Name: retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2016YFC1101103، 2017YFA0104101)، وصندوق مشروع العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (201803010078)، ومشروع العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة قوانغدونغ (2017B020230003)، ومؤسسة العلوم الطبيعية (NSF) في الصين (81570874، 81970842)، وبرنامج مائة موهبة من جامعة صن يات صن (PT1001010)، وصناديق البحوث الأساسية في المختبر الرئيسي للدولة لطب العيون.

1. ثقافة وتوسيع hPSCs
<ol><li>ثقافة HPSC
	<ol>
<li>معطف اثنين من الآبار من لوحة 6-جيدا مع مصفوفة خارج الخلية (ECM، مصفوفة المؤهلين hESC). إعداد 50 مل من محلول ECM يحتوي على 8-12 ميكروغرام / مل من ECM في متوسط النسر المعدل في دولبيكو (DMEM). في 49 مل من DMEM، أضف 1 مل من محلول مخزون ECM المذاب (50x). أضف 1 مل من محلول ECM إل...

<ol>
	<li>Flaxman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+causes+of+blindness+and+distance+vision+impairment+1990-2020:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells:+From+clinical+trial+in+a+dish+to+precision+medicine.">Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine.</a> Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Brooks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+retinal+organoid+differentiation+by+modulating+signaling+pathways+revealed+by+comparative+transcriptome+analyses+with+development+in+vivo.">Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo.</a> Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).</li><li>Zerti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+simple+method+to+enhance+the+generation+of+cone+and+rod+photoreceptors+in+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids.">Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).</li><li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse,+monkey+and+human+embryonic+stem+cells.">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), (2018).</li><li>Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+photoreceptors+restores+some+visual+function+in+Crx-deficient+mice.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Therapy+for+Retinal+Diseases.">Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases.</a> Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+organoids:+a+window+into+human+retinal+development.">Retinal organoids: a window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), (2020).</li><li>Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+axis+specification+occur+in+parallel+during+optic+cup+and+optic+fissure+formation,+differentially+modulated+by+BMP+and+Wnt.">Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt.</a> Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).</li><li>Patel, A., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+pathways+in+optic+fissure+closure.">Genes and pathways in optic fissure closure.</a> Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).</li><li>Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+Ggap:+Mechanisms+of+epithelial+fusion+during+optic+fissure+closure.">Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+retinal+organoids+with+mature+rods+and+cones+from+urine-derived+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+RPE+spheroids+facilitates+enrichment+and+expansion+of+hiPSC-derived+RPE+generated+on+retinal+organoid+induction+platform.">Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+induced+pluripotent+stem+cells+and+retinal+organoids+from+a+leber's+congenital+amaurosis+patient+with+novel+RPE65+mutations.">Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).</li><li>Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+platform+for+personalized+and+precision+cardiovascular+medicine.">Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine.</a> Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3d+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li><li>Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+retinal+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).</li><li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue.">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communication. 6, 6286 (2015).</li><li>da Silva, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+expression+and+degradation+of+retinoic+acid+are+required+for+patterning+a+high-acuity+area+in+the+retina.">Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina.</a> Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).</li><li>Mitchell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+regulates+differential+expression+of+the+tandemly-duplicated+long+wavelength-sensitive+cone+opsin+genes+in+zebrafish.">Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).</li><li>Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+photoreceptor-generating+retinal+progenitors+revealed+by+prolonged+retinoic+acid+exposure.">Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure.</a> BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).</li><li>Eldred, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+specifies+cone+subtypes+in+human+retinal+organoids.">Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids.</a> Science. 362 (6411), (2018).</li><li>Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+in+retinal+development,+survival,+and+disease.">Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease.</a> Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).</li><li>Brzezinski, J. A., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+cell+fate+specification+in+vertebrates.">Photoreceptor cell fate specification in vertebrates.</a> Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+transcriptome+profiling,+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids.">Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li><li>Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+adhesion-dependent+cell+survival+and+ROCK-regulated+actomyosin-driven+forces+mediate+self-formation+of+a+retinal+organoid.">Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid.</a> Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).</li><li>Carcamo-Orive, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transcriptional+variability+in+a+large+human+ipsc+library+reveals+genetic+and+non-genetic+determinants+of+heterogeneity.">Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).</li><li>DeBoever, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+reveals+the+influence+of+genetic+variation+on+gene+expression+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).</li></ol>

في هذا البروتوكول التعريفي الشبكي متعدد الخطوات، تم توجيه hPSCs خطوة بخطوة للحصول على مصير الشبكية، ونظمت ذاتيا في organoids الشبكية التي تحتوي على NR مغلفة وRPE. خلال التمايز، قامت hPSCs بتلخيص جميع الخطوات الرئيسية لتطور الشبكية البشرية في الجسم الحي، من EF و OV و RPE ، إلى صفح الشبكية ، مما أدى إل?...

تتميز الأمراض التنكسية الشبكية (RDs) ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD) والتهاب الشبكية الصباغي (RP) ، بضعف ووفاة خلايا المستقبل الضوئي وتؤدي عادة إلى فقدان البصر الذي لا رجعة فيه دون طرق فعالة لعلاج1. الآلية الكامنة وراء هذه الأمراض غير معروفة إلى حد كبير ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود نماذج الأمراض البشرية2. على مدى العقود الماضية، تم تحقيق تقدم كبير في الطب التجديدي من خلال تكنولوجيا الخلايا الجذعية. وقد أظهرت العديد من الباحثين، بما في ذلك أنفسنا، أن الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs)، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا (hiPSCs)، يمكن أن تفرق في جميع أنواع خلايا الشبكية، حتى الأنسجة الشبكية المصغرة من خلال نهج التمايز المختلفة3،4،5،6،7،8،9،10، 11, توفير إمكانات هائلة في نمذجة المرض والعلاج الخلوي12,13,14.
ومع ذلك ، فإن عملية التعريفي من hPSCs إلى خلايا الشبكية معقدة للغاية وتستغرق وقتا طويلا مع تكرار منخفض ، مما يتطلب باحثين ذوي خبرة غنية ومهارات عالية. خلال عملية التعريفي المعقدة والديناميكية ، سيؤثر عدد من العوامل على غلة أنسجة الشبكية15،16،17. أيضا، تختلف أساليب التعريف المختلفة في كثير من الأحيان اختلافا كبيرا في التوقيت والتعبير القوي عن علامات الشبكية، والتي قد تربك جمع العينات وتفسير البيانات3. ولذلك، سيكون هناك طلب على بروتوكول مباشر لتمايز الشبكية عن مركبات الكربون الهيدروفلورية مع توجيه خطوة بخطوة.
هنا، استنادا إلى دراساتنا المنشورة18،19،20،21، يتم وصف بروتوكول تحريض الشبكية الأمثل لتوليد أعضاء الشبكية (ROs) مع مستقبلات ضوئية مخروطية غنية من hPSCs ، والتي لا تتطلب تكملة حمض الريتينويك (RA). يركز هذا البروتوكول على وصف الأسلوب متعدد الخطوات لتوليد الشبكية العصبية وRPE. تشكيل EB هو الجزء الأساسي من مرحلة التعريفي المبكر. يتم تحسين كل من حجم وكثافة الطلاء من EBs كميا، مما يعزز علميا غلة أنسجة الشبكية ويعزز التكرار. في الجزء الثاني من الحث ، تنظم الحويصلات البصرية (OVs) نفسها في ثقافة الالتزام وشكل ROs في ثقافة التعليق ؛ دورات الوقت والكفاءة من هذا الجزء تختلف اختلافا كبيرا في خطوط hPSC مختلفة. نضوج ومواصفات خلايا الشبكية في ROs تحدث أساسا في المرحلة الوسطى والمتأخرة من التعريفي. دون إضافة RA، يمكن إنتاج مستقبلات ضوئية ناضجة مع كل من المخاريط الغنية وقضبان.
الغرض من هذا البروتوكول هو وصف تفاصيل كل خطوة من خطوات الباحثين عديمي الخبرة لتكرارها. وقد تم حث مختلف خطوط hPSC بنجاح في ROs من خلال هذا البروتوكول مع غلة قوية من أنسجة الشبكية الغنية بالمخروط وقابلية التكرار العالية. يمكن لمنظمات المجتمع المدني المشتقة من HPSCs مع هذا البروتوكول تلخيص الخطوات الرئيسية لتطور الشبكية في الجسم الحي، والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل ، مما يسهل تطبيقات المصب ، مثل نمذجة الأمراض ، وفحص الأدوية ، والعلاج بالخلايا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#8722;)-Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560-5mg</td>
			<td>ROCK-inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml tips</td>
			<td>Kirgen</td>
			<td>KG1313</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>3141001</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCD000100</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Tissue culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>313000</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells tissue culture plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AP2&#945; Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>3b5</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ISL1 Antibody</td>
			<td>Boster</td>
			<td>BM4446</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-L/M opsin Antibody</td>
			<td>gift from Dr. jeremy</td>
			<td>/</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>pax6</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Recoverin Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab5585</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rhodopsin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5417</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sheep 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21436</td>
			<td>Donkey anti-Sheep IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX9 Antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>A19710</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VSX2 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab9016</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement W/O VIT A (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube vial</td>
			<td>Thermo scientific-NUNC</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>D532</td>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole 
			dihydrochloride; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM /F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5 M PH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>NATOCOR</td>
			<td>SFBE</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>0.22&#956;m, sterile Millex filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td>2 mg/ml in PBS to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>MEM NEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEM CELL</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSCs maintenance medium (MM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer</td>
			<td>GNM</td>
			<td>GNM10010</td>
			<td>Without Ca+,Mg+,PH7.2&#177;0.1 0.1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3262-20EA</td>
			<td>Petri dish</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells

أمراض الشبكية التنكسية هي الأسباب الرئيسية للعمى لا رجعة فيه دون علاج فعال. الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي لديها القدرة على التفريق في جميع أنواع خلايا الشبكية، حتى أنسجة الشبكية المصغرة، تحمل وعودا ضخمة للمرضى الذين يعانون من هذه الأمراض والعديد من الفرص في نمذجة الأمراض وفحص الأدوية. ومع ذلك، فإن عملية الحث من hPSCs إلى خلايا الشبكية معقدة وتستغرق وقتا طويلا. هنا، نقوم بوصف بروتوكول تحريض شبكية العين الأمثل لتوليد أنسجة الشبكية مع إعادة إنتاج عالية والكفاءة، ومناسبة لمختلف الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. يتم تنفيذ هذا البروتوكول دون إضافة حمض الريتينويك ، والذي يفيد إثراء مستقبلات ضوئية مخروطية. ميزة هذا البروتوكول هو تحديد حجم EB وكثافة الطلاء لتعزيز كفاءة وتكرار تحريض الشبكية بشكل كبير. مع هذه الطريقة، تظهر جميع خلايا الشبكية الرئيسية بشكل تسلسلي وتلخص الخطوات الرئيسية لتطور الشبكية. وسوف يسهل تطبيقات المصب، مثل نمذجة الأمراض والعلاج بالخلايا.

عملية تحريض الشبكية في هذا البروتوكول تحاكي تطور شبكية العين الجنينية البشرية. لبدء التمايز الشبكي، تم فصل hPSCs إلى كتل صغيرة ومثقفة في تعليق للحث على تشكيل EBs. على D1، المجاميع الخلية الموحدة أو EBs شكلت(الشكل 1C). تم نقل الوسط الثقافي تدريجيا إلى NIM. على D5 ، كانت مطلية EBs على أطبا...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

هنا نحن نصف نظام التعريفي الجهازي الشبكية الأمثل، والتي هي مناسبة لمختلف خطوط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات لتوليد أنسجة الشبكية مع استنساخ عالية والكفاءة.

نظام تحريض الشبكية Organoid لاستخلاص أنسجة الشبكية ثلاثية الأبعاد من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

عملية التعريفي من hPSCs إلى خلايا الشبكية معقدة وتستغرق وقتا طويلا. هذا البروتوكول الأمثل يمكن أن تولد أنسجة الشبكية مع استنساخ عالية وبدون تكلفة. ميزة هذا البروتوكول هو تحديد حجم EB وكثافة الطلاء لتعزيز كفاءة وتكرار تحريض الشبكية بشكل كبير من hPSCs.مع هذه الطريقة، تظهر جميع خلايا الشبكية الرئيسية بشكل تسلسلي وتلخص الخطوات الرئيسية لتطور الشبكية. وسوف يسهل نمذجة الأمراض والعلاج بالخلايا للأمراض التنكسية الشبكية. إثبات الإجراء، ونحن مع يوانيوان غوان، وهو طالب دكتوراه، وبينغبينغ شيه، وهو فني من المختبر.ابدأ بإعداد 50 مل من حلول ECM بإضافة 1 مل من حل المخزون 50 مرة الثالث إلى 50 مل من DMEM. ثم، إضافة 1 مل من هذا الحل ECM أعدت لكل بئر من لوحة من ستة آبار واحتضانه لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. إعداد hPSC صيانة المتوسطة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وprewarm إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.صب قارورة المبردة من hPSCs من خزان النيتروجين السائل عن طريق احتضانه في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. تطهير بعناية باستخدام رذاذ الكحول 75٪، ووضعها في خزانة السلامة الحيوية. نقل تعليق الخلية من القارورة إلى أنبوب 15 ملليمتر.ثم، إضافة 5 مل من الصيانة قبل الحارة المتوسطة قطرة قطرة إلى الأنبوب باستخدام ماصة 5 مل، في حين يهز بلطف أنبوب لمزج hPSCs. طرد مركزي الأنبوب في 170 مرة G لمدة خمس دقائق. إزالة بعناية معظم supernatant باستخدام ماصة 1 مل، تاركا وراءه ما يقرب من 50 ميكرولتر من supernatant لتجنب فقدان الخلايا.إعادة تعليق بيليه مع 1 مل من الصيانة المتوسطة عن طريق pipetting صعودا وهبوطا. إزالة ECM من الآبار المغلفة مسبقا وإضافة 1.5 ملليلتر من الصيانة المتوسطة إلى كل بئر. ثم توزيع 0.5 ملليلتر من تعليق الخلية في كل بئر.يهز بلطف لوحة لتوزيع hPSCs بشكل موحد. ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة على الأقل لتعزيز الالتزام بالخلايا. تغيير المتوسطة كل يوم ومرور hPSCs في التقاء 80٪.في اليوم-0، ابدأ التمايز عن طريق إزالة خلايا الالتقاء بنسبة 80٪ من بئر واحد من لوحة الستة آبار. جمع الخلايا مع حل ينفصم EDTA كما هو موضح في المخطوطة النصية. إزالة الحل EDTA وإضافة 1 مل من صيانة المتوسطة التي تحتوي على 10 فلوفاستاتين ميكرومولار لوقف تفكك الخلايا.جمع الخلايا مع ماصة 1 مل. نقل تعليق الخلية إلى 100 ملليمتر فائقة منخفضة تعلق طبق بيتري وإضافة 9 مل من متوسط الصيانة التي تحتوي على 10 فلوفاستاتين ميكرومولار إلى الطبق. يهز الطبق برفق مرتين لتوزيع الخلايا بشكل موحد.ثم ضعها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة على الأقل ، لاحظها تحت المجهر. أضف 9 مل من متوسط الصيانة و3 مل من NIM إلى أنبوب 15 مل.نقل ثقافات الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وإضافة 10 مل من خليط NIM قبل الحارة إلى الطبق. طرد مركزي الأنبوب في 60 مرة G لمدة 3 دقائق لجمع المجاميع. ثم إزالة supernatant باستخدام ماصة 5 مل، تاركا وراءه ما يقرب من 500 ميكرولتر لتجنب فقدان الخلايا.أضف 2 مل من الخليط إلى الأنبوب ونقل التعليق مرة أخرى إلى نفس طبق بيتري. يهز الطبق برفق لتوزيع مجاميع الخلية بشكل موحد. ثم، وضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة.في اليوم الخامس، قم بإزالة ECM من الأطباق المغلفة مسبقا وأضف 10 مل من NIM التي تم تسخينها مسبقا إلى كل طبق. أخرج الطبق الذي يحتوي على Ebs وتحقق من جودة EBs تحت المجهر ، مع التأكد من أنها مشرقة ومستديرة. جمع جميع EBs في أنبوب 15 مل والسماح لهم لتسوية لمدة 5 دقائق.ثم، وإزالة معظم supernatant، تاركا وراءه حوالي 2 مل من المتوسطة. بعد عد EBs، البذور لهم قطرة ب قطرة في كثافة ما يقرب من 2-3 EBs لكل سنتيمتر مربع في أطباق مغلفة تحتوي على 10 مل من NIM. هز الأطباق برفق لتوزيع EBs بشكل موحد ووضعها في الحاضنة لمدة 24 ساعة على الأقل.استخدم إبرة التنغستن أو إبرة مع حقنة 1 مل لفصل الحويصلات البصرية التي يمكن التعرف عليها شكليا ميكانيكيا، جنبا إلى جنب مع ظهارة صبغة الشبكية المجاورة في الأيام من 28 إلى 35. ثقافة لهم في التعليق. وضع 50-60 الحويصلات البصرية في كل طبق ثقافة مرفق منخفض 100 ملليمتر، تحتوي على 15 مل من RDM لتشكيل الجهاز الشبكية.تغيير المتوسطة كل 2 إلى 3 أيام حتى يوم-42. ولبدء التمايز الشبكي، تم فصل مركبات hPSCs إلى كتل صغيرة وزرعت في التعليق، والتي شكلت EBs منذ اليوم الأول. في اليوم -5 كانت مطلية EBs على أطباق الثقافة المغلفة ب ECM وهاجرت الخلايا تدريجيا من EBs.في اليوم -16 ، تم استبدال وسيط التعريفي RDM ، مما تسبب في تشكيل نطاقات شبكية العين العصبية وتبرز تدريجيا من الطبق ، وكذلك ، تشكيل خلايا تشبه الحويكل البصري محاطة بخلايا RPE. خلال أيام-28 إلى 35، الأجهزة العضوية الشبكية تتكون من شبكية العين العصبية، تعلق على كرة RPE. في جانب واحد، تشكلت الخلايا.ومع تقدم تمايز الشبكية ومواصفاتها، أنتجت hPSCs أنواعا فرعية من شبكية العين العصبية التي اصطفت تدريجيا في طبقات، تحاكي السمات المعمارية لشبكية العين البشرية الأصلية. تم توليد خلايا العقدة الشبكية لأول مرة من السلف الشبكية وتراكمت في الجانب القاعدي من شبكية العين العصبية. مع هذا البروتوكول، تطورت organoids الشبكية إلى مستقبلات ضوئية ناضجة للغاية مع كل من قضبان غنية والمخاريط.وتقع خلايا المستقبلات الضوئية في الجانب apical، في حين أن خلايا الأماغرين والخلايا الأفقية والخلايا ثنائية القطب والخلايا الدبقية مولر كانت كلها تقع في الطبقة المتوسطة من شبكية العين العصبية. النقاط الرئيسية لهذا البروتوكول هي خلق جودة عالية من Ebs وبذر لهم في الكثافة المناسبة.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

أسلوب مبسط لل<em&gt; في الموقع</em&gt; استئصال القرنية ونزع الأحشاء من نسيج شبكي من الكرة الأرضية العين البشرية

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

تحليل Transcriptomic من العينات الجراحية الإنسان الشبكية عن طريق مجلة

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

لتخصيب Chemoresistant سرطان المبيض الخلايا الجذعية من خطوط الخلايا البشرية

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

الكمية قاع العين تألق ذاتي لتقييم أمراض الشبكية

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

نموذج الحاد الشبكية لتقييم الدم الشبكية الحاجز خرق والمحتملة أدوية لعلاج

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-الناجم عن تورم في الأمعاء Organoids: ل<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لتقييم الاستجابة للدواء في التليف الكيسي المرضى

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

باستخدام تصوير الشبكية لدراسة الخرف

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

تحريض وتحليل الإجهاد التأكسدي في الجمال النائم Transposon-Transfected الخلايا الظهارية صبغة الشبكية البشرية

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...