Name: rapid freezing using sandwich freezing device for good ultrastructural preservation of biological specimens in electron microscopy
Uploaded: 2021-07-19T14:00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy at JoVE.com

NOT: Çalışmanın insan örnekleri için protokolü Chiba Üniversitesi Tıp Enstitüsü Biyomedikal Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (3085). Osmiyum tetroksit tehlikeli bir kimyasaldır; duman kaputunda eldiven giyerek ele alınmalıdır. Şekil 1 sandviç dondurma cihazını ve gerekli aletleri gösterir28. Şekil 2 sandviç dondurma deneyleri yapmak için gerekli malzemeleri göstermektedir. Cam şişeler osmiyum tetroksit içeren aseton ile doldurulur ve kullanıma kadar -80 °C'de tutulur (Şekil 2B). Bakır diskler 3 mm çapındadır, deliksizdir, bir tarafta bir harfe sahiptir ve ticari olarak mevcuttur (Şekil 2C).
1. Donma-ikame için hücre süspansiyonlarının hızlı bir şekilde dondurulması
NOT: Tüm prosedür Şekil 3'te gösterilmiştir.
<ol><li>Hücre<ol>
<li>Sandviç dondurma için bakterilerin, mayanın (Şekil 2A),kültürlü hücrelerin ve izole hücrelerin hücre süspansiyonlarını kullanın. NOT: Hem canlı hem de glutaraldehit sabit hücreler kullanılabilir28.</li>
	</ol></li>
	<li>Sıvı propan hazırlanması NOT: Sıvı nitrojeni kullanırken cryogloves ve gözlük kullanın. Propan patlayıcı olduğundan, aynı odada ateş kullanılmaması için dikkatli olunmalı ve pencereler açık tutulmalıdır.<ol>
<li>SFD'nin sıvı azot kabını sıvı azotla doldurun (Şekil 4A). İnce bir nozül kullanarak propan gazı sokarak sıvı propan kabını sıvı propan ile doldurun (Şekil 4B, C). Soğutulmuş bir metal çubuk kullanarak propanın katılaşmasını hızlandırın (Şekil 1 ve Şekil 4D,E).</li>
	</ol></li>
	<li>Bakır disklerin hazırlanması<ol>
<li>Bakır diskleri harfsiz tarafı yukarı (Şekil 2D) olan bir slayt camına yerleştirin ve disk yüzeyini bir iyon sputter aparatı kullanarak hidrofilik hale getirmek için 10 Pa,400volt, 30 s için 1 mA'da kızdırma deşarjı ile muamele edin30.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre süspansiyonunun sandviç ve dalma dondurması<ol>
<li>Hücre süspansiyonu 2 mL santrifüj tüpüne (Şekil 5A) ve oda sıcaklığında 10 s için 2.900 × g'da santrifüje aktarın (Şekil 5B,C). Üstnatant çıkarın ve kalın bir süspansiyon elde etmek için peletin askıya alın (tartışmaya bakın).</li>
		<li>Hücre süspansiyonunun (~0,02 μL) az miktarda bakır diske (Şekil 5D-F)yerleştirin, başka bir bakır diskle örtün (Şekil 5G) ve diskleri cımbızla alın (Şekil 5H). NOT: Hücre süspansiyonunun ~0,02μL'lik kısmını ölçmek için, stereomikroskop altında süspansiyonun 0,1 μL damlasını gözlemleyin ve bu hacmin 1/5'i olan damlacıklara bölün.</li>
		<li>İnce metal çubukla katı propan merkezinde bir kuyu yapın (Şekil 5I). Cımbızı bir SFD'ye ayarlayın ve cihazın enjeksiyon düğmesine basarak hızla dondurun (Şekil 5J,K). NOT: Numuneleri kurutmamaya ve iki diski tamamen birbirlerinin üzerine koymamaya özen göstermelisiniz (aksi takdirde, bir sonraki adımda onları ayırmak çok zorlaşır).</li>
	</ol></li>
	<li>Hayvan ve insan dokularının sandviç ve dalma dondurması<ol>
<li>%2,5 glutaraldehit-0,1 M fosfat tamponunda (pH 7,4) sabitlenmiş hayvan ve insan dokuları (~0,5 mm x 0,5 mm x 1,5 mm) kullanın (Şekil 6A,B). Stereomikroskop altında jiletle 0,1 ila 0,2 mm kalınlığında bölümler halinde dilimleyin(Şekil 6C,D).<ol>
<li>Bakır bir diske küçük bir damla (~0,02 μL) glutaraldehit çözeltisiyerleştirin (Şekil 6E, F). Daha sonra, bakır diskteki glutaraldehite bir doku parçası yerleştirmek için cımbız kullanın (Şekil 6G, H) ve başka bir bakır diskle örtün ( Şekil6I-K).</li>
			<li>Bölüm 1.4'te açıklandığı gibi, SFD'nin eriyen propanındaki dokularla diskleri hızla dondurun (Şekil 5J,K). NOT: Glutaraldehit tehlikeli bir kimyasal olduğundan, duman kaputunda eldiven giyerek ele alınmalıdır. Dokular bakır diske yerleştirildiğinde tamponlarla yıkanmamalı, ancak glutaraldehit çözeltisine batırılmalıdır çünkü glutaraldehit donma önleyici etkiye sahiptir1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Osmiyum aseton ile dondur-ikame<ol>
<li>Diskleri çalışan bir banyoda sıvı nitrojene aktarın (Şekil 7A,B). Sıvı nitrojenle soğutulan bir çift cımbız kullanarak, numuneyi ortaya çıkarmak için diskleri birbirinden ayırın (Şekil 7C-E).</li>
		<li>Hücrelerin bulunduğu diskleri, sıvı nitrojene yerleştirilmiş ve katılaşmış % 2 osmiyum tetroksit içeren 1 mL asetonla doldurulmuş bir cam şişeye (Şekil7F) yerleştirin ( Şekil4H).</li>
		<li>Diskleri derin dondurucuya aktarın ve hücrelerin dondurulması için 2-4 gün boyunca -80 °C'de tutun (Şekil 3). Kullanılan cımbızları, aşağıdaki örneklerin donması için ısıtmak için oda sıcaklığında suya batırın (Şekil 7G). NOT: Numuneyi işlemek için cımbız sıcak olmalıdır (oda sıcaklığında) çünkü soğuk cımbız numuneyi hızlı donmadan önce dondurarak buz kristallerinin oluşumuna yol açabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Örnek ısıtma ve gömme<ol>
<li>Numuneleri yavaş yavaş oda sıcaklığına getirin (-20°C'de 2 saat, 4°C'de 2 saat ve oda sıcaklığında 15 dk, Şekil 3 ve Şekil 8A)ve diskleri 1 mL asetonla doldurulmuş 2 mL plastik tüplere aktarın(Şekil 3 ve Şekil 8B,C).</li>
		<li>Reaktifleri bir karıştırıcı kullanarak tek kullanımlık plastik bir kapta karıştırarak epoksi reçinesi hazırlayın (Şekil 8D-F).</li>
		<li>Adım 1.7.1'deki asetonları art arda %30 reçine (aseton), %60 reçine ve oda sıcaklığında %90 reçine ile her biri 1 saat değiştirin. Ardından, %90 reçineyi bir gecede 37°C'de %100 reçine ile değiştirin. Son olarak, numuneleri silikon gömme kalıbına% 100 reçineye (Şekil 8G-J) gömün ve 24 saat boyunca 60 ° C'de polimerize edin (Şekil 3). NOT: Numuneler tüm prosedür boyunca bakır disklere bağlı kalmalıdır (kesiti kolaylaştırmak için). Gömme işlemi sırasında dönen veya çalkalama aparatı kullanılması önerilmez, çünkü reçinenin hücreye nüfuz etmesine çok az katkıda bulunurlar. Ayrıca, aparattan gelen titreşim bazen numunelerin bakır disklerden kopmasını neden olur. Bir gecede 37°C'de inkübasyon, termal enerji nedeniyle reçinenin hücreye nüfuz etmesini hızlandırır (reçine herhangi bir hızlandırıcı içermediği için polimerize olmaz).</li>
	</ol></li>
	<li>Numune bloklarının kırpılması<ol>
<li>Polimerize blokları silikon gömme kalıplarından çıkar(Şekil 9A). Numune numarasını bloğa yazın (Şekil 9B).</li>
		<li>Bakır diskleri bir jiletle bloktan çıkarın (Şekil 9C, D) ve stereomikroskop 31 altında ultrasonik kırpma bıçağı ( Şekil9E) ve jilet ( Şekil 9F-H) kullanarak blok yüzeyine gömülü örnekleri0,7mm x0,7mm'ye kesin.</li>
		<li>Bloğu bir ultramikrotom numune tutucusuna ayarlayın (Şekil 9I) ve bloğun yüzünü elmas kesme bıçağıyla sorunsuz bir şekilde kesin (Şekil 9J, K).</li>
	</ol></li>
	<li>Ultra ince bölümleri kesme<ol>
<li>Bloğu ultramikrotomdan çıkarın (Şekil 10A)31, stereomikroskopta ayarlayın ve jiletle 0,2 mm x 0,3 mm'ye kadar kırpın (Şekil 10B,C).</li>
		<li>Yapışkan hale getirmek için ızgaralara neopren uygulayın (Şekil 10D). Bloğu ultramikrotom üzerine geri ayarlayın, ultramicrotome'u plastik bir kapakla örtün (Şekil 10E)31ve 50-70-nm kalınlığında kesitler kesin (Şekil 10F-H).</li>
		<li>Bölümleri bir döngü kullanarak alın (Şekil 10I), neopren ile muamele edilmiş 300 veya 400 örgü bakır ızgaraya monte edin ve kurutun (Şekil 10J).</li>
	</ol></li>
	<li>Bölümlerin boyanma ve elektron mikroskobu altında gözlem<ol>
<li>Izgaraları yarım silikon tüpün oluğunda bölümlerle ayarlayın (Şekil 11A)31, ve boyama için her biri 3 dakika boyunca uranil asetat çözeltisi ve kurşun sitrat içine batırın (Şekil 11B-E)32.</li>
		<li>Maya ve mantar örnekleri için ızgaraları bir filtre kağıdına (4 mm x 4 mm) yerleştirin, cımbızla alın ve su yüzeyinde plazma polimerize naftalin filmi33 ile örtün(Şekil 11F,G). Izgaraları bir elektron mikroskobuna yerleştirin ve 100 kV'da gözlemleyin(Şekil 11H,I).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Virüslerin ve makromoleküllerin hızlı donması
<ol><li>Sıvı etan hazırlanması NOT: Sıvı nitrojeni kullanırken cryogloves ve gözlük kullanın. Etan patlayıcı olduğundan, aynı odada ateş kullanılmaması için dikkatli olunmalı ve pencereler açık tutulmalıdır. Etan, elektron mikroskopunda buharlaştığı için kullanılır, propan ise kullanılmaz.<ol>
<li>SFD'nin sıvı azot kabını sıvı nitrojenle doldurun. Etan gazını ince bir nozülden geçirerek sıvı etan kabını sıvı etan ile doldurun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikro şebekelerin ve numunelerin hazırlanması ve hızlı donması<ol>
<li>Bir iyon sputter aparatı kullanarak ışıma deşarjı (10 Pa, 400 V, 1 mA) ile tedavi ederek mikro şebekelerin her iki yüzünü de hidrofilik hale getirin30.</li>
		<li>Mikro şebekeyi SFD'ye ayarlayın ve mikro şebekelere 2 μL virüs veya makromoleküler süspansiyon (1 mg protein/mL) uygulayın. Filtre kağıdı kullanarak fazla sıvıyı çıkarın ve cihazın enjeksiyon düğmesine basarak mikro şebekeyi hızla dondurun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Donmuş mikro şebekenin kriyo transfer tutucusunda ayarlanması ve elektron mikroskobu altında gözlemlenmesi<ol>
<li>Donmuş mikro şebekeleri sıvı nitrojene aktarın, önceden sıvı azot sıcaklığında soğutulan bir kriyo transfer tutucusuna ayarlayın ve düşük sıcaklıkta bir elektron mikroskobu altında gözlemleyin34.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun.

Aşağıdaki tartışma, 1.000'den fazla örnek üzerinde 120'den fazla sandviç dondurma-dondurma ikame deneyine ve 36 yıl boyunca 75'ten fazla örnek üzerinde 70'ten fazla dalma dondurma-kriyo-elektron mikroskopi deneyine dayanmaktadır.
Sandviç dondurma ile iyi dondurma için başarı oranı İyi donma elde etmedeki başarı oranı örneklere bağlıdır. YPD ortamında kültürlenmiş Sakkaromyces cerevisiae (maya) hücreleri (%1 maya özü, %2 pepton, %2 dekstroz) buz kristali oluşumu olmadan iyi donma için yaklaşık%100başarı sağladı 10,11,15,35,36. Shizosaccharomyces37 , 38,39,Cryptococcus14, 40,41,42,43 , 44,45, Exophiala13,41,46,47,48, dahil olmak üzere diğer maya türleri 49, Fusarium50,51,52, Aureobasidium53, Candida54,55, Fellomyces56, Aspergillus57ve Trichosporon da iyi donma gösterdi. Mycobacterium58,59 ve E. coli16dahil olmak üzere bakteriler de iyi donma gösterdi. Kültürlü hücreler ve izole hayvan hücreleri hem canlı hem de glutaraldehit sabit hücreler için iyi donma gösterdi1,25,26,27,60. Glutaraldehit-sabit hayvan ve insan dokuları 0.1 ila 0.2 mm kalınlık dilimlenmiş de çoğu zaman iyi donma gösterdi1,28.
İyi dondurma koşulları Sadece uygun büyüme aşamasında ve durumda hücreler kullanın. Kültürdeki hücreler üstel fazda olmalıdır. Bakır diske konsantre numunelerin çok az miktarda hücre süspansiyonunu uygulayın (S. cerevisiaeiçin , ~0.02 μL 3-5 ×10 9 hücre/mL). Glutaraldehit sabitlenmiş hayvan veya insan doku dilimleri de çok küçük olmalıdır (tercihen 0,3 mm x 0,3 mm x 0,1 mm). 0,1 mm kalınlığında doku dilimlerini kesmek zor olduğundan, birçok dokuyu dilimleyin ve ince ve yarı saydam dilimler seçin. Hızlı ama dikkatli çalışın ve numunelerin kurumasına izin vermeyin. Yığılmış bakır diskleri cımbızla toplarken, hücrelerin ve dokuların ezilmemesi için disklere çok fazla basmayın. Numune yükleme başarılı donma için en önemli adımdır ve gerekli koşullar yüksek basınçlı dondurma için iyi donma koşullarıyla aynıdır. Okuyucular McDonald61tarafından mükemmel incelemeye başvurmalıdır.
Diğer uygulamalar Bu makalede bir bakterinin elektron mikrografileri, maya, kültürlü hücreler, izole hayvan hücreleri, insan dokuları ve virüs parçacıkları sunulmaktadır. Glutaraldehit sabit deniz alglerinin iyi donmasını gözlemledik. Bununla birlikte, canlı tatlı su yeşili alglerin hücre yapıları buz kristali oluşumu ile tahrip edilmiştir. Hücrelerin %20 sığır serumu albümin (BSA) ile karıştırılması, ultrayapının buz kristali hasarı olmadan iyi korunmasını sağladı. % 20 BSA kullanımı, bir mantarın sap hücrelerinin ultrayapısını korumak için de faydalıydı. %20 BSA uygulanarak bitki hücrelerinin ve dokularının dondurulması üzerine yapılan deneyler devam etmektedir. Sandviç dondurma-donma yerine geçen numunelerin elektron mikroskopisinin taranması denenmemiş olsa da, iyi korunmuş hücre yapılarının gözlemlenmesi daha öncebildirilmiştir 9.
Sandviç dondurma yöntemi hakkında notlar Hücrelerin yerliye yakın ultrayapısı en iyi canlı hücrelerin hızlı donması ve donması ile gözlenir. Hücrelerin kalınlığı 30μm 1≤ sınırlandırılarak SFD ile buz kristali oluşumu önlenebilir. Dokuların glutaraldehit ile sabitlenmesi genellikle süspansiyon kültürlü hücreleri gözlemlemek için hücre yapısının daha iyi korunmasını sağlar, çünkü glutaraldehit fiksasyonu hücre yapısını daha sert hale getirir ve canlı hücrelerin toplanması ve santrifüjlenmesi sırasında olası ultrayapısal değişiklikleri önler1. Glutaraldehit fiksasyonu ayrıca donma derinliğinin 0,2 mm1'e kadar uzatılmasına izin verir Yüksek basınçlı dondurma (HPF) yöntemiyle elde edilene benzer. Bu nedenle, HPF makinesi hayvan ve insan dokularının derin donması için SFD ile değiştirilebilir.
Glutaraldehit-sabit dokular 2 yıldan fazla saklanabildiğinden28, sandviç dondurma kullanıcının rahatlığına göre yapılabilir. Dokuların glutaraldehit ile sabitlenmesi doku kesitini de kolaylaştırır, çünkü dokular fiksasyon ile daha sert hale gelir. HPF makinesinin aksine, SFD kriyo-elektron mikroskopisi için virüslerin hızlı donması ve bakteriler ve ökaryotik hücreler için kullanılabilir. Ayrıca, HPF makinesine kıyasla, SFD küçük, taşınabilir, daha ucuzdur ve daha fazla laboratuvar tarafından edinilebilir. SFD'nin bu özelliklerinin daha fazla laboratuvarın araştırma hedeflerine ulaşmasına yardımcı olmasını umuyoruz28.
Hücrelerin doğal morfolojisinin özellikleri Hücre yapıları aşağıdaki görünümü gösterirse doğal hallerindedir: Dış zarın membran yapıları (Şekil 12A, B), plazma membran ( Şekil12B,C; Şekil 13A-D; ve Şekil 14E), nükleer zarf (Şekil 12C, Şekil 13B-Dve Şekil 14D-E), mitokondri ( Şekil12C, Şekil 13Cve Şekil 14D) ve vakuoller ( Şekil12C) pürüzsüz konturlar gösterir. Çekirdek ve vakuoller neredeyse daireseldir (Şekil 12C). Ribozomlar ~ 20 nm çapında net bir elektron yoğun görünüm gösterir(Şekil 12B,C; Şekil 13C; ve Şekil 14D). Sitoplazm elektron-lucent(Şekil 12B,C; Şekil 13C; ve Şekil 14D).
Glutaraldehit fiksasyonunun hücre morfolojisi üzerindeki etkisi Glutaraldehit fiksasyonu, buz kristalsiz ultrayapı elde etmek için sandviç dondurmadan önce hayvan veya insan dokuları için yapıldı. Bu yöntemle elde edilen mikrografiler, canlı dokuların hızlı donmasıyla elde edilenlere benzer enfes net görüntüler göstermektedir (Şekil 14)1. Maya hücreleri, derin deniz mikroorganizmaları ve kültürlü hücreler üzerinde yapılan çalışmalar, ultrayapı deformasyonunun esas olarak oda sıcaklığında osmiyum tetroksit fiksasyonu ve etanol tarafından dehidratasyondan kaynaklandığını göstermektedir1,17,18,28. Small ayrıca glutaraldehit fiksasyonunun kültürlü fibroblastlarda aktisin organizasyonunu yok etmese de, osmiyum tetroksit fiksasyonu ve oda sıcaklığında aseton veya etanol tarafından dehidratasyon actin organizasyonunu yok ettiğini bildirdi62.
Bu nedenle glutaraldehit fiksasyonunun hücre morfolojisi üzerindeki etkileri üzerine detaylı bir çalışma yapılmalıdır. Ohno, canlı dokuların kan akışını durdurmadan hızla dondurulduğu bir in vivo kriyofixation yöntemi geliştirdi63. Dokular dondurularak epoksi reçinesine gömüldü ve ultra ince kesitler gözlendi. Elektron mikroskobik görüntüleri, kimyasal fiksasyon-konvansiyonel dehidrasyon ve taze düzeltilmemiş dokuların hızlı donması ile elde edilenlere kıyasla canlı dokuların en yakın doğal ultrayapısını gösterdi. Bu nedenle, glutaraldehit fiksasyonunun etkilerini incelemek için glutaraldehit fiksasyon-dondurarak ikame (mevcut yöntem) ve in vivo kriyofixasyon-donma ikaması ile elde edilen ultrayapıyı karşılaştırmak ilginç olabilir.
Çevre için dikkate alınması ve deneysel verimliliğin artırılması Reçinenin ikamesi için 2 mL plastik tüpler kullanıyoruz. Her değiştirme adımı için bir mL seyreltilmiş reçine yeterlidir. Kullanılan plastik tüpler her deneyden sonra atılabilir. Bu, reçine ikame için kullanıldığında cam şişeleri yıkamak için zaman ve çabadan tasarruf sağlayabilir. Ek olarak, uranil asetat çözeltisi bölüm boyama için tekrar tekrar kullanılabilir32. Bölümleri lekeledikten sonra uranil asetat çözeltisi kaydedilebilir ve yeniden kullanılabilir. Uranil asetat radyoaktif bir madde olduğundan, yeniden kullanımı atıkların üretilmesini önlemeye yardımcı olur ve çevrenin korunmasına katkıda bulunur.
Plazma polimerize naftalin filmi Plazma polimerize naftalin filmi, ışıma deşarjı altında plazma polimerizasyonu ile naftalin gazından yapılan üç boyutlu polimerize karbon filmidir33. Film elektron bombardımanına ve kimyasallara karşı dayanıklıdır, çok temizdir, elektronlara karşı şeffaftır ve düz bir yüzeye ve amorf bir yapıya sahiptir. Bu nedenle, ticari olarak mevcut olan plazma polimerize naftalin filmi mükemmeldir ve destek filmi olarak önerilir.

Elektron mikroskopisi hücre ultrayapısını incelemek için güçlü bir araçtır. Hücre ve dokuların ultrayapısını gözlemlemek için geleneksel dehidrasyon prosedürleri ile kimyasal fiksasyon kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntem hücrelerin ultrayapısını yeterince korumaz ve eserler ve hücre içeriğinin çıkarılması genellikle gözlenir. Hücre ve dokuların hızlı donması ve dondurulması hücre yapısının korunması için daha iyi alternatiflerdir.
Hücrelerin hızla dondurulması için üç ana yöntem kullanılmıştır1: 1) dalma dondurma, örneklerin propan gibi soğutulmuş bir kriyojene daldırmasıyla gerçekleştirilir ve 1950'lerin başından beri kullanılır2; 2) soğuk metal blok dondurma, hücrelerin ve dokuların sıvı azot veya sıvı helyum ile soğutulan bir metal bloğa hızla çarparakgerçekleştirilir 3,4; ve 3) yüksek basınç dondurma, hücrelerin ve dokuların yüksek basınç altında sıvı azot ile dondurulması ile yapılır5,6,7.
Sandviç dondurma, ince biyolojik malzemelerin iki bakır disk arasına sandviç yapılması ve sıvı propan8, 9,10'adalarak hızla dondurulmasıylagerçekleştirilenbir dalma dondurma türüdür. Bu yöntemde, çok ince numuneler (birkaç mikrometre kalınlığında) her iki taraftan da iyi termal iletkenliğe sahip bir metal kullanılarak kriyojen ile hızla soğutulur. Böylece, bu yöntem numunelerdeki ısıyı etkili bir şekilde temizler ve hücrelerin buz kristali hasarı olmadan dikkatlice dondurulmasını mümkün hale getirir. Sandviç dondurma, ardından canlı maya ve bakteri hücrelerinin dondurarak değiştirilmesi,10 , 11 , 12,13,14 ,15,16hücrelerinin doğal ultrayapısını ortaya çıkarır.
Son zamanlarda, bu yöntemin glutaraldehit sabit mikroorganizmaların 17 , 18 ,19,20 ,21,22,23,24, kültürlühücrelerin 25,26,27ve insan hücreleri ve dokularının1,28 ' in net hücre görüntülerini korumak için yararlı olduğubulunmuştur. . Bu çalışmalar el yapımı sandviç dondurma cihazı29kullanılarak gerçekleştirilmiş olmasına ve diğer laboratuvarlardaki diğer çalışmalara başvurular sınırlı olmasına rağmen, yeni bir sandviç dondurma cihazı (SFD)28 üretilmiştir ve artık ticari olarak mevcuttur.
Bu makale, bakteri, maya, kültürlü hücreler, izole hücreler, hayvan ve insan dokuları ve virüsler de dahil olmak üzere biyolojik örneklerin hızlı donması için SFD'nin nasıl kullanılacağını göstermektedir. Ayrıca, hızlı donma sonrası ultra ince kesitleme için numunelerin hazırlanmasının yanı sıra donma-ikame, reçine gömme, blokların kesilmesi, ultra ince bölümlerin kesilmesi, bölümlerin kurtarılması, boyama ve ızgaraların destek filmleriyle kaplanması prosedürleri de gösterilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sandwich Freezing Device</td>
			<td>Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan</td>
			<td>MW-SFD-01</td>
			<td>with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL glass vials</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Scintillation counter vials for fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>3004</td>
			<td>0.1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer</td>
			<td>Sanyo Co. Ltd., Osaka</td>
			<td>MDF-C8V1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper disk</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged razor blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Feather, FAS-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-edged razor blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Feather, FA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shredded board</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Several pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers with polystyrene foam</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>One pair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>3052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propane gas</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Cryogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion sputter apparatus</td>
			<td>Hitachi high technologies, Tokyo</td>
			<td>Hitachi E102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For 1 mL, 200 &#956;L, and 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>Capsulefuge, PMC-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo et al.</td>
			<td>-</td>
			<td>SMZ 645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo et al.</td>
			<td>SM-LW 61 Ji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic container</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>50 mL and 200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Cryogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic syringes</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>340</td>
			<td>Quetol 812 set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon embedding mold</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>4217</td>
			<td>7 mm in diameter, 13 mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubater</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>For 37 &#176;C and 60 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Tilting mechanism equipped, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Trimming Blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>5240</td>
			<td>EM-240, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna</td>
			<td>Ultracut S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2633, 2634</td>
			<td>300 mesh, 400 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Neoprene W solution</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect Loop</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2351</td>
			<td>Fot retrieving sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half Tube for section staining</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>463</td>
			<td>Refer to this pape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo</td>
			<td>DISMIC-03CP</td>
			<td>Cellulose acetate, 0.45 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>JEM-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid freezing using sandwich freezing device for good ultrastructural preservation of biological specimens in electron microscopy

Hücrelerin ve dokuların ultrayapısını gözlemlemek için kimyasal fiksasyon kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntem hücrelerin ultrayapısını yeterince korumaz; eserler ve hücre içeriğinin çıkarılması genellikle gözlenir. Hızlı donma, hücre yapısının korunması için daha iyi bir alternatiftir. Canlı maya veya bakterilerin sandviç dondurulması ve ardından donma-ikame, hücrelerin enfes doğal ultrayapısını gözlemlemek için kullanılmıştır. Son zamanlarda, glutaraldehit sabit kültürlü hücrelerin veya insan dokularının sandviç dondurulması da hücrelerin ve dokuların ultrayapısını ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. 
Bu çalışmalar şimdiye kadar el yapımı sandviç dondurma cihazı ile gerçekleştirilmiş ve diğer laboratuvarlardaki çalışmalara başvurular sınırlandırmıştır. Yeni bir sandviç dondurma cihazı yakın zamanda imal edildi ve şimdi ticari olarak mevcut. Bu makale, bakteri, maya, kültürlü hücreler, izole hücreler, hayvan ve insan dokuları ve virüsler de dahil olmak üzere biyolojik örneklerin hızlı donması için sandviç dondurma cihazının nasıl kullanılacağını göstermektedir. Ayrıca, hızlı donma ve donma-ikame işlemleri, reçine gömme, blokların kesilmesi, ultra ince bölümlerin kesilmesi, bölümlerin geri kazanılması, boyama ve ızgaraların destek filmleriyle kaplanması için prosedürlerden sonra ultra ince kesit için numunelerin hazırlanması da gösterilmiştir.

Süspansiyondaki mikroorganizmaların canlı hücreleri santrifüjleme ile toplanmış, iki bakır disk arasına sıkışmış, SFD ile hızla dondurulmuş, dondurulmuş, epoksi reçinesine gömülü, ultra ince kesitli, lekeli ve yukarıda açıklanan prosedürler takip ederek elektron mikroskobu altında gözlemlenmiştir. Şekil 12, Escherichia coli (bakteri, Şekil 12A, B)16 ve Saccharomyces cerevisiae (maya, Şekil 12C)15'inultra ince bölümlerini göstermektedir. Görüntülerin çok net olduğunu ve doğal morfoloji gösterdiğini unutmayın.
Kültürlü hücrelerin ve izole hayvan hücrelerinin glutaraldehit-sabit hücre süspansiyonları toplanmış ve SFD ile hızla dondurulmuş, dondurularak ikame edilmiş ve yukarıda açıklanan prosedürler takip ederek elektron mikroskobu altında gözlemlenmiştir. Şekil 13, kültürlü hücrelerin ultra ince bölümlerini göstermektedir (Şekil 13A-C)1,28 ve fare karın boşluğundan izole edilmiş hücreler ( Şekil13D)28. Şekil 14 insan derisinin ultra ince bölümlerini göstermektedir (Şekil 14A-D) ve buffy coat ( Şekil14E)1. Görüntülerin de çok net olduğunu ve doğal morfoloji gösterdiğini unutmayın. Şekil 15 hepatit B virüs çekirdek parçacıklarının SFD ile hızla dondurulduğunu ve kriyo-elektron mikroskopisi ile gözlemlendiğini göstermektedir34. Diğer hücrelerde olduğu gibi, görüntüler çok nettir ve doğal morfoloji gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig01.jpg"> Şekil 1: Sandviç dondurma cihazı28 ve gerekli araçlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig02.jpg"> Şekil 2: Sandviç dondurma deneyleri yapmak için gerekli malzemeler. (A) Örnek: Saccharomyces cerevisiae'nin (maya) ışık mikrografisi. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) %2 osmiyum tetroksit ile 1 mL aseton içeren cam şişeler (10 mL). (C) Harfsiz bir yüzeyi gösteren bakır diskler (solda) ve harfli bir yüzey (sağda). Ölçek çubuğu = 3 mm. Elektron mikroskopisi taranıyor. (D) Harfsiz kenarlı bakır diskler, çift taraflı yapışkan bantlı (*) cam bir kaydırağın üzerine yerleştirildi. Ölçek çubuğu = 3 mm. (E) Hayvan ve insan dokularını dilimlemek için çift kenarlı bir jilet ve kırık bir çift kenarlı jilet, blokları kırpmak için tek kenarlı bir jilet ve hayvan ve insan dokularını dilimlemek için parçalanmış bir tahta. (F) Parmakları soğuktan korumak için ekstrüde polistiren köpüklü cımbız. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig03.jpg"> Şekil 3: Sandviç dondurma yöntemi kullanılarak hücre süspansiyonlarının numune hazırlanması. Kısaltmalar: r.t. = oda sıcaklığı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig04.jpg"> Şekil 4: Sıvı propan, bakır diskler ve fiksatif hazırlanması. (A) Sandviç dondurma cihazının sıvı azot kabına sıvı azot (ok) döküldü. (B) Propan gazı ince bir nozülden sıvı propan kabına sokuldu. (C) Sıvı propan (ok). (D) Sıvı propanının katılaşmasını hızlandırmak için sıvı propanını soğutmak için metal bir çubuk (ok) kullanılmıştır. (E) Katılaştırılmış propan (ok). (F) Iyon sputter aparatı (ok), bakır diskleri kızdırma deşarjlı hidrofilik yapmak için. (G) Işıltı deşarjı. (H) Çalışan bir banyoda sıvı nitrojene yerleştirilen cam şişeler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig05.jpg"> Şekil 5: Sandviç dondurma cihazı kullanılarak hücre süspansiyonunun (maya) hızlı dondurulması. (A) Maya kültürünün santrifüj tüpüne aktarılması. (B) Mikrosantrifüj. (C) Santrifüj tüpünde (ok) Saccharomyces cerevisiae peleti. (D) Numunenin santrifüj tüpünden bir mikropipette ile aktarılması. (E) Numuneyi bakır diske yerleştirmek. (F) Bakır diskteki bir numunenin küçük bir damlası (ok). (G) Numunenin başka bir bakır diskle kaplanmesi. (H) İki diski cımbızla toplamak. (I) İnce metal çubuğu kullanarak katı propan içinde bir kuyu yapmak. (J) Enjeksiyon düğmesine basarak numunenin dalma dondurması. (K) Donma tamamlandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig06.jpg"> Şekil 6: İnsan dokularının (cildin) bir örneğinin hazırlanması. (A, B) Petri kabında glutaraldehite sabitlenmiş insan derisi dokusu. Ölçek çubuğu = 5 mm. (C, D) Dokular (ok) parçalanmış bir tahta üzerinde iki çift kenarlı jilet kullanılarak dilimlenmiştir. (E, F) Bakır bir diske küçük bir damla glutaraldehit çözeltisi (ok) yerleştirildi. (G, H) Bakır diske cımbız kullanılarak bir parça deri dokusu yerleştirildi. (I) Bakır diski cilt dokusu ile örtmek için başka bir disk kullanıldı. Sandviçdiskler cımbızla alındı. (K) Sandviç diskler cımbızla hafifçe tutuldu. Dokuların ezilmemesi için tutulan cımbız uçları (ok) arasındaki boşluğa dikkat edin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig07.jpg"> Şekil 7: Numunenin sıvı nitrojene aktarılması ve disklerin çıkarılması. (A) Disklerin (ok) çalışan bir banyoda sıvı nitrojene aktarılması. (B) Sıvı nitrojen (ok) diskler. (C) Cımbız, çalışma banyosunda soğutulmak üzere sıvı nitrojene yerleştirildi. (D, E) Bakır diskleri (okları) cımbız kullanarak ayırma. (F) Diskin (ok) cımbızla cam şişeye aktarılması. (G) Bir sonraki numuneyi dondurmak için cımbızın suda ısıtıcı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig08.jpg"> Şekil 8: Numune ısıtma ve gömme. (A) Numuneler oda sıcaklığında cam şişelerde. (B) Disklerin (ok) cımbızlı 2 mL plastik bir tüpe aktarılması. (C) Plastik bir tüpte aseton içinde bakır diskler (ok). (D) Reçinelerin enjeksiyon tüpü (ok) ile ölçülmesi. (E) Reçinenin tek kullanımlık bir kaba (ok) aktarılması. (F) Reçineyi karıştırıcı kullanarak karıştırmak. (G) Silikon gömme kalıbının deliklerine az miktarda reçine yerleştirildi. (H) Izgaralardaki fazla reçine filtre kağıdı ile çıkarıldı. (I, J) Numuneli bakır diskler, gömme kalıbının deliklerinin dibine numune tarafı yukarı olacak şekilde yerleştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig09.jpg"> Şekil 9: Numune bloğunun kırpılması. (A) Gömme kalıplarından polimerize blokların dışarı alınması. (B) Blok üzerinde numune numarası yazılmıştır. (C, D) Bakır disk jiletle bloktan çıkarıldı. (D) = 1 mm için ölçek çubuğu(E-G) Numune ultrasonik kesme bıçağı ve jilet ile kesilmiştir. Ölçek çubuğu (G) = 1 mm. (Y) Yüksek büyütme (G). Bireysel parlak nokta bir hücredir. Hücreler tek bir katmana gömüldü10. Ölçek çubuğu = 10 μm. (I-K) Bloğun yüzeyi elmas kırpma bıçağı ile düzgün kesilmiştir. Ölçek çubuğu (K) = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig09large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig10.jpg"> Şekil 10: Ultra ince kesitlerin kesilmesi. (A) Numune bloğu mikrotomdan çıkarıldı31. (B, C) Örnek daha da jiletle kesilmiş. (C) = 0,5 mm için ölçek çubuğu. (D) Neoprene, yapışmalarını sağlamak için ızgaralara uygulandı. (E) Ultra ince kesitleme sırasında hava akışını önlemek için ultramicrotome plastikle kaplandı. (F) Elmas bıçaklı tekne su ile doluydu. (G, H) Ultra ince kesitler 70 nm kalınlıklarda kesildi. Ölçek çubuğu (H) = 1 mm. (I, J) Bölümler bir döngü kullanılarak alındı ve sonra kurutuldu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig10large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig11.jpg"> Şekil 11: Boyama bölümleri. (A) Izgaralar yarım silikon tüpün oluğuna yerleştirilmiştir. (B) Lekeleme için uranil asetat içine batırılmışlardır. (C) Kullanılan uranil asetat kendiliğinden sızdırmazlık balmumu film üzerinde toplanmıştır. (D) Şebekeler bir su jeti ile yıkandı ve (E) daha sonra kurşun sitrat içine batırıldı. (F) Plazma polimerize naftalin filmi su üzerinde yüzdürüldü ve (G) 4 mm x 4 mm filtre kağıdına yerleştirilen bir ızgarayı örtmek için kullanıldı. (H) Izgara bir numune tutucusuna yerleştirildi ve (I) bir elektron mikroskobunda gözlendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig11large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig12.jpg"> Şekil 12: Escherichia coli (bakteri, A, B) ve Saccharomyces cerevisiae'nin (maya, C) ultra ince bölümleri. (A) Numunelerin yoğun ve homojen bir şekilde gömildiğini ve deformasyon göstermediğini unutmayın. (B, C) Membran yapıları açık ve pürüzsüz morfoloji gösterir ve ribozomlar her parçacığın numaralandırılabileceği kadar açıktır16. (C) Maya çekirdeği ve vakuoller, doğal morfolojileri olabilecek gerçek bir daire şekli gösterir. Mitokondri matrisi, hızlı donma ile sabitlenen canlı hücrelerin bir özelliği olabilecek elektron yoğun bir görünüm gösterir. Ölçek çubukları = 1 μm. Kısaltmalar: CW = hücre duvarı; ER = endoplazmik retikülyum; NM = nükleer membran; NP = nükleer gözenekler; OM = dış zar; PM = plazma membranları; R = ribozomlar; N = çekirdek; M = mitokondri. (B) yamada ve ark.16'dan izin alınarak çoğaltılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig12large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig13.jpg"> Şekil 13: Ultra ince kesitler. (A-C) K562 kültürlü hücreler. (D) Fareden yalıtılmış bir mast hücresi. (A) Numunelerin yoğun ve homojen bir şekilde gömildiğini ve deformasyon göstermediğini unutmayın. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B-D) Yüksek büyütmede, çekirdek, nükleolus, nükleer membran, nükleer gözenekler, endoplazmik reticulum, mitokondri, ribozomlar ve granüller açıkça gözlenir. Ölçek çubukları = 2 μm (B), 500 nm (C), 2 μm (D). Kısaltmalar: N = çekirdek; Nu = nükleolus; NM = nükleer membran, NP = nükleer gözenekler; ER = endoplazmik retikülyum; M = mitokondri; R = ribozomlar; G = granüller; D = hücreleri bölme. (A) Yamaguchi ve ark.1'den izin alınarak çoğaltılmıştır. (B-D) Yamaguchi ve ark.28'den izin alınarak çoğaltılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig13large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig14.jpg"> Şekil 14: Ultra ince kesitler. (A-D) insan derisi ve (E) buffy ceket. (A-E) Doku ve hücre görüntülerinin net ve doğal olduğunu ve bölümlerin çok ince olmasına rağmen iyi kontrast gösterdiğini unutmayın (50 nm). Mitokondri matrisi, hızla donmuş canlı hücrelerin(D)yoğun mitokondriyal matrislerine benzer yoğun bir görünüm gösterir. Ölçek çubukları = 10 μm (A, E), 200 nm (B-D). Kısaltmalar: D = desmosomes; ER = endoplazmik retikülyum; K = keratinosit; KF = keratin lifleri; M = mitokondri; N = çekirdek; NM = nükleer membran; P = trombosit; R = ribozomlar; W = beyaz kan hücreleri. Yamaguchi ve ark.28'den izin alınarak çoğaltıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig14large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62431/62431fig15.jpg"> Şekil 15: Hepatit B virüsü (HBV) çekirdek parçacıkları sandviç dondurma cihazı kullanılarak sıvı etan ile hızla dondurulur ve kriyo-elektron mikroskopisi ile gözlemlenir. Küresel içi boş parçacıklar HBV çekirdek parçacıklarıdır. Ölçek çubuğu = 100 nm. Kısaltmalar: HBV = hepatit B virüsü; Ben = buz. Yamaguchi ve ark.28'den izin alınarak çoğaltıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62431/62431fig15large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy at JoVE.com

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Burada bakteri, maya, kültürlü hücreler, izole hücreler, hayvan ve insan dokuları ve virüsler de dahil olmak üzere biyolojik örneklerin hızlı donması için sandviç dondurma cihazının nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca, hızlı donma işleminden sonra ultra ince kesitler için numunelerin nasıl hazırlanacağını da gösteriyoruz.

Elektron Mikroskopisinde Biyolojik Örneklerin İyi Ultrayapısal Korunması için Sandviç Dondurma Cihazı Kullanılarak Hızlı Dondurma

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Hücrelerin enfes doğal ultra yapısını gözlemlemek için, hücreleri hızlı dondurarak sabitlemek gerekir. Sandviç dondurma, buz kristalleri oluşturmadan hücreleri dondurmak için en iyi yöntemlerden biridir. Bu protokol sandviç dondurma cihazının kullanımını gösterir ve ayrıca sandviç dondurma işleminden sonra dondurarak ikame edilen numunelerin ultra ince bölümlerinin yapılması prosedürünü açıklar.Sandviç dondurma cihazının veya SFD'nin sıvı azot kabını sıvı nitrojenle doldurarak sıvı propan hazırlamaya başlayın. İnce bir nozül kullanarak propan gazı sokarak sıvı propan kabını sıvı propanla doldurun. Soğutulmuş bir metal çubuk kullanarak propan katılaşmasını hızlandırın.Düz tip ve sepet tipi bakır diskleri hazırlamak için, harfsiz tarafı yukarı olacak şekilde bir cam kaydırağa yerleştirin ve diski bir iyon gözcü aparatı kullanarak hidrofilik hale getirmek için 30 saniye boyunca 10 pascals, 400 volt, bir miliamperde kızdırma deşarjı ile muamele edin. Hücre süspansiyonu oda sıcaklığında 10 saniye boyunca 2.900 kez G'de iki mililitre santrifüj tüpüne ve santrifüje aktarın. Kalın bir süspansiyon elde etmek için süpernatant çıkarın ve peletin askıya alın.Bakır bir diske az miktarda veya yaklaşık 0,02 mikrolitre hücre süspansiyonu yerleştirin. Üzerini başka bir bakır diskle örtün ve diskleri cımbızla alın. İnce metal çubukla katı propanın ortasına bir kuyu yapın.Cımbızı bir SFD'ye ayarlayın ve cihazın enjeksiyon düğmesine basarak hızla dondurun. Kullanılan cımbızları oda sıcaklığındaki suda bekleterek aşağıdaki örnekleri dondurmak için ısıtın. %2,5 glutaraldehit, 0,1 molar fosfat tamponu pH 7,4'e sabitlenmiş hayvan ve insan dokularını kullanın.Stereo mikroskop altında jiletle 0,1 ila 0,2 milimetre kalınlığında bölümler halinde dilimleyin. Glutaraldehit çözeltisinin küçük bir damlasını sepet tipi bakır diske yerleştirin, ardından cımbız kullanarak bakır diskteki glutaraldehitin içine bir parça doku yerleştirin ve düz bakır diskle örtün. Diskleri daha önce gösterildiği gibi SFD'nin eriyen propanındaki dokularla hızla dondurun.Diskleri çalışan bir banyoda sıvı nitrojene aktarın. Sıvı nitrojenle soğutulmuş bir çift cımbız kullanarak, numuneyi açığa çıkarmak için diskleri birbirinden ayırın. Hücrelerin bulunduğu diskleri, sıvı nitrojene yerleştirilmiş ve katılaşmış%2 osmiyum tetroksit içeren bir mililitre asetonla doldurulmuş bir cam şişeye yerleştirin.Diskleri derin bir dondurucuya aktarın ve hücrelerin dondurulması için iki ila dört gün boyunca eksi 80 santigrat derecede tutun. Örnekleri yavaş yavaş eksi 20 santigrat derecede iki saat, dört santigrat derecede iki saat ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırarak oda sıcaklığına getirin. Diskleri bir mililitre asetonla doldurulmuş iki mililitre plastik boruya aktarın.Reaktifleri bir karıştırıcı kullanarak tek kullanımlık plastik bir kapta karıştırarak epoksi reçinesi hazırlayın. Asetonda% 30 reçine, her biri bir saat oda sıcaklığında% 60 reçine ve% 90 reçine ile art arda değiştirin, ardından% 90 reçineyi bir gecede 37 santigrat derecede% 100 reçine ile değiştirin. Son olarak, numuneleri silikon gömme kalıbına% 100 reçineye gömün ve 24 saat boyunca 60 santigrat derecede polimerize edin.Polimerize blokları silikon gömme kalıplarından çıkar ve numune numarasını bloğa yazın. Bakır diskleri bir jiletle bloktan çıkarın ve stereo mikroskop altında ultrasonik bir kesme bıçağı ve jilet kullanarak blok yüzeye gömülü örnekleri kesin. Daha sonra, numune bloğu aynasına ve mikrotom numune tutucusuna bant uygulayın ve bandı sınırda kesin.Bloğu ultra mikrotomdan çıkarın, stereo mikroskopla ayarlayın ve jilet kullanarak 0,3 milimetreye 0,2 milimetreye kadar kesin. Yapışkan hale getirmek için ızgaralara neopren uygulayın. Bantlanmış parçaları hizalayarak bloğu ultra mikrotom üzerinde geri ayarlayın.Ultra mikrotomları plastik bir kapakla örtün ve 50 ila 70 nanometre kalınlığında bölümler kesin. Döngü kullanarak bölümleri alın. Neopilen ile muamele edilmiş 300 veya 400 örgü bakır ızgaraya monte edin ve kurutun.Izgaraları yarım silikon tüpün oluğunda bölümleri olan şekilde ayarlayın. Örnekleri üç dakika boyunca uranil asetat çözeltisinde bekletin. Kullanılmış uranil çözeltisini toplayın ve bir şırınnada saklayın.Numuneleri yarım tüpte bir su jeti ile yıkayın, ardından numuneleri üç dakika boyunca kurşun sitratta bekletin. Maya ve mantar örnekleri için ızgaraları bir filtre kağıdına yerleştirin, cımbızla alın ve su yüzeyinde plazma polimerize naftalin filmi ile örtün. Izgaraları bir elektron mikroskobun numune tutucusuna yerleştirin, ardından numune tutucuyu elektron mikroskobuna yerleştirin ve 100 kilovoltta gözlemleyin.Elektron mikroskobu altında gözlendiğinde hem E.coli hem de S.cerevisiae'nin ultra ince bölümleri doğal morfoloji ve net görüntüler gösterdi. Elektron mikroskobu altında SFD kullanılarak hızla dondurulan kültürlü hücrelerin ultra ince bölümleri gözlendi. İnsan derisinin ultra ince bölümlerinin görüntüleri çok açıktı ve doğal morfoloji gösterdi.Hepatit B virüs çekirdek parçacıkları SFD ile hızla donduruldu ve kriyo elektron mikroskopisi ile gözlemlendi. Unutulmaması gereken en önemli şey, bakır disklere çok az miktarda hücre uygulamanız gerektiğidir, böylece donma sırasında buz kristali oluşumunun önüne geçilir. Hayvan dokularını önceden glutaraldehit ile sabitlenerek, yüksek basınçlı dondurma ile elde edilen derinliğe benzer şekilde yaklaşık 200 mikrometre derinlikte iyi donma elde edilir.Bu teknik, bir araştırmacının hücrelerin enfes doğal ultra yapısını düşük maliyetle kolayca gözlemlemesinin önünü açıyor.

Research

JoVE Journal

Biology

Freezing Human ES Cells

Donma İnsan ES Hücreler

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Flaş Dondurma ve E12.5 Fare Beyin Cryosectioning

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Donma Çözülme ve Ulaştırma Ambalaj Hücreler

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücreler Donma ve Çözülme

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Doku Triyaj ve İskelet Kası Hastalıkları Modeller için Donma

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Biyolojik Elektron Mikroskopi Freeze-kırık / Freeze etche Temel Teknik Elemanları

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Bir Deniz Tubeworm Canlı Optik ve Elektron Mikroskobu Teknikleri Kullanılarak kalsifikasyon Olaylar Karakterizasyonu

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...