Name: retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par le National Key R&D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), le Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), le Science & Technology Project of Guangdong Province (2017B020230003), la Natural Science Foundation (NSF) de Chine (81570874, 81970842), le programme Cent talents de l’Université Sun Yat-sen (PT1001010) et les Fonds de recherche fondamentale du State Key Laboratory of Ophthalmology.

1. Culture et expansion des CSEh
<ol><li>Culture HPSC
	<ol>
<li>Recouvrir deux puits d’une plaque de 6 puits avec matrice extracellulaire (ECM, matrice qualifiée hESC). Préparer 50 mL d’une solution ECM contenant 8-12 μg/mL d’ECM dans le milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco. Dans 49 mL de DMEM, ajouter 1 mL de la solution mère ECM décongelée (50x). Ajouter 1 mL de la solution ECM à chaque puits d’une plaque de 6 puits. Incuber pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C et 5% de<sub...

<ol>
	<li>Flaxman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+causes+of+blindness+and+distance+vision+impairment+1990-2020:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells:+From+clinical+trial+in+a+dish+to+precision+medicine.">Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine.</a> Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Brooks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+retinal+organoid+differentiation+by+modulating+signaling+pathways+revealed+by+comparative+transcriptome+analyses+with+development+in+vivo.">Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo.</a> Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).</li><li>Zerti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+simple+method+to+enhance+the+generation+of+cone+and+rod+photoreceptors+in+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids.">Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).</li><li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse,+monkey+and+human+embryonic+stem+cells.">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), (2018).</li><li>Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+photoreceptors+restores+some+visual+function+in+Crx-deficient+mice.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Therapy+for+Retinal+Diseases.">Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases.</a> Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+organoids:+a+window+into+human+retinal+development.">Retinal organoids: a window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), (2020).</li><li>Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+axis+specification+occur+in+parallel+during+optic+cup+and+optic+fissure+formation,+differentially+modulated+by+BMP+and+Wnt.">Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt.</a> Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).</li><li>Patel, A., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+pathways+in+optic+fissure+closure.">Genes and pathways in optic fissure closure.</a> Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).</li><li>Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+Ggap:+Mechanisms+of+epithelial+fusion+during+optic+fissure+closure.">Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+retinal+organoids+with+mature+rods+and+cones+from+urine-derived+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+RPE+spheroids+facilitates+enrichment+and+expansion+of+hiPSC-derived+RPE+generated+on+retinal+organoid+induction+platform.">Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+induced+pluripotent+stem+cells+and+retinal+organoids+from+a+leber's+congenital+amaurosis+patient+with+novel+RPE65+mutations.">Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).</li><li>Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+platform+for+personalized+and+precision+cardiovascular+medicine.">Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine.</a> Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3d+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li><li>Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+retinal+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).</li><li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue.">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communication. 6, 6286 (2015).</li><li>da Silva, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+expression+and+degradation+of+retinoic+acid+are+required+for+patterning+a+high-acuity+area+in+the+retina.">Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina.</a> Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).</li><li>Mitchell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+regulates+differential+expression+of+the+tandemly-duplicated+long+wavelength-sensitive+cone+opsin+genes+in+zebrafish.">Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).</li><li>Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+photoreceptor-generating+retinal+progenitors+revealed+by+prolonged+retinoic+acid+exposure.">Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure.</a> BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).</li><li>Eldred, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+specifies+cone+subtypes+in+human+retinal+organoids.">Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids.</a> Science. 362 (6411), (2018).</li><li>Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+in+retinal+development,+survival,+and+disease.">Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease.</a> Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).</li><li>Brzezinski, J. A., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+cell+fate+specification+in+vertebrates.">Photoreceptor cell fate specification in vertebrates.</a> Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+transcriptome+profiling,+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids.">Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li><li>Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+adhesion-dependent+cell+survival+and+ROCK-regulated+actomyosin-driven+forces+mediate+self-formation+of+a+retinal+organoid.">Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid.</a> Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).</li><li>Carcamo-Orive, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transcriptional+variability+in+a+large+human+ipsc+library+reveals+genetic+and+non-genetic+determinants+of+heterogeneity.">Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).</li><li>DeBoever, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+reveals+the+influence+of+genetic+variation+on+gene+expression+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).</li></ol>

Dans ce protocole d’induction rétinienne en plusieurs étapes, les CSEh ont été guidés étape par étape pour gagner le destin rétinien et auto-organisés en organoïdes rétiniens contenant des NR et des EPR stratifiés. Au cours de la différenciation, les CSEh ont récapitulé toutes les principales étapes du développement rétinien humain in vivo,de l’EF, de l’OV et de l’EPR à la stratification rétinienne, générant tous les sous-types de cellules rétiniennes, y compris les cellules gangli...

Les maladies dégénératives de la rétine (MR), telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) et la rétinite pigmentaire (RP), sont caractérisées par le dysfonctionnement et la mort des cellules photoréceptrices et entraînent généralement une perte de vision irréversible sans moyens efficaces de guérir1. Le mécanisme sous-jacent à ces maladies est largement inconnu en partie en raison de l’absence de modèles de maladies humaines2. Au cours des dernières décennies, des progrès importants ont été réalisés en médecine régénérative grâce à la technologie des cellules souches. De nombreux chercheurs, y compris nous-mêmes, ont montré que les cellules souches pluripotentes humaines (CSEh), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSH), peuvent se différencier en tous types de cellules rétiniennes, même les mini-tissus rétiniens par diverses approches de différenciation3,4,5,6,7,8,9,10, 11, offrant un énorme potentiel dans la modélisation des maladies et la thérapie cellulaire12,13,14.
Cependant, le processus d’induction des CSEh aux cellules rétiniennes est très compliqué et prend beaucoup de temps avec une faible répétabilité, ce qui nécessite des chercheurs ayant une riche expérience et des compétences élevées. Au cours du processus d’induction complexe et dynamique, un certain nombre de facteurs auront un impact sur le rendement des tissus rétiniens15,16,17. En outre, les différentes méthodes d’induction varient souvent considérablement dans le temps et l’expression robuste des marqueurs rétiniens, ce qui pourrait confondre la collecte d’échantillons et l’interprétation des données3. Par conséquent, un protocole simple de différenciation rétinienne des CSEh avec un guidage étape par étape serait en demande.
Ici, sur la base de nos études publiées18,19,20,21, un protocole d’induction rétinienne optimisé pour générer des organoïdes rétiniens (RO) avec des photorécepteurs coniques riches à partir de CSEh est décrit, ce qui ne nécessite pas le supplément d’acide rétinoïque (RA). Ce protocole se concentre sur la description de la méthode en plusieurs étapes pour générer la rétine neurale et l’EPR. La formation d’EB est la partie essentielle du stade précoce de l’induction. La taille et la densité de placage des CE sont quantitativement optimisées, ce qui améliore scientifiquement le rendement des tissus rétiniens et favorise la répétabilité. Dans la deuxième partie de l’induction, les vésicules optiques (VE) s’auto-organisent dans la culture d’adhérence et les RO se forment dans la culture de suspension; les parcours temporels et les gains d’efficacité de cette partie varient considérablement selon les lignes hPSC. La maturation et la spécification des cellules rétiniennes dans les OR se produisent principalement au stade moyen et tardif de l’induction. Sans l’ajout de PR, des photorécepteurs matures avec des cônes et des bâtonnets riches peuvent être produits.
Le but de ce protocole est de décrire quantitativement et de détailler chaque étape pour les chercheurs inexpérimentés à répéter. Diverses lignées de hPSC ont été induites avec succès dans les RO par ce protocole avec un rendement robuste de tissus rétiniens riches en cônes et une répétabilité élevée. Les RO dérivés des HPSC avec ce protocole peuvent récapituler les principales étapes du développement rétinien in vivoet survivre à long terme, ce qui facilite les applications en aval, telles que la modélisation des maladies, le dépistage des médicaments et la thérapie cellulaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#8722;)-Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560-5mg</td>
			<td>ROCK-inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml tips</td>
			<td>Kirgen</td>
			<td>KG1313</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>3141001</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCD000100</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Tissue culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>313000</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells tissue culture plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AP2&#945; Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>3b5</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ISL1 Antibody</td>
			<td>Boster</td>
			<td>BM4446</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-L/M opsin Antibody</td>
			<td>gift from Dr. jeremy</td>
			<td>/</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>pax6</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Recoverin Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab5585</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rhodopsin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5417</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sheep 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21436</td>
			<td>Donkey anti-Sheep IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX9 Antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>A19710</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VSX2 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab9016</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement W/O VIT A (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube vial</td>
			<td>Thermo scientific-NUNC</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>D532</td>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole 
			dihydrochloride; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM /F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5 M PH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>NATOCOR</td>
			<td>SFBE</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>0.22&#956;m, sterile Millex filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td>2 mg/ml in PBS to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>MEM NEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEM CELL</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSCs maintenance medium (MM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer</td>
			<td>GNM</td>
			<td>GNM10010</td>
			<td>Without Ca+,Mg+,PH7.2&#177;0.1 0.1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3262-20EA</td>
			<td>Petri dish</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells

Les maladies dégénératives de la rétine sont les principales causes de cécité irréversible sans traitement efficace. Les cellules souches pluripotentes qui ont le potentiel de se différencier en tous types de cellules rétiniennes, même les mini-tissus rétiniens, sont très prometteuses pour les patients atteints de ces maladies et offrent de nombreuses possibilités dans la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments. Cependant, le processus d’induction des CSEh aux cellules rétiniennes est compliqué et prend beaucoup de temps. Nous décrivons ici un protocole d’induction rétinienne optimisé pour générer des tissus rétiniens avec une reproductibilité et une efficacité élevées, adaptés à diverses cellules souches pluripotentes humaines. Ce protocole est réalisé sans ajout d’acide rétinoïque, ce qui profite à l’enrichissement des photorécepteurs coniques. L’avantage de ce protocole est la quantification de la taille EB et de la densité de placage pour améliorer considérablement l’efficacité et la répétabilité de l’induction rétinienne. Avec cette méthode, toutes les principales cellules rétiniennes apparaissent séquentiellement et récapitulent les principales étapes du développement rétinien. Il facilitera les applications en aval, telles que la modélisation des maladies et la thérapie cellulaire.

Le processus d’induction rétinienne dans ce protocole imite le développement de la rétine fœtale humaine. Pour initier la différenciation rétinienne, les CSEh ont été dissociés en petites touffes et cultivés en suspension pour induire la formation d’EBs. Sur D1, les agrégats cellulaires uniformes ou EBs se sont formés (Figure 1C). Le milieu de culture a été progressivement transféré en NIM. Sur D5, les ÉBs ont été plaqués sur les plats de culture enrobés d’ECM. Les...

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Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Nous décrivons ici un système d’induction organoïde rétinienne optimisé, qui convient à diverses lignées de cellules souches pluripotentes humaines pour générer des tissus rétiniens avec une reproductibilité et une efficacité élevées.

Système d’induction organoïde rétinienne pour la dérivation de tissus rétiniens 3D à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Le processus d’induction des CSEh aux cellules rétiniennes est compliqué et prend beaucoup de temps. Ce protocole optimisé peut générer des tissus rétiniens avec une reproductibilité élevée et sans frais. L’avantage de ce protocole est la quantification de la taille EB et de la densité de placage pour améliorer considérablement l’efficacité et la répétabilité de l’induction rétinienne à partir de CSEh.Avec cette méthode, toutes les principales cellules rétiniennes apparaissent séquentiellement et récapitulent les principales étapes du développement rétinien. Il facilitera la modélisation des maladies et la thérapie cellulaire pour les maladies dégénératives rétiniennes. Pour démontrer la procédure, nous sommes avec Yuanyuan Guan, un doctorant, et Bingbing Xie, un technicien du laboratoire.Commencez par préparer 50 mL de solution ECM en ajoutant 1 mL de la troisième solution mère 50 fois à 50 mL de DMEM. Ensuite, ajoutez 1 mL de cette solution ECM préparée à chaque puits d’une plaque de six puits et incubez-la pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Préparez le support d’entretien hPSC conformément aux instructions du fabricant et préchassez-le à la température ambiante pendant 30 minutes.Versez un flacon cryogénique de CSEh à partir d’un réservoir d’azote liquide en l’incubant dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 secondes. Désinfectez-le soigneusement à l’aide d’un spray à 75% d’alcool et mettez-le dans une armoire de biosécurité. Transférer la suspension cellulaire du flacon dans un tube de 15 millimètres.Ensuite, ajoutez 5 mL de milieu d’entretien préchauffé goutte à goutte au tube à l’aide d’une pipette de 5 mL, tout en secouant doucement le tube pour mélanger les hPSC. Centrifugez le tube à 170 fois G pendant cinq minutes. Retirez soigneusement la majeure partie du surnageant à l’aide d’une pipette de 1 mL, en laissant derrière vous environ 50 microlitres de surnageant pour éviter de perdre les cellules.Re-suspendez la pastille avec 1 mL de support d’entretien en pipetant de haut en bas. Retirez l’ECM des puits pré-enduits et ajoutez 1,5 millilitre de milieu d’entretien à chaque puits. Répartissez ensuite 0,5 millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits.Secouez doucement la plaque pour répartir uniformément les hPSC. Mettez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant au moins 24 heures pour favoriser l’adhérence cellulaire. Changer de milieu tous les jours et passer les hPSC à 80% de confluence.Le jour 0, initiez la différenciation en retirant les cellules de confluence à 80% d’un puits de la plaque à six puits. Recueillir les cellules avec une solution de dissociation EDTA comme décrit dans le manuscrit textuel. Retirer la solution d’EDTA et ajouter 1 mL de milieu d’entretien contenant 10 fluvastatines micromolaires pour arrêter la dissociation cellulaire.Prélever les cellules avec une pipette de 1 mL. Transférer la suspension cellulaire dans une boîte de Petri ultra-basse de 100 millimètres et ajouter 9 mL de milieu d’entretien contenant 10 fluvastatines micromolaires à la boîte. Secouez doucement le plat deux fois pour répartir uniformément les cellules.Ensuite, mettez-le dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Une fois les cellules cultivées pendant au moins 24 heures, observez-les au microscope. Ajouter 9 mL de support d’entretien et 3 mL de NIM à un tube de 15 mL.Transférer les cultures cellulaires dans un tube centrifuge de 15 mL et ajouter 10 mL du mélange NIM préchauffé à la boîte. Centrifuger le tube à 60 fois G pendant 3 minutes pour recueillir les agrégats. Retirez ensuite le surnageant à l’aide d’une pipette de 5 mL, en laissant derrière lui environ 500 microlitres pour éviter de perdre des cellules.Ajouter 2 mL du mélange dans le tube et transférer la suspension dans la même boîte de Pétri. Secouez doucement le plat pour répartir uniformément les agrégats cellulaires. Ensuite, remettez le plat dans l’incubateur.Le jour 5, retirez l’ECM des plats pré-enrobés et ajoutez 10 mL de NIM préchauffé à chaque plat. Sortez le plat contenant des Ebs et vérifiez la qualité des EB au microscope, en vous assurant qu’ils sont brillants et ronds. Recueillir tous les EBs dans un tube de 15 mL et les laisser se déposer pendant 5 minutes.Ensuite, retirez la majeure partie du surnageant, en laissant derrière vous environ 2 mL de milieu. Après avoir compté les BOULE, ensemencez-les goutte à goutte à une densité d’environ 2-3 BOULEs par centimètre carré dans des plats enrobés contenant 10 mL de NIM. Secouez doucement les plats pour répartir uniformément les BOULE et mettez-les dans l’incubateur pendant au moins 24 heures.Utilisez une aiguille en tungstène ou une aiguille avec une seringue de 1 mL pour détacher mécaniquement les vésicules optiques morphologiquement identifiables, ainsi que l’épithélium pigmentaire rétinien adjacent aux jours 28 à 35. Culturez-les en suspension. Mettez 50 à 60 vésicules optiques dans chaque boîte de culture à faible fixation de 100 millimètres, contenant 15 mL de RDM pour la formation d’organoïdes rétiniens.Changez le support tous les 2 à 3 jours jusqu’au jour 42. Pour initier la différenciation rétinienne, les CSEh ont été dissociés en petites touffes et cultivés en suspension, qui ont formé des CE depuis le jour 1. Le jour 5, les ABE ont été plaquées sur les boîtes de culture revêtues d’ECM et les cellules ont progressivement migré hors des EBs.Le jour 16, le milieu d’induction a été remplacé par rdM, provoquant la formation des domaines neuronaux de la rétine et la saillie progressive de la boîte, ainsi que la formation de cellules de structures ressemblant à des vésicules optiques entourées de cellules RPE. Pendant les jours 28 à 35, organoïdes rétiniens constitués de la rétine neurale, attachés à une sphère RPE. D’un côté, des cellules se sont formées.Au fur et à mesure que la différenciation et la spécification de la rétine progressaient, les CSH produisaient des sous-types de rétine neurale qui s’alignaient progressivement en couches, imitant les caractéristiques architecturales d’une rétine humaine native. Les cellules ganglionnaires de la rétine ont d’abord été générées à partir de progéniteurs rétiniens et accumulées dans la face basale de la neuro-rétine. Avec ce protocole, les organoïdes rétiniens se sont développés en photorécepteurs très matures avec à la fois des bâtonnets et des cônes riches.Les cellules photoréceptrices étaient situées du côté apical, tandis que les cellules amacrines, les cellules horizontales, les cellules bipolaires et les cellules gliales muller étaient toutes situées dans la couche intermédiaire de la rétine neurale. Les points clés de ce protocole sont la création d’Ebs de haute qualité et leur ensemencement à la bonne densité.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

Une technique simplifiée pour<em&gt; In situ</emExcision&gt; de la cornée et éviscération du tissu rétinien de globe oculaire humain

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Recherche

Médecine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l&#39;homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l&#39;aide de deux méthodes différentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

L&#39;analyse transcriptomique de prélèvements rétine humaine en utilisant Journal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Enrichissement pour chimiorésistantes cancer de l&#39;ovaire des cellules souches à partir de lignées cellulaires humaines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Quantitative Fundus autofluorescence pour l&#39;évaluation des maladies rétiniennes

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Un modèle aigu rétinienne pour l&#39;évaluation sanguin rétinien barrière Breach et potentiels médicaments pour le traitement

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

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Forskoline induite par Gonflement dans Intestinal organites: Un<em&gt; In vitro</em&gt; Essai pour évaluer la réponse des médicaments dans les patients atteints de fibrose kystique

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

À l’aide de l’imagerie rétinienne pour étudier la démence

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction et analyse du stress oxydatif dans les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes transfectées par transposon de la belle endormie

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...