Name: retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Diese Studie wurde vom National Key R&D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), dem Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), dem Science & Technology Project der Provinz Guangdong (2017B020230003), der Natural Science Foundation (NSF) of China (81570874, 81970842), dem Hundred Talent Program der Sun Yat-sen University (PT1001010) und den Fundamental Research Funds des State Key Laboratory of Ophthalmology unterstützt.

1. Kultur und Ausbau von hPSCs
<ol><li>HPSC-Kultur
	<ol>
<li>Beschichten Sie zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit extrazellulärer Matrix (ECM, hESC-qualifizierte Matrix). Bereiten Sie 50 ml einer ECM-Lösung vor, die 8-12 μg/ml ECM in Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) enthält. In 49 ml DMEM 1 ml der aufgetauten ECM-Stammlösung (50x) hinzufügen. Fügen Sie 1 ml der ECM-Lösung zu jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte hinzu. Inkubieren Sie es für 1 h in einem Inkubator bei 37 °C und 5% ...

<ol>
	<li>Flaxman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+causes+of+blindness+and+distance+vision+impairment+1990-2020:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells:+From+clinical+trial+in+a+dish+to+precision+medicine.">Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine.</a> Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Brooks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+retinal+organoid+differentiation+by+modulating+signaling+pathways+revealed+by+comparative+transcriptome+analyses+with+development+in+vivo.">Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo.</a> Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).</li><li>Zerti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+simple+method+to+enhance+the+generation+of+cone+and+rod+photoreceptors+in+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids.">Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).</li><li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse,+monkey+and+human+embryonic+stem+cells.">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), (2018).</li><li>Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+photoreceptors+restores+some+visual+function+in+Crx-deficient+mice.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Therapy+for+Retinal+Diseases.">Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases.</a> Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+organoids:+a+window+into+human+retinal+development.">Retinal organoids: a window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), (2020).</li><li>Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+axis+specification+occur+in+parallel+during+optic+cup+and+optic+fissure+formation,+differentially+modulated+by+BMP+and+Wnt.">Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt.</a> Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).</li><li>Patel, A., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+pathways+in+optic+fissure+closure.">Genes and pathways in optic fissure closure.</a> Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).</li><li>Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+Ggap:+Mechanisms+of+epithelial+fusion+during+optic+fissure+closure.">Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+retinal+organoids+with+mature+rods+and+cones+from+urine-derived+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+RPE+spheroids+facilitates+enrichment+and+expansion+of+hiPSC-derived+RPE+generated+on+retinal+organoid+induction+platform.">Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+induced+pluripotent+stem+cells+and+retinal+organoids+from+a+leber's+congenital+amaurosis+patient+with+novel+RPE65+mutations.">Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).</li><li>Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+platform+for+personalized+and+precision+cardiovascular+medicine.">Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine.</a> Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3d+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li><li>Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+retinal+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).</li><li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue.">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communication. 6, 6286 (2015).</li><li>da Silva, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+expression+and+degradation+of+retinoic+acid+are+required+for+patterning+a+high-acuity+area+in+the+retina.">Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina.</a> Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).</li><li>Mitchell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+regulates+differential+expression+of+the+tandemly-duplicated+long+wavelength-sensitive+cone+opsin+genes+in+zebrafish.">Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).</li><li>Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+photoreceptor-generating+retinal+progenitors+revealed+by+prolonged+retinoic+acid+exposure.">Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure.</a> BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).</li><li>Eldred, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+specifies+cone+subtypes+in+human+retinal+organoids.">Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids.</a> Science. 362 (6411), (2018).</li><li>Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+in+retinal+development,+survival,+and+disease.">Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease.</a> Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).</li><li>Brzezinski, J. A., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+cell+fate+specification+in+vertebrates.">Photoreceptor cell fate specification in vertebrates.</a> Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+transcriptome+profiling,+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids.">Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li><li>Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+adhesion-dependent+cell+survival+and+ROCK-regulated+actomyosin-driven+forces+mediate+self-formation+of+a+retinal+organoid.">Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid.</a> Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).</li><li>Carcamo-Orive, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transcriptional+variability+in+a+large+human+ipsc+library+reveals+genetic+and+non-genetic+determinants+of+heterogeneity.">Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).</li><li>DeBoever, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+reveals+the+influence+of+genetic+variation+on+gene+expression+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).</li></ol>

In diesem mehrstufigen netztinalen Induktionsprotokoll wurden hPSCs Schritt für Schritt geführt, um das Retinalschicksal zu erlangen, und selbstorganisiert in retinale Organoide, die laminiertes NR und RPE enthalten. Während der Differenzierung rekapitulierten hPSCs alle wichtigen Schritte der menschlichen Netzhautentwicklung in vivo, von EF, OV und RPE bis zur netztinalen Laminierung, wobei alle Subtypen von Netzhautzellen, einschließlich retinaler Ganglienzellen, amakrinen Zellen, bipolaren Zellen, Stäbch...

Retinale degenerative Erkrankungen (RDs), wie altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und Retinitis pigmentosa (RP), sind durch die Dysfunktion und den Tod von Photorezeptorzellen gekennzeichnet und führen typischerweise zu irreversiblem Sehverlust ohne wirksame Heilungsmöglichkeiten1. Der Mechanismus, der diesen Krankheiten zugrunde liegt, ist weitgehend unbekannt, teilweise aufgrund fehlender menschlicher Krankheitsmodelle2. In den letzten Jahrzehnten wurden in der regenerativen Medizin durch die Stammzelltechnologie bedeutende Fortschritte erzielt. Viele Forscher, einschließlich uns, haben gezeigt, dass menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs), einschließlich menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) und humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSCs), sich durch verschiedene Differenzierungsansätze in alle Arten von Netzhautzellen, sogar in Mini-Netzhautgewebe, differenzieren können3,4,5,6,7,8,9,10, 11, bietet ein enormes Potenzial in der Krankheitsmodellierung und Zelltherapie12,13,14.
Der Induktionsprozess von hPSCs zu Netzhautzellen ist jedoch sehr kompliziert und zeitaufwendig mit geringer Wiederholbarkeit, was Forscher mit reicher Erfahrung und hohen Fähigkeiten erfordert. Während des komplexen und dynamischen Induktionsprozesses beeinflussen eine Reihe von Faktoren die Ausbeute an Netzhautgeweben15,16,17. Außerdem unterscheiden sich verschiedene Induktionsmethoden oft erheblich im Timing und in der robusten Expression von Netzhautmarkern, was die Probenentnahme und Dateninterpretation verwirren könnte3. Daher wäre ein einfaches Protokoll der netztinalen Differenzierung von hPSCs mit Schritt-für-Schritt-Anleitung gefragt.
Hier wird basierend auf unseren veröffentlichten Studien18,19,20,21, ein optimiertes retinales Induktionsprotokoll zur Erzeugung von Netzhautorganoiden (ROs) mit reichen Zapfenphotorezeptoren aus hPSCs beschrieben, die keine Ergänzung von Retinsäure (RA) erfordern. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Beschreibung der mehrstufigen Methode zur Erzeugung neuronaler Netzhaut und RPE. Die EB-Bildung ist der wesentliche Teil der frühen Induktionsphase. Sowohl Größe als auch Beschichtungsdichte von EBs sind quantitativ optimiert, was die Ausbeute von Netzhautgewebe wissenschaftlich erhöht und die Wiederholbarkeit fördert. Im zweiten Teil der Induktion organisieren sich optische Vesikel (OVs) in der Adhärenzkultur selbst und ROs bilden sich in der Suspensionskultur; Die Zeit- und Effizienzgewinne dieses Teils variieren in den verschiedenen hPSC-Linien erheblich. Die Reifung und Spezifizierung von Netzhautzellen in ROs erfolgt hauptsächlich im mittleren und späten Stadium der Induktion. Ohne die Zugabe von RA können reife Photorezeptoren mit sowohl reichen Zapfen als auch Stäbchen hergestellt werden.
Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, jeden Schritt quantitativ zu beschreiben und zu beschreiben, damit unerfahrene Forscher ihn wiederholen können. Verschiedene hPSC-Linien wurden durch dieses Protokoll erfolgreich in ROs induziert, mit einer robusten Ausbeute an kegelreichem Netzhautgewebe und hoher Wiederholbarkeit. HPSCs-abgeleitete ROs mit diesem Protokoll können die wichtigsten Schritte der Netzhautentwicklung in vivorekapitulieren und langfristig überleben, was nachgelagerte Anwendungen wie Krankheitsmodellierung, Arzneimittelscreening und Zelltherapie erleichtert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#8722;)-Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560-5mg</td>
			<td>ROCK-inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml tips</td>
			<td>Kirgen</td>
			<td>KG1313</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>3141001</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCD000100</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Tissue culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>313000</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells tissue culture plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AP2&#945; Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>3b5</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ISL1 Antibody</td>
			<td>Boster</td>
			<td>BM4446</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-L/M opsin Antibody</td>
			<td>gift from Dr. jeremy</td>
			<td>/</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>pax6</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Recoverin Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab5585</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rhodopsin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5417</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sheep 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21436</td>
			<td>Donkey anti-Sheep IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX9 Antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>A19710</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VSX2 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab9016</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement W/O VIT A (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube vial</td>
			<td>Thermo scientific-NUNC</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>D532</td>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole 
			dihydrochloride; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM /F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5 M PH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>NATOCOR</td>
			<td>SFBE</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>0.22&#956;m, sterile Millex filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td>2 mg/ml in PBS to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>MEM NEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEM CELL</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSCs maintenance medium (MM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer</td>
			<td>GNM</td>
			<td>GNM10010</td>
			<td>Without Ca+,Mg+,PH7.2&#177;0.1 0.1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3262-20EA</td>
			<td>Petri dish</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells

Degenerative Erkrankungen der Netzhaut sind die Hauptursachen für irreversible Erblindung ohne wirksame Behandlung. Pluripotente Stammzellen, die das Potenzial haben, sich in alle Arten von Netzhautzellen zu differenzieren, sogar in Mini-Netzhautgewebe, sind für Patienten mit diesen Krankheiten vielversprechend und bieten viele Möglichkeiten bei der Krankheitsmodellierung und dem Arzneimittelscreening. Der Induktionsprozess von hPSCs zu Netzhautzellen ist jedoch kompliziert und zeitaufwendig. Hier beschreiben wir ein optimiertes retinales Induktionsprotokoll zur Erzeugung von Netzhautgewebe mit hoher Reproduzierbarkeit und Effizienz, das für verschiedene humane pluripotente Stammzellen geeignet ist. Dieses Protokoll wird ohne Zusatz von Retinsäure durchgeführt, was der Anreicherung von Zapfenphotorezeptoren zugute kommt. Der Vorteil dieses Protokolls ist die Quantifizierung der EB-Größe und der Beschichtungsdichte, um die Effizienz und Wiederholbarkeit der Netzhautinduktion signifikant zu verbessern. Mit dieser Methode erscheinen alle wichtigen Netzhautzellen nacheinander und rekapitulieren die Hauptschritte der Netzhautentwicklung. Es wird nachgelagerte Anwendungen wie Krankheitsmodellierung und Zelltherapie erleichtern.

Der retinale Induktionsprozess in diesem Protokoll ahmt die Entwicklung der menschlichen fetalen Netzhaut nach. Um die netzhautale Differenzierung einzuleiten, wurden hPSCs in kleine Klumpen dissoziiert und in Suspension kultiviert, um die Bildung von EBs zu induzieren. Auf D1 bildeten sich die uniformierten Zellaggregate oder EBs (Abbildung 1C). Das Kulturmedium wurde schrittweise in NIM überführt. Auf D5 wurden EBs auf die ECM-beschichteten Kulturschalen auftätigt. Zellen wanderten allm...

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Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Hier beschreiben wir ein optimiertes retinale Organoid-Induktionssystem, das für verschiedene humane pluripotente Stammzelllinien geeignet ist, netzhautähnliche Gewebe mit hoher Reproduzierbarkeit und Effizienz zu erzeugen.

Retinale Organoid-Induktionssystem zur Ableitung von 3D-Netzhautgewebe aus humanen pluripotenten Stammzellen

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Der Induktionsprozess von hPSCs zu Netzhautzellen ist kompliziert und zeitaufwendig. Dieses optimierte Protokoll kann Netzhautgewebe mit hoher Reproduzierbarkeit und ohne Kosten erzeugen. Der Vorteil dieses Protokolls ist die Quantifizierung der EB-Größe und der Beschichtungsdichte, um die Effizienz und Wiederholbarkeit der Netzhautinduktion von hPSCs deutlich zu verbessern.Mit dieser Methode erscheinen alle wichtigen Netzhautzellen nacheinander und rekapitulieren die Hauptschritte der Netzhautentwicklung. Es wird die Krankheitsmodellierung und Zelltherapie bei degenerativen Erkrankungen der Netzhaut erleichtern. Bei der Demonstration des Verfahrens sind wir mit Yuanyuan Guan, einem Doktoranden, und Bingbing Xie, einem Techniker aus dem Labor, zusammen.Beginnen Sie mit der Vorbereitung von 50 ml ECM-Lösung, indem Sie 1 ml der dritten 50-fachen Stammlösung zu 50 ml DMEM hinzufügen. Dann fügen Sie 1 ml dieser vorbereiteten ECM-Lösung zu jeder Vertiefung einer Sechs-Well-Platte hinzu und inkubieren Sie sie für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Bereiten Sie das hPSC-Wartungsmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und wärmen Sie es für 30 Minuten auf Raumtemperatur vor.Gießen Sie eine kryogene Durchstechflasche mit hPSCs aus einem Flüssigstickstofftank, indem Sie sie 30 Sekunden lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubieren. Desinfizieren Sie es vorsichtig mit einem 75% Alkoholspray und legen Sie es in eine Biosicherheitswerkbank. Übertragen Sie die Zellsuspension aus der Durchstechflasche in eine 15-Millimeter-Tube.Dann fügen Sie 5 ml vorgewärmtes Wartungsmedium Tropfen für Tropfen mit einer 5-ml-Pipette in das Röhrchen hinzu, während Sie das Rohr vorsichtig schütteln, um die hPSCs zu mischen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 170 mal G für fünf Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den größten Teil des Überstands mit einer 1-ml-Pipette und lassen Sie etwa 50 Mikroliter Überstand zurück, um den Verlust der Zellen zu vermeiden.Suspendieren Sie das Pellet mit 1 ml Pflegemedium durch Pipettieren nach oben und unten. Entfernen Sie ECM aus den vorbeschichteten Vertiefungen und fügen Sie jeder Vertiefung 1,5 Milliliter Pflegemedium hinzu. Verteilen Sie dann 0,5 Milliliter Zellsuspension in jede Vertiefung.Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die hPSCs gleichmäßig zu verteilen. Legen Sie die Platte für mindestens 24 Stunden in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, um die Zelladhärenz zu fördern. Wechseln Sie jeden Tag das Medium und die hPSCs bei 80% Konfluenz.Initiieren Sie am Tag 0 die Differenzierung, indem Sie die 80% Konfluenzzellen aus einer Vertiefung der Sechs-Well-Platte entfernen. Sammeln Sie die Zellen mit EDTA-Dissoziationslösung, wie im Textmanuskript beschrieben. Entfernen Sie die EDTA-Lösung und fügen Sie 1 ml Erhaltungsmedium hinzu, das 10 mikromolare Fluvastatin enthält, um die Zelldissoziation zu stoppen.Sammeln Sie die Zellen mit einer 1 mL Pipette. Die Zellsuspension wird in eine 100 Millimeter ultratief angebrachte Petrischale überführen und 9 ml Erhaltungsmedium mit 10 mikromolarem Fluvastatin in die Schale geben. Schütteln Sie die Schüssel vorsichtig zweimal, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.Dann legen Sie es in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Nachdem die Zellen mindestens 24 Stunden kultiviert wurden, beobachten Sie sie unter dem Mikroskop. Fügen Sie 9 ml Wartungsmedium und 3 ml NIM in ein 15-ml-Rohr hinzu.Die Zellkulturen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben und 10 ml der vorgewärmten NIM-Mischung in die Schüssel geben. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 60 mal G für 3 Minuten, um die Aggregate zu sammeln. Entfernen Sie dann den Überstand mit einer 5-ml-Pipette und lassen Sie etwa 500 Mikroliter zurück, um den Verlust von Zellen zu vermeiden.2 ml der Mischung in das Röhrchen geben und die Suspension wieder in dieselbe Petrischale geben. Schütteln Sie die Schüssel vorsichtig, um die Zellaggregate gleichmäßig zu verteilen. Dann legen Sie die Schüssel wieder in den Inkubator.Entfernen Sie am 5. Tag ECM aus dem vorbeschichteten Geschirr und fügen Sie jedem Gericht 10 ml vorgewärmtes NIM hinzu. Nehmen Sie die Schüssel mit Ebs heraus und überprüfen Sie die Qualität der EBs unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie hell und rund sind. Sammeln Sie alle EBs in einem 15-ml-Röhrchen und lassen Sie sie 5 Minuten ruhen.Entfernen Sie dann den größten Teil des Überstands und lassen Sie etwa 2 ml Medium zurück. Nachdem Sie die EBs gezählt haben, säen Sie sie Tropfen für Tropfen mit einer Dichte von etwa 2-3 EBs pro Quadratzentimeter in beschichtete Schalen mit 10 ml NIM. Schütteln Sie das Geschirr vorsichtig, um die EBs gleichmäßig zu verteilen, und legen Sie sie für mindestens 24 Stunden in den Inkubator.Verwenden Sie eine Wolframnadel oder eine Nadel mit einer 1-ml-Spritze, um die morphologisch identifizierbaren optischen Vesikel zusammen mit dem angrenzenden retinalen Pigmentepithel an den Tagen 28 bis 35 mechanisch zu lösen. Kultur sie in Schwebe. Geben Sie 50-60 optische Vesikel in jede 100 Millimeter niedrige Befestigungskulturschale, die 15 ml RDM für die retinale Organoidbildung enthält.Wechseln Sie das Medium alle 2 bis 3 Tage bis Tag-42. Um die netzhautale Differenzierung einzuleiten, wurden hPSCs in kleine Klumpen dissoziiert und in Suspension kultiviert, die seit Tag 1 EBs bildeten. Am Tag 5 wurden EBs auf die ECM-beschichteten Kulturschalen plattiert und die Zellen wanderten allmählich aus den EBs aus.Am 16. Tag wurde das Induktionsmedium durch RDM ersetzt, wodurch sich die neuralen Netzhautdomänen bildeten und allmählich aus der Schüssel herausragten, sowie zellbildende optische Vesikel-ähnliche Strukturen, die von RPE-Zellen umgeben sind. Während der Tage-28 bis 35 retinale Organoide, bestehend aus der neuronalen Netzhaut, an einer RPE-Kugel befestigt. Auf einer Seite bildeten sich Zellen.Als die Netzhautdifferenzierung und -spezifikation voranschritt, produzierten hPSCs Subtypen der neuronalen Netzhaut, die sich allmählich in Schichten anlehnten und die architektonischen Merkmale einer einheimischen menschlichen Netzhaut nachahmten. Retinale Ganglienzellen wurden zuerst aus retinalen Vorläuferzellen erzeugt und in der basalen Seite der Neuro-Netzhaut akkumuliert. Mit diesem Protokoll entwickelten sich Netzhautorganoide zu hochreifen Photorezeptoren mit sowohl reichen Stäbchen als auch Zapfen.Photorezeptorzellen befanden sich auf der apikalen Seite, während sich amakrine Zellen, horizontale Zellen, bipolare Zellen und Müller-Gliazellen alle in der Zwischenschicht der neuronalen Netzhaut befanden. Die Wichtigsten dieses Protokolls sind die Schaffung einer hohen Qualität von Ebs und die Aussaat mit der richtigen Dichte.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

Ein vereinfachtes Verfahren für<em&gt; In-situ</em&gt; Exzision der Hornhaut und der Netzhaut Ausweiden von Gewebe aus menschlichen Augapfel

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Forschung

Medizin

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Transkriptom-Analyse der menschlichen Retina chirurgischen Proben mit Journal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Bereicherung für chemoresistenten Eierstockkrebs Stammzellen aus menschlichen Zelllinien

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Quantitative Fundus-Autofluoreszenz für die Beurteilung von Netzhauterkrankungen

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Eine akute Retinal Modell zur Bewertung von Blut Retinal Barrier Breach und potenzielle Medikamente für die Behandlung

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay für Fibrosis Patienten in Cystic Drug Response-Beurteilung

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

Retinale Bildgebung bei der Demenz zu studieren

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induktion und Analyse von oxidativem Stress in Dornröschen-Transposon-transfizierten menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...