (gjær, figur 12C)15. Legg merke til at bildene er veldig klare og viser naturlig morfologi.
Glutaraldehydfaste cellesuspensjoner av dyrkede celler og isolerte dyreceller ble samlet og raskt frosset med SFD, frysesubstitutt og observert under et elektronmikroskop ved å følge prosedyrene beskrevet ovenfor. Figur 13 viser ultratynne deler av dyrkede celler (Figur 13A-C)1,28 og isolerte celler fra bukhulen i musen ( Figur13D)28. Figur 14 viser ultratynne deler av menneskelig hud (Figur 14A-D) og frakk(figur 14E)1. Legg merke til at bildene også er veldig klare og viser naturlig morfologi. Figur 15 viser hepatitt B-viruskjernepartikler som raskt fryses med SFD og observeres ved kryo-elektronmikroskopi34. Som med de andre cellene er bildene veldig klare og viser naturlig morfologi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig01.jpg"> Figur 1: Sandwich fryseenhet28 og nødvendige verktøy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig02.jpg"> Figur 2: Materialer som er nødvendige for å utføre sandwichfrysingsforsøk. (A) Prøve: Lett mikrograf av Saccharomyces cerevisiae (gjær). Skalastang = 10 μm. (B) Hetteglass (10 ml) som inneholder 1 ml aceton med 2% osmium tetroksid. (C) Kobberskiver som viser en overflate uten bokstav (venstre) og en overflate med en bokstav (høyre). Skalastang = 3 mm. Skanner elektronmikroskopi. (D) Kobberskiver uten bokstavside opp ble plassert på en glasssklie med dobbeltsidig tape (*). Skalastang = 3 mm. (E) En dobbeltkantet barberhøvel og en ødelagt dobbeltkantet barberhøvel for kutting av animalske og menneskelige vev, en enkantet barberhøvel for trimningsblokker og strimlet brett for kutting av dyr og menneskelig vev. (F) Pinsett med ekstrudert polystyrenskum for å beskytte fingrene mot kulde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig03.jpg"> Figur 3: Prøvepreparering av cellesuspensjoner ved hjelp av sandwichfrysingsmetoden. Forkortelser: r.t. = romtemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig04.jpg"> Figur 4: Tilberedning av flytende propan, kobberskiver og fikseringsmiddel. (A) Flytende nitrogen (pil) ble hellet i den flytende nitrogenbeholderen til sandwichfryseapparatet. Propangassble introdusert i en flytende propanbeholder gjennom en fin dyse. (C) Flytende propan (pil). (D) En metallstang (pil) ble brukt til å avkjøle flytende propan for å akselerere størkning av flytende propan. (E) Størknet propan (pil). (F) Ion sputterapparat (pil) for å lage kobberskiver hydrofile med glødutladning. (G) Glødutladning. (H) Hetteglass av glass plassert i flytende nitrogen i et arbeidsbad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig05.jpg"> Figur 5: Rask frysing av cellefjæring (gjær) ved hjelp av sandwichfryseapparatet. (A) Overføring av gjærkultur inn i sentrifugerøret. (B) Mikrosentrifuge. (C) Pellet av Saccharomyces cerevisiae i sentrifugerøret (pil). (D) Overføre prøven med en mikropipette fra sentrifugerøret. (E) Plasser prøven på kobberskiven. (F) En liten dråpe av en prøve på kobberskiven (pil). (G) Dekker prøven med en annen kobberskive. (H) Plukke de to diskene opp med pinsett. (I) Gjør en brønn i den faste propanen ved hjelp av den tynne metallstangen. (J) Dypfrysing av prøven ved å trykke på injeksjonsknappen. (K) Frysingen er fullført. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig06.jpg"> Figur 6: Klargjøre et eksemplar av humant vev (hud). (A, B) Menneskelig hudvev festet i glutaraldehyd i en Petri-tallerken. Skalastang = 5 mm. (C, D) Vev (pil) ble skiver ved hjelp av to dobbeltkantede barberhøvler på et makulert brett. (E, F) En liten dråpe glutaraldehydoppløsning (pil) ble plassert på en kobberskive. (G, H) Et stykke hudvev ble plassert på kobberskiven ved hjelp av pinsett. (I) En annen disk ble brukt til å dekke kobberskiven med hudvevet. (J) De sandwichede diskene ble plukket opp med pinsett. (K) De sandwichede diskene ble forsiktig holdt med pinsett. Legg merke til gapet mellom pinsettspissene (pilen) som opprettholdes for å unngå å knuse vevet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig07.jpg"> Figur 7: Overføre prøven til flytende nitrogen og løsne diskene. (A) Overføre diskene (pilen) til flytende nitrogen i et arbeidsbad. (B) Disker i flytende nitrogen (pil). (C) Pinsett ble plassert i flytende nitrogen for å avkjøle dem i arbeidsbadet. (D, E) Løsne kobberskivene (pilene) ved hjelp av pinsett. (F) Overføre disken (pilen) til hetteglasset med pinsett. (G) Oppvarming av pinsettene i vann for frysing av neste prøve. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig08.jpg"> Figur 8: Prøveoppvarming og innbygging. (A) Prøver i hetteglass i glass ved romtemperatur. (B) Overføre diskene (pilen) til et 2 ml plastrør med pinsett. (C) Kobberskiver (pil) i aceton i et plastrør. (D) Måling av harpikser med et injeksjonsrør (pil). (E) Overføre harpiksen til en engangskopp (pil). (F) Blanding av harpiksen ved hjelp av en rører. (G) En liten mengde harpiks ble plassert i hullene i silikoninnbyggingsformen. (H) Overflødig harpiks i gitteret ble fjernet med filterpapir. (I, J) Kobberskiver med prøver ble plassert i bunnen av hullene i innbyggingsformen med prøvesiden opp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig08large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig09.jpg"> Figur 9: Trimming av prøveblokken. (A) Ta ut polymeriserte blokker fra innbyggingsformene. (B) Eksemplarnummeret ble skrevet på blokken. (C, D) Kobberskiven ble fjernet fra blokken med en barberhøvel. Skalastang for (D) = 1 mm. (E-G) Prøven ble trimmet med et ultralyd skjæreblad og et barberblad. Skalastang for (G) = 1 mm. (H) Høy forstørrelse av (G). Et individuelt lyspunkt er en celle. Celler ble innebygd i ett enkelt lag10. Skalastang = 10 μm. (I-K) Overflaten på blokken ble kuttet glatt med en diamant trimkniv. Skalastang for (K) = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig09large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig10.jpg"> Figur 10: Skjæring av ultratynne seksjoner. (A) Prøveblokken ble fjernet fra mikrotom31. (B, C) Prøven ble videre trimmet med et barberblad. Skalastang for (C) = 0,5 mm. (D) Neopren ble brukt på gitter for å få dem til å feste seg. (E) Ultramikrotomet var dekket av plast for å unngå luftstrøm under ultratynn seksjonering. (F) Diamantknivbåten var fylt med vann. (G, H) Ultrathin seksjoner ble kuttet til en tykkelse på 70 nm. Skalastang for (H) = 1 mm. (I, J) Seksjonene ble hentet ved hjelp av en løkke og deretter tørket. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig10large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig11.jpg"> Figur 11: Fargesnitt. (A) Gitteret ble plassert i sporet på det halve silikonrøret. (B) De ble gjennomvåt i uranylacetat for farging. (C) Det brukte uranylacetatet ble samlet på selvforsegling av voksaktig film. (D) Gitteret ble vasket med en vannstråle og (E) deretter gjennomvåt i blysitrat. (F) Plasmapolymerisert naftalenfilm ble fløtet på vann og (G) brukes til å dekke et rutenett plassert på 4 mm x 4 mm filterpapir. (H) Gitteret ble plassert i en prøveholder og (I) observert i et elektronmikroskop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig11large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig12.jpg"> Figur 12: Ultratynne deler av Escherichia coli (bakterier, A, B) og Saccharomyces cerevisiae (gjær, C). (A) Legg merke til at prøvene er innebygd tett og homogent og ikke viser noen deformasjon. (B, C) Membranstrukturer viser klar og jevn morfologi, og ribosomer er klare nok til at hver partikkel kan listes opp16. (C) Gjærkjerner og vakuoler viser en ekte sirkelform, som kan være deres naturlige morfologi. Matrisen av mitokondriene viser et elektrontett utseende, som kan være karakteristisk for levende celler som er løst ved rask frysing. Skalastenger = 1 μm. Forkortelser: Faktisk vekt = cellevegg; ER = endoplasmic retikulum; NM = kjernefysisk membran; NP = kjerneporer; OM = ytre membran; PM = plasmamembraner; R = ribosomer; N = kjerne; M = mitokondrier. (B) reproduseres fra Yamada et al.16 med tillatelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig12large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig13.jpg"> Figur 13: Ultratynne seksjoner. (A-C) K562 dyrkede celler. (D) En isolert mastcelle fra musen. (A) Legg merke til at prøvene er innebygd tett og homogent og ikke viser noen deformasjon. Skalastang = 20 μm. (B-D) Ved høy forstørrelse observeres kjerne, kjerne, kjernemembran, kjerneporer, endoplasmatiske retikulum, mitokondrier, ribosomer og granulater tydelig. Skalastenger = 2 μm (B), 500 nm (C), 2 μm (D). Forkortelser: N = kjerne; Nu = kjerne; NM = kjernefysisk membran, NP = kjerneporer; ER = endoplasmic retikulum; M = mitokondrier; R = ribosomer; G = granulater; D = dele celler. (A) gjengis fra Yamaguchi et al.1 med tillatelse. (B-D) reproduseres fra Yamaguchi et al.28 med tillatelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig13large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig14.jpg"> Figur 14: Ultratynne seksjoner. (A-D) menneskelig hud og (E) buffy frakk. (A-E) Legg merke til at vev og cellebilder er klare og naturlige og viser god kontrast, selv om seksjonene er veldig tynne (50 nm). Matrisen til mitokondriene viser et tett utseende, som ligner på tette mitokondriematriser av raskt frosne levende celler (D). Skalastenger = 10 μm (A, E), 200 nm (B-D). Forkortelser: D = desmosomer; ER = endoplasmic retikulum; K = keratinocytt; KF = keratinfibre; M = mitokondrier; N = kjerne; NM = kjernefysisk membran; P = blodplate; R = ribosomer; W = hvite blodlegemer. Gjengitt fra Yamaguchi et al.28 med tillatelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig14large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig15.jpg"> Figur 15: Hepatitt B-viruskjernepartikler (HBV) fryses raskt med flytende etan ved hjelp av sandwichfryseenheten og observeres ved kryo-elektronmikroskopi. Sfæriske hule partikler er HBV-kjernepartikler. Skalastang = 100 nm. Forkortelser: HBV = hepatitt B-virus; I = is. Gjengitt fra Yamaguchi et al.28 med tillatelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig15large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy at JoVE.com

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Her viser vi hvordan du bruker sandwichfryseapparatet til rask frysing av biologiske prøver, inkludert bakterier, gjær, dyrkede celler, isolerte celler, animalske og menneskelige vev og virus. Vi viser også hvordan du lager prøver for ultratynne seksjonering etter rask frysing.

Rask frysing ved hjelp av sandwichfrysingsenhet for god ultrastrukturell bevaring av biologiske prøver i elektronmikroskopi

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

For å observere den utsøkte naturlige ultrastrukturen til celler, er det nødvendig å fikse celler ved rask frysing. Sandwichfrysing er en av de beste metodene for å fryse celler uten å danne iskrystaller. Denne protokollen demonstrerer bruken av sandwichfryseenhet, og beskriver også prosedyren for å lage ultratynne deler av frysesubstituttede prøver etter smørbrødfrysing.Begynn å tilberede flytende propan ved å fylle den flytende nitrogenbeholderen på sandwichfryseenheten eller SFD med flytende nitrogen. Fyll den flytende propanbeholderen med flytende propan ved å introdusere propangass ved hjelp av en fin dyse. Akselerer størkningen av propan ved å bruke en avkjølt metallstang.For å forberede kobberskiver av flat type og kurvtype, plasser dem på en glasssklie uten bokstavsiden opp og behandle med glødutladning ved 10 pascals, 400 volt, en milliampere i 30 sekunder for å gjøre skiveoverflaten hydrofil ved hjelp av et ionflekkapparat. Overfør cellefjæringen til et sentrifugerør med to milliliter og sentrifuger ved 2900 ganger G i 10 sekunder ved romtemperatur. Fjern supernatanten og suspender pelletsen for å få en tykk suspensjon.Plasser en liten mengde eller ca. 0,02 mikroliter av cellesuspensjonen på en kobberskive. Dekk den med en annen kobberskive og plukk opp platene med pinsett. Lag en brønn i midten av den faste propanen med den tynne metallstangen.Sett pinsettene i en SFD og frys dem raskt ved å trykke på apparatets injeksjonsknapp. Bløtlegg de brukte pinsettene i romtemperaturvann for å varme dem for å fryse følgende prøver. Bruk animalsk og menneskelig vev festet i 2,5% glutaraldehyd, 0,1 molar fosfatbuffer av pH 7,4.Skjær dem i 0,1 til 0,2 millimeter tykke seksjoner med et barberblad under et stereomikroskop. Legg en liten dråpe glutaraldehydoppløsning på kurvtypen kobberskive, og bruk deretter pinsett til å plassere et stykke vev i glutaraldehyden på kobberskiven og dekk den med den flate kobberskiven. Frys platene raskt med vevet i SFDs smeltende propan som vist tidligere.Overfør platene til flytende nitrogen i et arbeidsbad. Bruk et par pinsett avkjølt i flytende nitrogen, løsne skivene fra hverandre for å eksponere prøven. Plasser platene med cellene i et hetteglass av glass som er fylt med en milliliter aceton som inneholder 2% osmium tetroksid som er plassert i flytende nitrogen og størknet.Overfør platene til en dypfryser og hold dem på minus 80 grader Celsius i to til fire dager for fryseerstatning av cellene. Gradvis bringe prøvene til romtemperatur ved å inkubere dem i to timer ved minus 20 grader Celsius, to timer ved fire grader Celsius og 15 minutter ved romtemperatur. Overfør platene til to milliliter plastrør som er fylt med en milliliter aceton.Forbered epoksyharpiks ved å blande reagensene i en engangs plastbeholder ved hjelp av en rører. Bytt acetonen suksessivt med 30% harpiks i aceton, 60% harpiks og 90% harpiks ved romtemperatur i en time hver, og bytt deretter 90% harpiks med 100% harpiks ved 37 grader Celsius over natten. Til slutt legger du inn prøvene i 100% harpiks i silisiuminnbyggingsformen og polymeriserer dem ved 60 grader Celsius i 24 timer.Ta ut de polymeriserte blokkene fra silisiuminnbyggingsformene og skriv prøvenummeret på blokken. Fjern kobberskivene fra blokken med et barberblad og trim prøvene som er innebygd på blokkoverflaten ved hjelp av et ultralydtrimmeblad og barberblader under et stereomikroskop. Påfør deretter tape på prøveblokkchucken og prøveholderen på mikrotomen og kutt båndet ved grensen.Fjern blokken fra ultramikrotomet, sett den i et stereomikroskop, og trim den videre til 0,2 millimeter med 0,3 millimeter ved hjelp av et barberblad. Påfør neopren på gitteret for å gjøre dem selvklebende. Sett blokken tilbake på ultramikrotomet ved å justere de teipede delene.Dekk ultramikrotomet med et plastdeksel og kutt 50 til 70 nanometer tykke seksjoner. Hent inndelingene ved hjelp av en løkke. Monter dem på 300 eller 400 mesh kobbergitter behandlet med neopren og tørk dem.Sett gitteret med seksjoner i sporet på det halve silikonrøret. Bløtlegg prøvene i uranylacetatoppløsning i tre minutter. Samle den brukte uranyloppløsningen og oppbevar den i en sprøyte.Vask prøvene i et halvt rør med en vannstråle, og suge deretter prøvene i blysitrat i tre minutter. For gjær og soppprøver, plasser gitteret på et filterpapir, plukk dem opp med pinsett, og dekk dem med plasmapolymerisert naftalenfilm på vannoverflaten. Sett gitteret inn i prøveholderen til et elektronmikroskop, sett deretter prøveholderen inn i elektronmikroskopet og observer ved 100 kilovolt.Ultratynne deler av både E.coli og S.cerevisiae når de observeres under elektronmikroskopet, viste naturlig morfologi og klare bilder. Ultratynne deler av dyrkede celler som raskt ble frosset ved hjelp av SFD, ble observert under elektronmikroskopet. Bildene av ultratynne deler av menneskelig hud var veldig klare og viste naturlig morfologi.Hepatitt B-viruskjernepartikler ble raskt frosset med SFD og observert ved kryoelektronmikroskopi. Det viktigste å huske er at du bør bruke svært liten mengde celler på kobberskivene slik at iskrystalldannelse forhindres ved frysing. Ved å fikse dyrevev med glutaraldehyd på forhånd oppnås god frysing på en dybde på ca. 200 mikrometer som ligner dybden oppnådd ved høytrykksfrysing.Denne teknikken baner vei for en forsker å observere den utsøkte naturlige ultrastrukturen til celler lett til lav pris.

Research

JoVE Journal

Biology

Freezing Human ES Cells

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Tissue Triage og Frysing av modeller av Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Fundamental Teknisk Elements of Freeze-brudd / Freeze-etch i biologisk Elektronmikroskopi

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Høytrykks Frysing og Quick Freeze Bytte av plantemateriale for transmisjonselektronmikroskopi

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Plunge Frysing: Et verktøy for Ultra og Immunolocalization Studier av suspensjonsceller i transmisjonselektronmikroskopi

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Karakterisering av Forkalkning Hendelser Bruke levende Optiske og elektronmikroskopi teknikker i en Marine tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...