Name: retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af National Key R &D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), Science &Technology Project of Guangdong Province (2017B020230003), Natural Science Foundation (NSF) i Kina (81570874, 81970842), Hundred talentprogram for Sun Yat-sen University (PT1001010) og de grundlæggende forskningsfonde i statens nøglelaboratorium for oftalmologi.

1. Kultur og udvidelse af hPSC'er
<ol><li>HPSC-kultur
	<ol>
<li>Coat to brønde af en 6-brønds plade med ekstracellulær matrix (ECM, hESC-kvalificeret matrix). Klargør 50 mL af en ECM-opløsning, der indeholder 8-12 μg/mL ECM i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM). I 49 mL DMEM tilsættes 1 mL af den optøede ECM-lageropløsning (50x). Tilsættes 1 mL af ECM-opløsningen til hver brønd af en 6-brønds plade. Inkuberes i 1 time i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2.</li>
		<li>Forbere...

<ol>
	<li>Flaxman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+causes+of+blindness+and+distance+vision+impairment+1990-2020:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells:+From+clinical+trial+in+a+dish+to+precision+medicine.">Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine.</a> Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Brooks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+retinal+organoid+differentiation+by+modulating+signaling+pathways+revealed+by+comparative+transcriptome+analyses+with+development+in+vivo.">Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo.</a> Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).</li><li>Zerti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+simple+method+to+enhance+the+generation+of+cone+and+rod+photoreceptors+in+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids.">Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).</li><li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse,+monkey+and+human+embryonic+stem+cells.">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), (2018).</li><li>Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+photoreceptors+restores+some+visual+function+in+Crx-deficient+mice.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Therapy+for+Retinal+Diseases.">Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases.</a> Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+organoids:+a+window+into+human+retinal+development.">Retinal organoids: a window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), (2020).</li><li>Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+axis+specification+occur+in+parallel+during+optic+cup+and+optic+fissure+formation,+differentially+modulated+by+BMP+and+Wnt.">Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt.</a> Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).</li><li>Patel, A., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+pathways+in+optic+fissure+closure.">Genes and pathways in optic fissure closure.</a> Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).</li><li>Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+Ggap:+Mechanisms+of+epithelial+fusion+during+optic+fissure+closure.">Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+retinal+organoids+with+mature+rods+and+cones+from+urine-derived+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+RPE+spheroids+facilitates+enrichment+and+expansion+of+hiPSC-derived+RPE+generated+on+retinal+organoid+induction+platform.">Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+induced+pluripotent+stem+cells+and+retinal+organoids+from+a+leber's+congenital+amaurosis+patient+with+novel+RPE65+mutations.">Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).</li><li>Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+platform+for+personalized+and+precision+cardiovascular+medicine.">Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine.</a> Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3d+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li><li>Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+retinal+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).</li><li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue.">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communication. 6, 6286 (2015).</li><li>da Silva, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+expression+and+degradation+of+retinoic+acid+are+required+for+patterning+a+high-acuity+area+in+the+retina.">Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina.</a> Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).</li><li>Mitchell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+regulates+differential+expression+of+the+tandemly-duplicated+long+wavelength-sensitive+cone+opsin+genes+in+zebrafish.">Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).</li><li>Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+photoreceptor-generating+retinal+progenitors+revealed+by+prolonged+retinoic+acid+exposure.">Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure.</a> BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).</li><li>Eldred, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+specifies+cone+subtypes+in+human+retinal+organoids.">Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids.</a> Science. 362 (6411), (2018).</li><li>Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+in+retinal+development,+survival,+and+disease.">Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease.</a> Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).</li><li>Brzezinski, J. A., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+cell+fate+specification+in+vertebrates.">Photoreceptor cell fate specification in vertebrates.</a> Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+transcriptome+profiling,+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids.">Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li><li>Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+adhesion-dependent+cell+survival+and+ROCK-regulated+actomyosin-driven+forces+mediate+self-formation+of+a+retinal+organoid.">Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid.</a> Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).</li><li>Carcamo-Orive, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transcriptional+variability+in+a+large+human+ipsc+library+reveals+genetic+and+non-genetic+determinants+of+heterogeneity.">Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).</li><li>DeBoever, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+reveals+the+influence+of+genetic+variation+on+gene+expression+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).</li></ol>

I denne multi-trins retinale induktion protokol, hPSCs blev guidet trin for trin for at få retinal skæbne, og selvorganiseret i retinale organoider, der indeholder lamineret NR og RPE. Under differentiering, hPSCs rekapituleret alle større trin i den menneskelige retinale udvikling in vivo, fra EF, OV, og RPE, til retinal laminering, generere alle undertyper af retinale celler, herunder retinale ganglion celler, amakrine celler, bipolare celler, stang, og kegle fotoreceptorer, og muller glial celler i en ruml...

Retinal degenerative sygdomme (RDs), såsom aldersrelaterede makuladegeneration (AMD) og retinitis pigmentosa (RP), er karakteriseret ved dysfunktion og død fotoreceptor celler og typisk føre til irreversibel synstab uden effektive måder at helbrede1. Mekanismen bag disse sygdomme er stort set ukendt delvist på grund af mangel på menneskelige sygdomsmodeller2. I løbet af de sidste årtier er der sket betydelige fremskridt inden for regenerativ medicin gennem stamcelleteknologi. Mange forskere, herunder os selv, har vist, at humane pluripotente stamceller (hPSCs), herunder menneskelige embryonale stamceller (hESC' er) og menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC'er), kan differentiere sig til alle typer retinale celler, selv mini-retinale væv gennem forskellige differentieringsmetoder3,4,5,6,7,8,9,10, 11, giver enorme potentiale i sygdom modellering og celleterapi12,13,14.
Induktionsprocessen fra hPSCs til retinale celler er imidlertid meget kompliceret og tidskrævende med lav repeterbarhed, hvilket kræver forskere med rig erfaring og høje færdigheder. Under den komplekse og dynamiske induktionsproces vil en række faktorer påvirke udbyttet af retinal væv15,16,17. Forskellige induktionsmetoder varierer også ofte betydeligt i timing og robust udtryk for retinale markører, hvilket kan forvirre prøveindsamlingen og datafortolkningen3. Derfor ville en enkel protokol med retinal differentiering fra hPSC'er med trinvis vejledning være efterspurgt.
Her, baseret på vores offentliggjorte undersøgelser18,19,20,21, en optimeret retinal induktion protokol til at generere retinale organoider (ROs) med rige kegle fotoreceptorer fra hPSCs er beskrevet, som ikke kræver tilskud af retinosyre (RA). Denne protokol fokuserer på beskrivelsen af multi-trins metode til at generere neural nethinden og RPE. EB-dannelse er den væsentlige del af den tidlige induktionsfase. Både størrelse og plating tæthed af EBs er kvantitativt optimeret, hvilket videnskabeligt forbedrer udbyttet af retinale væv og fremmer repeterbarhed. I anden del af induktionen organiserer optiske vesikler (OVs) sig selv i klæbekulturen og ROs form i suspensionskulturen; tidskurserne og effektiviteten af denne del varierer betydeligt i forskellige hPSC-linjer. Modningen og specifikationen af retinale celler i ROs forekommer hovedsageligt i den midterste og sene fase af induktion. Uden tilsætning af RA kan modne fotoreceptorer med både rige kegler og stænger produceres.
Formålet med denne protokol er kvantitativt at beskrive og detaljer hvert trin for uerfarne forskere at gentage. Forskellige hPSC linjer er blevet med succes induceret i ROs af denne protokol med et robust udbytte af kegle-rige retinale væv og høj repeterbarhed. HPSCs-afledte ROs med denne protokol kan generobre de vigtigste trin i retinal udvikling in vivo, og overleve langsigtede, hvilket letter downstream applikationer, såsom sygdom modellering, lægemiddelscreening, og celleterapi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#8722;)-Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560-5mg</td>
			<td>ROCK-inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml tips</td>
			<td>Kirgen</td>
			<td>KG1313</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>3141001</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCD000100</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Tissue culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>313000</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells tissue culture plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AP2&#945; Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>3b5</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ISL1 Antibody</td>
			<td>Boster</td>
			<td>BM4446</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-L/M opsin Antibody</td>
			<td>gift from Dr. jeremy</td>
			<td>/</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>pax6</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Recoverin Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab5585</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rhodopsin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5417</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sheep 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21436</td>
			<td>Donkey anti-Sheep IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX9 Antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>A19710</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VSX2 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab9016</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement W/O VIT A (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube vial</td>
			<td>Thermo scientific-NUNC</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>D532</td>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole 
			dihydrochloride; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM /F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5 M PH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>NATOCOR</td>
			<td>SFBE</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>0.22&#956;m, sterile Millex filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td>2 mg/ml in PBS to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>MEM NEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEM CELL</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSCs maintenance medium (MM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer</td>
			<td>GNM</td>
			<td>GNM10010</td>
			<td>Without Ca+,Mg+,PH7.2&#177;0.1 0.1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3262-20EA</td>
			<td>Petri dish</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells

Retinal degenerative sygdomme er hovedårsagerne til irreversibel blindhed uden effektiv behandling. Pluripotente stamceller, der har potentiale til at differentiere sig til alle typer af retinale celler, selv mini-retinal væv, holde store løfter for patienter med disse sygdomme og mange muligheder i sygdom modellering og lægemiddelscreening. Induktionsprocessen fra hPSCs til retinale celler er imidlertid kompliceret og tidskrævende. Her beskriver vi en optimeret retinal induktionsprotokol til generering af retinale væv med høj reproducerbarhed og effektivitet, der passer til forskellige menneskelige pluripotente stamceller. Denne protokol udføres uden tilsætning af retinosyre, hvilket gavner berigelsen af kegle fotoreceptorer. Fordelen ved denne protokol er kvantificeringen af EB størrelse og plating tæthed til væsentligt at øge effektiviteten og repeterbarheden af retinal induktion. Med denne metode, alle større retinale celler sekventielt vises og rekapitulere de vigtigste trin i retinal udvikling. Det vil lette downstream applikationer, såsom sygdom modellering og celleterapi.

Den retinale induktion proces i denne protokol efterligner udviklingen af menneskelige foster nethinden. For at indlede nethindedifferentiering blev hPSC'er adskilt i små klumper og kultiveret i suspension for at fremkalde dannelsen af EBs. På D1 dannes de uniformerede celleaggregater eller EBs (figur 1C). Kulturmediet blev gradvist skiftet til NIM. På D5 blev EBs forgyldt på de ECM-coatede kulturretter. Cellerne migrerede gradvist ud af EB'erne (figur 1D). ...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Her beskriver vi et optimeret retinal organoid induktionssystem, som er velegnet til forskellige menneskelige pluripotente stamcellelinjer til at generere retinale væv med høj reproducerbarhed og effektivitet.

Retinal organoid induktionssystem til afledning af 3D Retinal-væv fra humane pluripotente stamceller

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Induktionsprocessen fra hPSCs til retinale celler er kompliceret og tidskrævende. Denne optimerede protokol kan generere retinal væv med høj reproducerbarhed og ingen omkostninger. Fordelen ved denne protokol er kvantificeringen af EB størrelse og plating tæthed til væsentligt at øge effektiviteten og repeterbarheden af retinal induktion fra hPSCs.Med denne metode, alle større retinale celler sekventielt vises og rekapitulere de vigtigste trin i retinal udvikling. Det vil lette sygdom modellering og celle terapi for retinale degenerative sygdomme. Viser proceduren, vi er med Yuanyuan Guan, en ph.d.-studerende, og Bingbing Xie, en tekniker fra laboratoriet.Begynd med at forberede 50 mL ECM-opløsning ved at tilføje 1 mL af den tredje 50 gange lagerløsning til 50 mL DMEM. Derefter tilsættes 1 mL af denne forberedte ECM-opløsning til hver brønd af en seks-brønd plade og inkuberer den i en time ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Forbered hPSC vedligeholdelse medium i henhold til producentens instruktion og prewarm det til stuetemperatur i 30 minutter.Hæld et kryogent hætteglas af hPSCs fra en flydende nitrogentank ved at inkubere det i et vandbad ved 37 grader Celsius i 30 sekunder. Desinficer det forsigtigt ved hjælp af en 75% alkoholspray og læg den i et biosikkerhedskab. Overfør celleaffjedringen fra hætteglasset til et 15 millimeter rør.Derefter tilsættes 5 mL forvarmet vedligeholdelse medium dråbe for dråbe til røret ved hjælp af en 5 mL pipette, mens forsigtigt ryster røret for at blande hPSCs. Centrifugere røret ved 170 gange G i fem minutter. Fjern forsigtigt det meste af supernatanten ved hjælp af en 1 mL pipette, efterlader ca. 50 mikroliter supernatant for at undgå at miste cellerne.Ophæng pelleten igen med 1 mL vedligeholdelsesmedium ved at pipetter op og ned. Fjern ECM fra de forbelagte brønde og tilsæt 1,5 milliliter vedligeholdelsesmedium til hver brønd. Fordel derefter 0,5 milliliter celleaffjedring i hver brønd.Ryst forsigtigt pladen for at fordele hPSC'erne ensartet. Sæt pladen i en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i mindst 24 timer for at fremme celleafbrænding. Skift medium hver dag og passage hPSCs ved 80% sammenløb.På dag-0 skal du starte differentiering ved at fjerne 80% sammenløbscellerne fra en brønd af seks-brøndspladen. Saml cellerne med EDTA-dissociationsopløsning som beskrevet i tekstmanuskriptet. Fjern EDTA-opløsningen, og tilsættes 1 mL vedligeholdelsesmedium, der indeholder 10 mikromolar fluvastatin for at stoppe celleadskillelse.Saml cellerne med en 1 mL pipette. Overfør celleaffjedringen til en 100 millimeter ultralav vedhæftet petriskål og tilsæt 9 mL vedligeholdelsesmedium, der indeholder 10 mikromolar fluvastatin til skålen. Ryst forsigtigt fadet to gange for at fordele cellerne ensartet.Sæt det derefter i inkubatoren ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Når cellerne er kultiveret i mindst 24 timer, observere dem under mikroskopet. Der tilsættes 9 mL vedligeholdelsesmedium og 3 mL NIM til et 15 mL rør.Overfør cellekulturerne til et 15 mL centrifugerør og tilsæt 10 mL af den forvarmede NIM-blanding til skålen. Centrifugere røret ved 60 gange G i 3 minutter for at indsamle aggregaterne. Fjern derefter supernatanten ved hjælp af en 5 mL pipette og efterlad ca. 500 mikroliter for at undgå at miste celler.Tilsæt 2 mL af blandingen til røret og overfør suspensionen tilbage til den samme Petriskål. Ryst forsigtigt fadet for at fordele celleaggregaterne ensartet. Sæt derefter skålen tilbage i inkubatoren.På dag-5 skal du fjerne ECM fra de forbelagte retter og tilføje 10 mL forvarmet NIM til hver skål. Tag fadet, der indeholder Ebs og kontrollere kvaliteten af EBs under mikroskopet, og sørg for, at de er lyse og runde. Saml alle EBs i et 15 ML rør og lad dem nøjes i 5 minutter.Fjern derefter det meste af supernatanten og efterlader ca. 2 mL medium. Efter optælling af EBs, så dem dråbe for fald ved en tæthed på ca 2-3 EBs per kvadratcentimeter i coatede retter, der indeholder 10 mL NIM. Ryst forsigtigt opvasken for at fordele EBs ensartet og læg dem i inkubatoren i mindst 24 timer.Brug en wolfram nål eller en nål med en 1 ML sprøjte til mekanisk løsne morfologisk identificerbare optiske vesikler, sammen med den tilstødende retinale pigment epitel på dage 28 til 35. Kultur dem i suspension. Sæt 50-60 optiske vesikler i hver 100 millimeter lav vedhæftet fil kultur skål, der indeholder 15 mL RDM for retinal organoid dannelse.Skift medium hver 2 til 3 dage indtil dag-42. For at indlede nethindedifferentiering blev hPSCs adskilt i små klumper og kultiveret i suspension, som dannede EBs siden dag-1. På dag-5 blev EBs belagt på ecm-coatede kulturretter, og cellerne migrerede gradvist ud af EBs.På dag-16, induktion medium blev erstattet af RDM, forårsager neurale nethinden domæner til at danne og gradvist stikke ud fra fadet, samt, celle danner optiske vesikel-lignende strukturer omgivet af RPE celler. I løbet af dag-28 til 35, retinale organoider bestående af neurale nethinden, knyttet til en RPE kugle. På den ene side dannede celler.Som retinal differentiering og specifikation skred frem, hPSCs produceret undertyper af neurale nethinden, der gradvist linet op i lag, efterligne de arkitektoniske træk ved en indfødt menneskelig nethinde. Retinal ganglion celler blev først genereret fra retinale forfædre og akkumuleret i den basale side af neuro nethinden. Med denne protokol udviklede retinale organoider sig til meget modne fotoreceptorer med både rige stænger og kegler.Fotoreceptorceller var placeret i den apikale side, mens amakrine celler, vandrette celler, bipolare celler og muller glialceller alle var placeret i det mellemliggende lag af neural nethinden. De vigtigste punkter i denne protokol er at skabe høj kvalitet af Ebs og såning dem på den rigtige tæthed.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

En forenklet teknik for<em&gt; In situ</em&gt; Excision af hornhinden og udtagning af retinavæv fra menneskelige øje Globe

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, karakterisering og sammenlignende differentiering af humane Dental Pulp stamceller fra blivende tænder ved hjælp af to forskellige metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Transkriptom analyse af menneskets retinale kirurgiske prøver vha. Journal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Berigelse for kemoterapi kræft i æggestokkene stamceller fra humane cellelinier

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studere i bugspytkirtlen Kræft stamceller Karakteristik for udvikling af nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Kvantitativ Fundus Autofluorescens for Vurdering af retinale sygdomme

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

En akut Retinal Model for Evaluering Blood Retinal Barrier tilsidesættelse og potentielle lægemidler til behandling

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolininduceret Hævelse i Intestinal Organoids: An<em&gt; In vitro</em&gt; Assay for Vurdering Drug respons i patienter med cystisk fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

Ved hjælp af retinale Imaging til at studere demens

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induktion og analyse af oxidativ stress i tornerose Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epitelceller

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...