Name: rapid freezing using sandwich freezing device for good ultrastructural preservation of biological specimens in electron microscopy
Uploaded: 2021-07-19T14:00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy at JoVE.com

Никакой

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол исследования для образцов человека был одобрен Комитетом по этике биомедицинских исследований Высшей школы медицины Университета Тиба (3085). Тетроксид осмия является опасным химическим веществом; с ним следует обращаться в перчатках в вытяжном капюшоне. На фиг.1 показано сэндвич-морозильное устройство и необходимые инструменты28. На рисунке 2 показаны материалы, необходимые для проведения экспериментов по замораживанию сэндвичей. Стеклянные флаконы заполняют ацетоном, содержащим тетроксид осмия, и держат при -80°C до использования(рисунок 2B). Медные диски имеют диаметр 3 мм, без отверстий, имеют букву с одной стороны и коммерчески доступны(рисунок 2C).
1. Быстрое замораживание клеточных суспензий для замораживания-замещения
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура показана на рисунке 3.
<ol><li>Клетки<ol>
<li>Используйте клеточные суспензии бактерий, дрожжей(рисунок 2А),культивируемых клеток и изолированных клеток для замораживания сэндвичей. ПРИМЕЧАНИЕ: Могут быть использованы как живые, так и глутароальдегидно-фиксированные клетки28.</li>
	</ol></li>
	<li>Получение жидкого пропана ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте криоглавы и очки при работе с жидким азотом. Поскольку пропан взрывоопасен, следует соблюдать осторожность, чтобы не использовать пожары в одной комнате, а окна должны быть открыты.<ol>
<li>Заполните контейнер с жидким азотом SFD жидким азотом(рисунок 4A). Заполните контейнер с жидким пропаном жидким пропаном, введя газ пропан с помощью тонкого сопла(рисунок 4B,C). Ускорьте затвердевание пропана с помощью охлаждаемого металлического стержня(рисунок 1 и рисунок 4D,E).</li>
	</ol></li>
	<li>Подготовка медных дисков<ol>
<li>Поместите медные диски на скользящее стекло без буквенной стороной вверх(рисунок 2D)и обработайте тлеющим разрядом при 10 Па, 400 вольт, 1 мА в течение 30 с(фиг.4F,G),чтобы сделать поверхность диска гидрофильной с помощью ионного распылительного аппарата30.</li>
	</ol></li>
	<li>Сэндвичинг и погружная заморозка клеточной суспензии<ol>
<li>Переложите клеточную суспензию в 2-мл центрифужную трубку(фиг.5А)и центрифугу при 2,900 × г в течение 10 с при комнатной температуре(Фиг.5В,С). Удалите супернатант и приостановите гранулу, чтобы получить толстую суспензию (см. обсуждение).</li>
		<li>Поместите небольшое количество суспензии ячейки (~0,02 мкл) на медный диск(рисунок 5D-F),накройте его другим медным диском(рисунок 5G)и подберите диски пинцетом(рисунок 5H). ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы измерить ~0,02 мкл клеточной суспензии, наблюдают 0,1 мкл капель суспензии под стереомикроскопом и делят их на капли, которые составляют1/5 этой суммы.</li>
		<li>Сделайте лунку в центре из твердого пропана с тонким металлическим стержнем(рисунок 5I). Установите пинцет в SFD и быстро заморозьте их, нажав кнопку впрыска аппарата(рисунок 5J,K). ПРИМЕЧАНИЕ: Следует позаботиться о том, чтобы не высушить образцы и не уложить два диска полностью друг на друга (в противном случае их отсоединение станет очень трудным на следующем этапе).</li>
	</ol></li>
	<li>Сэндвичинг и погружение-замораживание тканей животных и человека<ol>
<li>Используют ткани животных и человека (~0,5 мм х 0,5 мм х 1,5 мм), закрепленные в 2,5% глутар-0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4)(Рисунок 6А,В). Нарежьте их на участки толщиной от 0,1 до 0,2 мм лезвием бритвы под стереомикроскопом(рисунок 6C,D).<ol>
<li>Поместите небольшую каплю (~0,02 мкл) раствора глутаральдегида на медный диск(рисунок 6E,F). Затем используйте пинцет, чтобы поместить кусочек ткани в глутаровый альдегид на медный диск(рисунок 6G,H)и покрыть его другим медным диском(рисунок 6I-K).</li>
			<li>Быстро замораживают диски с тканями в плавящемся пропане SFD, как описано в разделе 1.4(Рисунок 5J,K). ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку глутаровый альдегид является опасным химическим веществом, с ним следует обращаться в перчатках в вытяжном капюшоне. Ткани не следует промывать буферами при размещении на медном диске, а хранить в растворе глутаралальдегида, поскольку глутаровый альдегид обладает антимерзающим эффектом1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Замораживание-замещение ацетоном осмия<ol>
<li>Переведите диски в жидкий азот в рабочей ванне(рис. 7А,В). Используя пару пинцетов, охлажденных в жидком азоте, отсоедините диски друг от друга, чтобы обнажить образец(рисунок 7C-E).</li>
		<li>Поместите диски с ячейками в стеклянный флакон(рисунок 7F),который заполнен 1 мл ацетона, содержащего 2% тетроксида осмия(рисунок 2B),который был помещен в жидкий азот и затвердел(рисунок 4H).</li>
		<li>Переложите диски в морозильную камеру и держите их при -80°C в течение 2-4 дней для замораживания-замещения ячеек(рисунок 3). Замочите использованный пинцет в воде комнатной температуры, чтобы согреть их(рисунок 7G)для замораживания следующих образцов. ПРИМЕЧАНИЕ: Пинцет для обработки образца должен быть теплым (комнатная температура), поскольку холодный пинцет может заморозить образец до быстрого замерзания, что приведет к образованию кристаллов льда.</li>
	</ol></li>
	<li>Подогрев и встраивание образцов<ol>
<li>Постепенно доводят образцы до комнатной температуры (2 ч при -20°С, 2 ч при 4°С и 15 мин при комнатной температуре, Фиг.3 и Фиг.8А)и переносят диски в 2-мл пластиковые трубки, которые заполнены 1 мл ацетона(Фиг.3 и Фиг.8В,С).</li>
		<li>Готовят эпоксидную смолу путем смешивания реагентов в одноразовом пластиковом контейнере с помощью мешалки(рисунок 8D-F).</li>
		<li>Замените ацетон на стадии 1.7.1 последовательно на 30% смолу (в ацетоне), 60% смолу и 90% смолу при комнатной температуре в течение 1 ч каждая. Затем замените 90% смолу на 100% смолу при 37°C в течение ночи. Наконец, встраиваем образцы в 100% смолу(рисунок 8G-J)в кремниевую форму для встраивания и полимеризуем их при 60°C в течение 24 ч(рисунок 3). ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны оставаться прикрепленными к медным дискам на протяжении всей процедуры (для облегчения сечения). Использование вращающегося или встряхивающего аппарата не рекомендуется во время процесса встраивания, поскольку они мало способствуют проникновению смолы в клетку. Более того, вибрация от аппарата иногда заставляет образцы отделяться от медных дисков. Инкубация при 37°C в течение ночи ускорит проникновение смолы в ячейку за счет тепловой энергии (смола не полимеризуется, потому что не содержит ускорителя).</li>
	</ol></li>
	<li>Обрезка образцов блоков<ol>
<li>Извлеките полимеризованные блоки из кремниевых встраивающих форм(рисунок 9А). Напишите номер образца на блоке(рисунок 9B).</li>
		<li>Извлеките медные диски из блока с помощью лезвия бритвы(рисунок 9C,D)и обрежьте образцы, встроенные в поверхность блока, до 0,7 мм х 0,7 мм с помощью ультразвукового лезвия обрезки(рисунок 9E)и лезвий бритвы(рисунок 9F-H)под стереомикроскопом31.</li>
		<li>Установите блок в держатель образца ультрамикротома(рисунок 9I)и плавно орежьте поверхность блока алмазным обрезным ножом(рисунок 9J,K).</li>
	</ol></li>
	<li>Резка ультратонких профилей<ol>
<li>Снимите блок с ультрамикротома(рисунок 10А)31,установите его в стереомикроскоп и обрежьте далее до 0,2 мм х 0,3 мм лезвием бритвы(рисунок 10B,C).</li>
		<li>Нанесите неопрен на сетки, чтобы сделать их клейкими(рисунок 10D). Установите блок обратно на ультрамикротом, накройте ультрамикротом пластиковую крышку(рисунок 10E)31и вырежьте срезы толщиной 50-70 нм(рисунок 10F-H).</li>
		<li>Извлеките срезы с помощью петли(рисунок 10I),смонтируйте их на 300 или 400 сетчатых медных сетках, обработанных неопреном, и высушите их(рисунок 10J).</li>
	</ol></li>
	<li>Окрашивание срезов и наблюдение под электронным микроскопом<ol>
<li>Устанавливают сетки с прорезями в канавке полусиликоновой трубки(фиг.11А)31,и замачивают в растворе уранилацетата и цитрате свинца на 3 мин каждая для окрашивания(фиг.11В-Е)32.</li>
		<li>Для дрожжевых и грибковых образцов поместите сетки на фильтровальную бумагу (4 мм х 4 мм), подберите их пинцетом и накройте плазмополимеризованной нафталиновой пленкой33 на поверхностиводы (фиг.11F,G). Вставьте сетки в электронный микроскоп и наблюдайте при 100 кВ(рисунок 11H,I).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Быстрое замораживание вирусов и макромолекул
<ol><li>Приготовление жидкого этана ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте криоглавы и очки при работе с жидким азотом. Поскольку этан взрывоопасен, следует соблюдать осторожность, чтобы не использовать огонь в одной комнате, а окна должны быть открыты. Этан используется, потому что он испаряется в электронном микроскопе, а пропан нет.<ol>
<li>Заполните контейнер с жидким азотом SFD жидким азотом. Заполните контейнер с жидким этаном жидким этаном, введя газ этан через тонкое сопло.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Подготовка и быстрая заморозка микросетей и образцов<ol>
<li>Сделать обе грани микросетей гидрофильными, обработав их тлеющим разрядом (10 Па, 400 В, 1 мА) с помощью ионно-напыляющего аппарата30.</li>
		<li>Поместите микросеть в SFD и нанесите 2 мкл вируса или макромолекулярной суспензии (1 мг белка / мл) на микросети. Удалите лишнюю жидкость с помощью фильтровальной бумаги и быстро заморозьте микросеть, нажав кнопку впрыска аппарата.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Установка замороженной микросети в криотрансферный держатель и наблюдение под электронным микроскопом<ol>
<li>Перенесите замороженные микросети в жидкий азот, установленный в криотрансферный держатель, предварительно охлажденный при температуре жидкого азота, и наблюдайте под электронным микроскопом при низкой температуре34.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Следующее обсуждение основано на более чем 120 экспериментах по замещению замораживания-замораживания сэндвичей на более чем 1000 образцах и более чем 70 экспериментах по плюнг-замораживанию-криоэлектронной микроскопии на более чем 75 образцах, проведенных в течение 36 лет.
Успешность хорошей заморозки путем замораживания сэндвичей Скорость успеха в достижении хорошей заморозки зависит от образцов. Клетки Saccharomyces cerevisiae (дрожжи), культивируемые в среде YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% декстрозы), дали почти 100% успех для хорошей заморозки без образования кристалловльда 10,11,15,35,36. Другие виды дрожжей, в том числе Shizosaccharomyces37,38,39,Cryptococcus14,40,41,42,43,44,45, Exophiala13,41,46,47,48, 49, Fusarium50,51,52, Aureobasidium53, Candida54,55, Fellomyces56, Aspergillus57и Trichosporon, также показали хорошую заморозку. Бактерии, в том числе Mycobacterium58,59 и E. coli16,также показали хорошую заморозку. Культивируемые клетки и изолированные клетки животных показали хорошую заморозку как для живых, так и для глутаровых альдегид-фиксированных клеток1,25, 26,27,60. Глутаровые фиксированные ткани животных и человека, нарезанные до толщины от 0,1 до 0,2 мм, также показали хорошую заморозку большую частьвремени 1,28.
Условия для хорошей заморозки Используйте только клетки в соответствующей стадии роста и состоянии. Клетки в культуре должны находиться в экспоненциальной фазе. Нанесите очень небольшое количество клеточных суспензий концентрированных образцов (для S. cerevisiae,~0,02 мкл 3-5 ×10 9 клеток/мл) на медный диск. Фиксированные глутаровым альдегидом срезы тканей животных или человека также должны быть очень маленькими (предпочтительно 0,3 мм х 0,3 мм х 0,1 мм). Поскольку разрезать срезы тканей толщиной 0,1 мм сложно, нарежьте много тканей и выберите тонкие и полупрозрачные ломтики. Работайте быстро, но осторожно, и не дайте образцам высохнуть. При подборе сложенных медных дисков пинцетом не нажимайте на диски слишком сильно, чтобы избежать раздавливания клеток и тканей. Загрузка образцов является наиболее важным шагом для успешного замораживания, и требуемые условия такие же, как и условия для хорошего замораживания для замораживания под высоким давлением. Читателям стоит обратиться к отличному обзору McDonald61.
Другие области применения В этой статье представлены электронные микроснимки бактерии, дрожжей, культивируемых клеток, изолированных клеток животных, тканей человека и вирусных частиц. Мы наблюдали хорошее замерзание морских водорослей, закрепленных глутаровым альдегидом. Однако клеточные структуры живых пресноводных зеленых водорослей были разрушены образованием кристаллов льда. Смешивание клеток с 20% бычьим сывороточным альбумином (BSA) гарантировало, что ультраструктура хорошо сохранилась без повреждения кристаллами льда. Использование 20% BSA также было полезно для сохранения ультраструктуры клеток стебля гриба. Продолжаются эксперименты по замораживанию растительных клеток и тканей путем нанесения 20% BSA. Хотя сканирующая электронная микроскопия образцов с замораживанием-замораживанием-замораживанием не была предпринята, наблюдение за хорошо сохранившимися клеточными структурами сообщалосьранее 9.
Примечания по методу замораживания сэндвичей Близкая к нативной ультраструктура клеток лучше всего наблюдается при быстром замораживании и замораживании-замещении живых клеток. Образования кристаллов льда с SFD можно избежать, ограничив толщину ячеек до ≤30 мкм1. Фиксация тканей глутаровым альдегидом часто дает лучшее сохранение клеточной структуры для наблюдения за суспензионными культивируемыми клетками, поскольку фиксация глутарового альдегида делает клеточную структуру более жесткой и предотвращает возможные ультраструктурные изменения при сборе и центрифугировании живыхклеток1. Фиксация глутаральдегида также позволяет увеличить глубину замерзания до 0,2 мм1,аналогично тому, что достигается методом замораживания под высоким давлением (HPF). Поэтому машина HPF может быть заменена на SFD для глубокой заморозки тканей животных и человека.
Поскольку глутаральдегидно-фиксированные ткани могут храниться более 2 лет28,замораживание сэндвичей может быть выполнено в соответствии с удобством пользователя. Фиксация тканей глутаральдегидом также облегчает сечение тканей, потому что ткани становятся более жесткими с фиксацией. В отличие от машины HPF, SFD может использоваться для быстрого замораживания вирусов для криоэлектронной микроскопии, а также для бактерий и эукариотических клеток. Более того, по сравнению с машиной HPF, SFD небольшой, портативный, менее дорогой и может быть приобретен большим количеством лабораторий. Мы надеемся, что эти особенности SFD помогут большему количеству лабораторий достичь своих исследовательских целей28.
Особенности естественной морфологии клеток Клеточные структуры находятся в своем естественном состоянии, если они показывают следующий вид: Мембранные структуры наружной мембраны(Рисунок 12А,В),плазматическая мембрана(Фиг.12В,С); Рисунок 13А-D; и рисунок 14E),ядерная оболочка (рисунок 12C, рисунок 13B-Dи рисунок 14D-E),митохондрии(рисунок 12C, рисунок 13Cи рисунок 14D)и вакуоли(рисунок 12C)показывают гладкие контуры. Ядро и вакуоли почти круглые(рисунок 12С). Рибосомы показывают четкий электронно-плотный вид диаметром ~20 нм(рисунок 12B,C); Рисунок 13C; и рисунок 14D). Цитоплазма электрон-люцентная(рисунок 12B,C; Рисунок 13C; и рисунок 14D).
Влияние фиксации глутаральдегида на морфологию клеток Фиксацию глутаральдегида выполняли для тканей животных или человека перед замораживанием сэндвича для получения ультраструктуры без кристаллов льда. Микроснимки, полученные этим методом, показывают изысканно четкие изображения, аналогичные тем, которые получаются при быстром замораживании живых тканей(рисунок 14)1. Исследования дрожжевых клеток, глубоководных микроорганизмов и культивируемых клеток показывают, что деформация ультраструктуры в основном обусловлена фиксацией тетроксида осмия и обезвоживанием этанолом при комнатной температуре1,17,18,28. Смолл также сообщил, что, хотя фиксация глутаральдегида не разрушает организацию актина в культивируемых фибробластах, фиксация тетроксида осмия и обезвоживание ацетоном или этанолом при комнатной температуре разрушают актин организации62.
Следовательно, должно быть проведено детальное изучение влияния фиксации глутарового альдегида на морфологию клеток. Оно разработал метод криофиксации in vivo, при котором живые ткани быстро замораживаются без остановки кровоснабжения63. Ткани были заморожены и встроены в эпоксидную смолу, и наблюдались ультратонкие срезы. Электронные микроскопические изображения показали наиболее близкую к нативной ультраструктуру живых тканей по сравнению с теми, которые были получены путем химической фиксации-обычного обезвоживания и быстрого замораживания свежих нефиксированных тканей. Поэтому может быть интересно сравнить ультраструктуру, полученную путем фиксации глутаральдегида-замораживания (настоящий метод), и ультраструктуру, полученную путем криофиксации-замораживания in vivo, для изучения эффектов фиксации глутаральдегида.
Учет окружающей среды и повышение эффективности экспериментов Мы используем пластиковые трубки по 2 мл для замены смолы. Одного мл разбавленной смолы достаточно для каждого этапа замены. Использованные пластиковые трубки могут быть выброшены после каждого эксперимента. Это может сэкономить время и силы для мытья стеклянных флаконов, когда они используются для замены смолы. Кроме того, раствор уранилацетата может быть использован многократно для окрашивания сечения32. После окрашивания срезов раствор уранилацетата можно сохранить и повторно использовать. Поскольку уранилацетат является радиоактивным веществом, его повторное использование помогает избежать образования отходов и способствует защите окружающей среды.
Плазменно-полимеризованная нафталиновая пленка Плазменно-полимеризованная нафталиновая пленка представляет собой трехмерно полимеризованную углеродную пленку, изготовленную из газа нафталина методом плазменной полимеризации под тлеющим разрядом33. Пленка устойчива к электронной бомбардировке и химическим веществам, очень чиста, прозрачна против электронов и имеет плоскую поверхность и аморфную структуру. Таким образом, плазменно-полимеризованная нафталиновая пленка, которая коммерчески доступна, превосходна и рекомендуется в качестве опорной пленки.

Электронная микроскопия является мощным инструментом для изучения ультраструктуры клеток. Химическая фиксация с помощью обычных процедур обезвоживания была использована для наблюдения за ультраструктурой клеток и тканей. Однако этот метод не обеспечивает адекватного сохранения ультраструктуры клеток, и обычно наблюдаются артефакты и извлечение клеточного содержимого. Быстрое замораживание и замораживание-замещение клеток и тканей являются лучшими альтернативами для сохранения клеточной структуры.
Три основных метода были использованы для быстрого замораживания клеток1:1) погружение-замораживание выполняется путем погружения образцов в охлажденный криоген, такой как пропан, и использовалось с начала 1950-х годов2; 2) замораживание холодного металлического блока осуществляется путем быстрого нанесения клеток и тканей на металлический блок, охлажденный жидким азотом или жидким гелием3,4; и 3) замораживание под высоким давлением осуществляется путем замораживания клеток и тканей жидким азотом под высоким давлением5,6,7.
Сэндвич-замораживание - это тип погружения-замораживания, осуществляемого путем зажима тонких биологических материалов между двумя медными дисками и быстрого замораживания их путем погружения в жидкий пропан8,9,10. В этом методе очень тонкие образцы (толщиной в несколько микрометров) быстро охлаждаются криогеном с использованием металла, который имеет хорошую теплопроводность с обеих сторон. Таким образом, этот метод эффективно отводит тепло от образцов, что дает возможность стабильно замораживать клетки без повреждения кристаллами льда. Сэндвич-замораживание споследующим замораживанием-замещением живых дрожжей и бактериальных клеток выявляет естественную ультраструктуру клеток10,11, 12,13, 14,15,16.
Недавно было признано, что этот метод полезен для сохранения четких клеточных изображений глутаровых альдегид-фиксированных микроорганизмов17,18,19,20,21,22,23,24,культивируемых клеток25,26,27и клеток и тканей человека1,28 . Хотя эти исследования были проведены с использованием устройства для замораживания сэндвичей ручной работы29,а применение других исследований в других лабораториях было ограничено, новое устройство для замораживания сэндвичей (SFD) было изготовлено28 и в настоящее время коммерчески доступно.
В настоящей статье показано, как использовать SFD для быстрого замораживания биологических образцов, включая бактерии, дрожжи, культивируемые клетки, изолированные клетки, ткани животных и человека и вирусы. Также показана подготовка образцов к ультратонкому сечению после быстрого замораживания, а также процедуры замораживания-замещения, встраивания смолы, обрезки блоков, разрезания ультратонких срезов, восстановления срезов, окрашивания и покрытия сеток опорными пленками.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sandwich Freezing Device</td>
			<td>Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan</td>
			<td>MW-SFD-01</td>
			<td>with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL glass vials</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Scintillation counter vials for fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>3004</td>
			<td>0.1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer</td>
			<td>Sanyo Co. Ltd., Osaka</td>
			<td>MDF-C8V1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper disk</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged razor blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Feather, FAS-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-edged razor blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Feather, FA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shredded board</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Several pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers with polystyrene foam</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>One pair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>3052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propane gas</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Cryogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion sputter apparatus</td>
			<td>Hitachi high technologies, Tokyo</td>
			<td>Hitachi E102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For 1 mL, 200 &#956;L, and 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>Capsulefuge, PMC-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo et al.</td>
			<td>-</td>
			<td>SMZ 645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo et al.</td>
			<td>SM-LW 61 Ji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic container</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>50 mL and 200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Cryogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic syringes</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>340</td>
			<td>Quetol 812 set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon embedding mold</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>4217</td>
			<td>7 mm in diameter, 13 mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubater</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For 37 &#176;C and 60 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Tilting mechanism equipped, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Trimming Blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>5240</td>
			<td>EM-240, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna</td>
			<td>Ultracut S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2633, 2634</td>
			<td>300 mesh, 400 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Neoprene W solution</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect Loop</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2351</td>
			<td>Fot retrieving sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half Tube for section staining</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>463</td>
			<td>Refer to this pape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo</td>
			<td>DISMIC-03CP</td>
			<td>Cellulose acetate, 0.45 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid freezing using sandwich freezing device for good ultrastructural preservation of biological specimens in electron microscopy

Химическая фиксация была использована для наблюдения за ультраструктурой клеток и тканей. Однако этот метод не обеспечивает адекватного сохранения ультраструктуры клеток; обычно наблюдаются артефакты и извлечение содержимого клеток. Быстрое замораживание является лучшей альтернативой для сохранения клеточной структуры. Сэндвич-замораживание живых дрожжей или бактерий с последующим замораживанием-замещением было использовано для наблюдения за изысканной природной ультраструктурой клеток. В последнее время сэндвич-замораживание культивируемых клеток или тканей человека также используется для выявления ультраструктуры клеток и тканей. 
Эти исследования до сих пор проводились с помощью устройства для замораживания сэндвичей ручной работы, и применение к исследованиям в других лабораториях было ограничено. Недавно было изготовлено новое устройство для замораживания сэндвичей, которое в настоящее время коммерчески доступно. В настоящей работе показано, как использовать сэндвич-морозильное устройство для быстрого замораживания биологических образцов, включая бактерии, дрожжи, культивируемые клетки, изолированные клетки, ткани животных и человека и вирусы. Также показана подготовка образцов к ультратонкому сечению после быстрого замораживания и процедуры замораживания-замещения, встраивания смолы, обрезки блоков, разрезания ультратонких срезов, восстановления сечений, окрашивания и покрытия сеток опорными пленками.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy at JoVE.com

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Здесь мы покажем, как использовать сэндвич-морозильное устройство для быстрого замораживания биологических образцов, включая бактерии, дрожжи, культивируемые клетки, изолированные клетки, ткани животных и человека и вирусы. Мы также покажем, как подготовить образцы к ультратонкому сечению после быстрого замораживания.

Быстрое замораживание с использованием сэндвич-морозильного устройства для хорошей ультраструктурной консервации биологических образцов в электронной микроскопии

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Для того чтобы наблюдать изысканную естественную ультраструктуру клеток, необходимо зафиксировать клетки путем быстрого замораживания. Сэндвич-замораживание является одним из лучших методов замораживания клеток без образования кристаллов льда. Данный протокол демонстрирует использование сэндвич-морозильного устройства, а также описывает процедуру изготовления ультратонких срезов замороженных образцов после сэндвич-замораживания.Начните приготовление жидкого пропана, заполнив контейнер с жидким азотом сэндвич-морозильного устройства или SFD жидким азотом. Заполните контейнер с жидким пропаном жидким пропаном, введя газ пропан с помощью тонкой насадки. Ускорьте затвердевание пропана с помощью охлаждаемого металлического стержня.Чтобы подготовить медные диски плоского и корзинчатого типа, поместите их на стеклянную горку без буквы стороной вверх и обработайте тлеющим разрядом при 10 паскалях, 400 вольт, одной миллиампере в течение 30 секунд, чтобы сделать поверхность диска гидрофильной с помощью аппарата ионного споттера. Перенесите клеточную суспензию в двухмиллилитровую центрифужную трубку и центрифугу при 2 900 G в течение 10 секунд при комнатной температуре. Удалите супернатант и суспендируйте гранулу до получения густой суспензии.Поместите небольшое количество или приблизительно 0,02 микролитра клеточной суспензии на медный диск. Накройте его другим медным диском и подберите диски пинцетом. Сделайте лунку в центре из твердого пропана с тонким металлическим стержнем.Установите пинцет в SFD и быстро заморозьте их, нажав кнопку впрыска аппарата. Замочите использованный пинцет в воде комнатной температуры, чтобы согреть их, чтобы заморозить следующие образцы. Используют ткани животных и человека, закрепленные в 2,5% глутаральдегида, 0,1 молярного фосфатного буфера рН 7,4.Нарежьте их на участки толщиной от 0,1 до 0,2 миллиметра лезвием бритвы под стереомикроскопом. Поместите небольшую каплю раствора глутаральдегида на медный диск корзинчатого типа, затем с помощью пинцета поместите кусочек ткани в глутаровый альдегид на медный диск и накройте его плоским медным диском. Быстро замораживает диски с тканями в плавящемся пропане SFD, как показано ранее.Переведите диски в жидкий азот в рабочей ванне. Используя пару пинцетов, охлажденных жидким азотом, отделите диски друг от друга, чтобы обнажить образец. Поместите диски с клетками в стеклянный флакон, который заполнен одним миллилитром ацетона, содержащим 2% тетроксида осмия, который был помещен в жидкий азот и затвердел.Переложите диски в глубокую морозильную камеру и держите их при минус 80 градусах Цельсия в течение двух-четырех дней для замораживания ячеек. Постепенно доведите экземпляры до комнатной температуры, высиживая их в течение двух часов при минус 20 градусах Цельсия, двух часов при четырех градусах Цельсия и 15 минут при комнатной температуре. Переложите диски на две миллилитровые пластиковые трубки, которые заполнены одним миллилитром ацетона.Приготовьте эпоксидную смолу, смешав реагенты в одноразовом пластиковом контейнере с помощью мешалки. Замените ацетон последовательно 30% смолой в ацетоне, 60% смолой и 90% смолой при комнатной температуре в течение одного часа каждый, затем замените 90% смолу на 100% смолу при 37 градусах Цельсия в течение ночи. Наконец, вставьте образцы в 100% смолу в силиконовую форму для встраивания и полимеризуйте их при 60 градусах Цельсия в течение 24 часов.Выньте полимеризованные блоки из силиконовых форм для встраивания и напишите номер образца на блоке. Извлеките медные диски из блока лезвием бритвы и обрежьте образцы, встроенные в поверхность блока, с помощью ультразвукового лезвия для обрезки и лезвий бритвы под стереомикроскопом. Далее накладываем ленту на образец блока патрона и образец держателя микротома и разрезаем ленту на границе.Извлеките блок из ультрамикротома, установите его в стереомикроскоп и обрежьте его далее до 0,2 миллиметра на 0,3 миллиметра с помощью лезвия бритвы. Нанесите неопрен на сетки, чтобы сделать их клейкими. Установите блок обратно на ультрамикротом, выровняв заклеенные детали.Накройте ультрамикротом пластиковой крышкой и вырежьте участки толщиной от 50 до 70 нанометров. Извлеките разделы с помощью цикла. Установите их на 300 или 400 сетчатых медных сетках, обработанных неопреном, и высушите их.Установите сетки с секциями в паз полусилиновой трубки. Замочите образцы в растворе уранилацетата в течение трех минут. Соберите использованный раствор уранила и храните его в шприце.Промыть образцы в полутрубке струей воды, затем замочить образцы в цитрате свинца в течение трех минут. Для дрожжевых и грибковых образцов поместите сетки на фильтровальную бумагу, подберите их пинцетом и накройте плазменной полимеризованной нафталиновой пленкой на поверхности воды. Вставьте сетки в держатель образца электронного микроскопа, затем вставьте держатель образца в электронный микроскоп и наблюдайте при 100 киловольтах.Ультратонкие срезы как E.coli, так и S.cerevisiae при наблюдении под электронным микроскопом показали естественную морфологию и четкие изображения. Ультратонкие участки культивируемых клеток, быстро замороженных с использованием SFD, наблюдались под электронным микроскопом. Изображения ультратонких участков кожи человека были очень четкими и показывали естественную морфологию.Частицы ядра вируса гепатита В быстро замораживали с помощью SFD и наблюдали с помощью криоэлектронной микроскопии. Самое главное, что нужно помнить, это то, что вы должны наносить очень небольшое количество клеток на медные диски, чтобы предотвратить образование кристаллов льда при замерзании. Зафиксировав ткани животных глутаровым альдегидом заранее, достигается хорошая промерзание на глубине около 200 микрометров, аналогичное глубине, достигаемой замораживанием под высоким давлением.Этот метод прокладывает путь для исследователя, чтобы наблюдать изысканную естественную ультраструктуру клеток легко при низких затратах.

Research

JoVE Journal

Biology

Freezing Human ES Cells

Замораживание клеток человека ES

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Флэш Замораживание и Cryosectioning E12.5 мозга мыши

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Замораживание, размораживание, и упаковка Клетки для транспорта

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Замораживание и размораживание человеческих эмбриональных стволовых клеток

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

Быстрое однородных Обнаружение биологических экспериментов с использованием магнитных система биодатчиков модуляции

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Ткань Сортировка и морозильные моделей скелетных мышечных заболеваний

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Фундаментальный Технический Элементы замерзания перелома / Зафиксированные-травления в биологическом электронной микроскопии

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Тандем Замораживание высокого давления и резких похолоданий Замена тканей растений для просвечивающей электронной микроскопии

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Погружение Замораживание: Инструмент для ультраструктурных и иммунолокализации исследований в суспензии клеток в просвечивающей электронной микроскопии

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Характеристика кальцификации событий с использованием живого оптической и электронной микроскопии методы в морской Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...