Name: retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), קרן פרויקט המדע והטכנולוגיה של גואנגג'ואו (201803010078), פרויקט המדע והטכנולוגיה של מחוז גואנגדונג (2017B020230003), הקרן למדעי הטבע (NSF) של סין (81570874, 81970842), מאה כישרונות של אוניברסיטת סון יאט-סן (PT1001010), וקרנות המחקר הבסיסיות של מעבדת מפתח המדינה של רפואת עיניים.

1. תרבות והרחבה של hPSCs
<ol><li>תרבות HPSC
	<ol>
<li>יש מעיל שתי בארות של צלחת 6-טוב עם מטריצה חוץ תאית (ECM, מטריצה מוסמכת hESC). הכן 50 מ"ל של פתרון ECM המכיל 8-12 מיקרוגרם / מ"ל של ECM במדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM). ב 49 מ"ל של DMEM, להוסיף 1 מ"ל של פתרון מלאי ECM מופשר (50x). הוסף 1 מ"ל של פתרון ECM לכל באר של צלחת 6-טוב...

<ol>
	<li>Flaxman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+causes+of+blindness+and+distance+vision+impairment+1990-2020:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells:+From+clinical+trial+in+a+dish+to+precision+medicine.">Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine.</a> Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Brooks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+retinal+organoid+differentiation+by+modulating+signaling+pathways+revealed+by+comparative+transcriptome+analyses+with+development+in+vivo.">Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo.</a> Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).</li><li>Zerti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+simple+method+to+enhance+the+generation+of+cone+and+rod+photoreceptors+in+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids.">Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).</li><li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse,+monkey+and+human+embryonic+stem+cells.">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), (2018).</li><li>Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+photoreceptors+restores+some+visual+function+in+Crx-deficient+mice.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Therapy+for+Retinal+Diseases.">Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases.</a> Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+organoids:+a+window+into+human+retinal+development.">Retinal organoids: a window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), (2020).</li><li>Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+axis+specification+occur+in+parallel+during+optic+cup+and+optic+fissure+formation,+differentially+modulated+by+BMP+and+Wnt.">Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt.</a> Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).</li><li>Patel, A., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+pathways+in+optic+fissure+closure.">Genes and pathways in optic fissure closure.</a> Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).</li><li>Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+Ggap:+Mechanisms+of+epithelial+fusion+during+optic+fissure+closure.">Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+retinal+organoids+with+mature+rods+and+cones+from+urine-derived+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+RPE+spheroids+facilitates+enrichment+and+expansion+of+hiPSC-derived+RPE+generated+on+retinal+organoid+induction+platform.">Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+induced+pluripotent+stem+cells+and+retinal+organoids+from+a+leber's+congenital+amaurosis+patient+with+novel+RPE65+mutations.">Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).</li><li>Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+platform+for+personalized+and+precision+cardiovascular+medicine.">Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine.</a> Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3d+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li><li>Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+retinal+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).</li><li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue.">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communication. 6, 6286 (2015).</li><li>da Silva, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+expression+and+degradation+of+retinoic+acid+are+required+for+patterning+a+high-acuity+area+in+the+retina.">Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina.</a> Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).</li><li>Mitchell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+regulates+differential+expression+of+the+tandemly-duplicated+long+wavelength-sensitive+cone+opsin+genes+in+zebrafish.">Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).</li><li>Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+photoreceptor-generating+retinal+progenitors+revealed+by+prolonged+retinoic+acid+exposure.">Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure.</a> BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).</li><li>Eldred, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+specifies+cone+subtypes+in+human+retinal+organoids.">Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids.</a> Science. 362 (6411), (2018).</li><li>Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+in+retinal+development,+survival,+and+disease.">Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease.</a> Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).</li><li>Brzezinski, J. A., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+cell+fate+specification+in+vertebrates.">Photoreceptor cell fate specification in vertebrates.</a> Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+transcriptome+profiling,+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids.">Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li><li>Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+adhesion-dependent+cell+survival+and+ROCK-regulated+actomyosin-driven+forces+mediate+self-formation+of+a+retinal+organoid.">Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid.</a> Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).</li><li>Carcamo-Orive, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transcriptional+variability+in+a+large+human+ipsc+library+reveals+genetic+and+non-genetic+determinants+of+heterogeneity.">Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).</li><li>DeBoever, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+reveals+the+influence+of+genetic+variation+on+gene+expression+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).</li></ol>

בפרוטוקול אינדוקציה רב-שלבי רשתית זה, hPSCs הונחו צעד אחר צעד כדי להשיג את גורל הרשתית, וארגנו את עצמם לאורגנואידים ברשתית המכילים NR למינציה ו- RPE. במהלך ההבחנה, hPSCs recapitulated כל השלבים העיקריים של התפתחות הרשתית האנושית vivo, מ EF, OV, ו- RPE, כדי למינציה ברשתית, יצירת כל תת סוגים של תאים רשתית, כולל ...

מחלות ניווניות ברשתית (RDs), כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) ורטיניטיס פיגמנטוזה (RP), מאופיינות בתפקוד ובמותם של תאי פוטורצפטור ובדרך כלל מובילות לאובדן ראייה בלתי הפיך ללא דרכים יעילות לרפא1. המנגנון שבביסן מחלות אלה אינו ידוע במידה רבה חלקית בשל היעדר מודלים למחלות אנושיות2. בעשורים האחרונים הושגה התקדמות משמעותית ברפואה רגנרטיבית באמצעות טכנולוגיית תאי גזע. חוקרים רבים, כולל עצמנו, הראו כי תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים (hPSCs), כולל תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם (hiPSCs), יכולים להבדיל לכל סוגי תאי הרשתית, אפילו רקמות מיני-רשתית באמצעות גישות שונות של בידול3,4,5,6,7,8,9,10, 11,מתן פוטנציאל עצום בדוגמנות מחלות וטיפולבתאים 12,13,14.
עם זאת, תהליך האינדוקציה מ hPSCs לתאי רשתית הוא מסובך מאוד זמן רב עם יכולת חזרה נמוכה, אשר דורש חוקרים עם ניסיון עשיר וכישורים גבוהים. במהלך תהליך האינדוקציה המורכב והדינמי, מספר גורמים ישפיעו על התשואה של רקמות הרשתית15,16,17. כמו כן, שיטות אינדוקציה שונות משתנות לעתים קרובות במידה ניכרת בתזמון ובביטוי חזק של סמני רשתית, אשר עשוי לבלבל את איסוף המדגם ואת פרשנות הנתונים3. לכן, פרוטוקול פשוט של בידול רשתית מ hPSCs עם הדרכה צעד אחר צעד יהיה ביקוש.
כאן, בהתבסס על המחקרים שפורסמו שלנו18,19,20,21, פרוטוקול אינדוקציה רשתית ממוטבת כדי ליצור organoids רשתית (ROs) עם קולטני חרוט עשירים מן hPSCs מתואר, אשר אינו דורש תוספת של חומצה רטינואית (RA). פרוטוקול זה מתמקד בתיאור השיטה הרב-שלבים ליצירת רשתית עצבית ו- RPE. היווצרות EB היא החלק החיוני של שלב האינדוקציה המוקדמת. הן גודל וצפיפות ציפוי של EBs הם אופטימיזציה כמותית, אשר מדעית משפר את התשואה של רקמות רשתית ומקדם חזרה. בחלק השני של האינדוקציה, שלטי אופטיים (OVs) מתארגנים את עצמם בתרבות הדבקות ובצורת ROs בתרבות ההשעיה; קורסי הזמן והיעילות של חלק זה משתנים במידה ניכרת בשורות hPSC שונות. ההבשלה והמפרט של תאי הרשתית ב- ROs מתרחשים בעיקר בשלב האמצעי והמאוחר של האינדוקציה. ללא תוספת של RA, קולטני פוטו בוגרים עם קונוסים ומוטות עשירים יכולים להיות מיוצרים.
מטרת פרוטוקול זה היא לתאר ולפרט כמותית כל שלב שחוקרים חסרי ניסיון יחזרו על עצמם. קווי hPSC שונים הושרו בהצלחה לתוך ROs על ידי פרוטוקול זה עם תשואה חזקה של רקמות רשתית עשירות חרוט ויכולת חזרה גבוהה. ROs שמקורם ב- HPSCs עם פרוטוקול זה יכולים לשחזר את השלבים העיקריים של התפתחות הרשתית ב- vivo, ולשרוד לטווח ארוך, המאפשר יישומים במורד הזרם, כגון מידול מחלות, הקרנת תרופות וטיפול בתאים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#8722;)-Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560-5mg</td>
			<td>ROCK-inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml tips</td>
			<td>Kirgen</td>
			<td>KG1313</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>3141001</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCD000100</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Tissue culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>313000</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells tissue culture plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AP2&#945; Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>3b5</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ISL1 Antibody</td>
			<td>Boster</td>
			<td>BM4446</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-L/M opsin Antibody</td>
			<td>gift from Dr. jeremy</td>
			<td>/</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>pax6</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Recoverin Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab5585</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rhodopsin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5417</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sheep 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21436</td>
			<td>Donkey anti-Sheep IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX9 Antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>A19710</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VSX2 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab9016</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement W/O VIT A (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube vial</td>
			<td>Thermo scientific-NUNC</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>D532</td>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole 
			dihydrochloride; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM /F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5 M PH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>NATOCOR</td>
			<td>SFBE</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>0.22&#956;m, sterile Millex filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td>2 mg/ml in PBS to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>MEM NEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEM CELL</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSCs maintenance medium (MM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer</td>
			<td>GNM</td>
			<td>GNM10010</td>
			<td>Without Ca+,Mg+,PH7.2&#177;0.1 0.1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3262-20EA</td>
			<td>Petri dish</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells

מחלות ניווניות ברשתית הן הגורמים העיקריים לעיוורון בלתי הפיך ללא טיפול יעיל. תאי גזע פלוריפוטנטים בעלי פוטנציאל להבדיל לכל סוגי תאי הרשתית, אפילו רקמות מיני-רשתית, מחזיקים בהבטחות עצומות לחולים במחלות אלה ובהזדמנויות רבות במודל מחלות ובהקרנת תרופות. עם זאת, תהליך האינדוקציה מ hPSCs לתאי רשתית הוא מסובך וגוזל זמן רב. כאן, אנו מתארים פרוטוקול אינדוקציה רשתית ממוטב כדי ליצור רקמות רשתית עם רבייה ויעילות גבוהה, מתאים לתאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים שונים. פרוטוקול זה מבוצע ללא תוספת של חומצה רטינואית, אשר מועיל העשרה של קולטני חרוט. היתרון של פרוטוקול זה הוא כימות גודל EB וצפיפות ציפוי כדי לשפר באופן משמעותי את היעילות ואת יכולת החזרה של אינדוקציה רשתית. בשיטה זו, כל תאי הרשתית העיקריים מופיעים ברצף ומשיבים מחדש את השלבים העיקריים של התפתחות הרשתית. זה יקל על יישומים במורד הזרם, כגון מידול מחלות וטיפול בתאים.

תהליך האינדוקציה ברשתית בפרוטוקול זה מחקה את התפתחות הרשתית העוברית האנושית. כדי ליזום את בידול הרשתית, hPSCs היו מנותקים לגושים קטנים ותרבות בהשעיה כדי לגרום להיווצרות של EBs. ב- D1 נוצרו צבירה של תאים במדים או EBs (איור 1C). מדיום התרבות הועבר בהדרגה ל- NIM. ב- D5, EBs היו מצופים על מנות ...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

כאן אנו מתארים מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית ממוטבת, אשר מתאימה קווי תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים שונים כדי ליצור רקמות רשתית עם רבייה ויעילות גבוהה.

מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית להפקה של רקמות רשתית תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

תהליך האינדוקציה מ hPSCs לתאי רשתית הוא מסובך וגוזל זמן רב. פרוטוקול ממוטב זה יכול ליצור רקמות רשתית עם רבייה גבוהה וללא עלות. היתרון של פרוטוקול זה הוא כימות גודל EB וצפיפות ציפוי כדי לשפר באופן משמעותי את היעילות ואת יכולת החזרה של אינדוקציה רשתית מ hPSCs.בשיטה זו, כל תאי הרשתית העיקריים מופיעים ברצף ומשיבים מחדש את השלבים העיקריים של התפתחות הרשתית. זה יקל על מידול מחלות וטיפול בתאים למחלות ניווניות ברשתית. כדי להדגים את ההליך, אנחנו עם יואן גואן, דוקטורנט, ובינגבינג שי, טכנאי מהמעבדה.התחל על ידי הכנת פתרון ECM של 50 מ"ל על ידי הוספת 1 מ"ל של פתרון המלאי השלישי 50 פעמים ל- 50 מ"ל של DMEM. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של פתרון ECM מוכן זה לכל באר של צלחת שש באר ולדגירה אותו במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. הכן בינוני תחזוקה hPSC על פי הוראת היצרן מראש לחום החדר במשך 30 דקות.יוצקים מחמתן קריוגני של hPSCs ממיכל חנקן נוזלי על ידי דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות. בזהירות לחטא אותו באמצעות תרסיס אלכוהול 75% ולשים אותו בארון ביו בטיחות. העבר את ההשעיה התאית מהבילול לצינור 15 מ"מ.לאחר מכן, להוסיף 5 מ"ל של תחזוקה בינונית תחזוקה מראש טיפה אחר טיפה לצינור באמצעות פיפטה 5 מ"ל, תוך ניעור בעדינות את הצינור כדי לערבב את hPSCs. צנטריפוגה הצינור ב 170 פעמים G במשך חמש דקות. הסר בזהירות את רוב supernatant באמצעות pipette 1 מ"ל, משאיר מאחור כ 50 microliters של supernatant כדי למנוע לאבד את התאים.להשעות מחדש את הכדור עם 1 מ"ל של אמצעי תחזוקה על ידי צנרת למעלה ולמטה. הסר ECM מהבארות מצופות מראש ולהוסיף 1.5 מיליליטר של תחזוקה בינונית לכל באר. לאחר מכן להפיץ 0.5 מיליליטר של השעיית תא לתוך כל באר.יש לנער בעדינות את הצלחת כדי להפיץ את hPSCs באופן אחיד. שים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני לפחות 24 שעות כדי לקדם דבקות בתא. החלף מדיום כל יום ומעבר hPSCs ב 80% מפגש.ביום-0, ליזום את ההבחנה על ידי הסרת 80% תאי מפגש מבאר אחת של צלחת שש באר. אסוף את התאים באמצעות פתרון דיסוציאציה של EDTA כמתואר בכתב היד של הטקסט. הסר את פתרון EDTA ולהוסיף 1 מ"ל של אמצעי תחזוקה המכיל 10 fluvastatin מיקרומולר כדי לעצור את פירוק התא.לאסוף את התאים עם פיפטה 1 מ"ל. העבר את מתלה התא לצלחת פטרי צמודה אולטרה נמוכה 100 מ"מ והוסף 9 מ"ל של אמצעי תחזוקה המכיל 10 פלווסטטין מיקרומולר לצלחת. מנערים בעדינות את המנה פעמיים כדי להפיץ את התאים באופן אחיד.לאחר מכן, שים אותו באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר התאים הם תרבית לפחות 24 שעות, להתבונן בהם תחת המיקרוסקופ. הוסף 9 מ"ל של תחזוקה בינונית ו 3 מ"ל של NIM לצינור 15 מ"ל.מעבירים את תרביות התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל ומוסיפים 10 מ"ל מתערובת ה-NIM החמה מראש למנה. צנטריפוגות הצינור ב 60 פעמים G במשך 3 דקות כדי לאסוף את האגרגטים. לאחר מכן להסיר את supernatant באמצעות פיפטה 5 מ"ל, משאיר מאחור כ 500 microliters כדי למנוע אובדן תאים.מוסיפים 2 מ"ל מהתערובת לצינור ומעבירים את המתלים בחזרה לאותה צלחת פטרי. מנערים בעדינות את המנה כדי לפזר באופן אחיד את אגרגרגלי התא. לאחר מכן, החזירו את המנה לאינקובטור.ביום-5, יש להסיר את ECM מהמנות המצולפות מראש ולהוסיף 10 מ"ל תותחם מראש לכל מנה. מוציאים את המנה המכילה Ebs ובודקים את איכות ה- EBs מתחת למיקרוסקופ, ומוודאים שהם בהירים ועגולים. לאסוף את כל EBs בצינור 15 מ"ל ולאפשר להם להסתפק 5 דקות.לאחר מכן, להסיר את רוב supernatant, משאיר מאחור על 2 מ"ל של בינוני. לאחר ספירת ה- EBs, זרעו אותם טיפה אחר טיפה בצפיפות של כ 2-3 EBs לסנטימטר מרובע לתוך כלים מצופים המכילים 10 מ"ל של NIM. מנערים בעדינות את הכלים כדי להפיץ את ה- EBs באופן אחיד ומכניסים אותם לאינקובטור למשך 24 שעות לפחות.השתמש מחט טונגסטן או מחט עם מזרק 1 מ"ל לנתק מכנית את שלטי הראייה לזיהוי מורפולוגי, יחד עם אפיתל פיגמנט הרשתית הסמוך בימים 28 עד 35. תרבות אותם בהשעיה. שים 50-60 שלשולים אופטיים לתוך כל 100 מילימטר צלחת תרבות התקשרות נמוכה 100 מ"מ, המכיל 15 מ"ל של RDM להיווצרות אורגנויד רשתית.משנים את המדיום כל 2 עד 3 ימים עד יום-42. כדי ליזום את בידול הרשתית, hPSCs היו מנותקים לגושים קטנים ותרבות בהשעיה, אשר נוצר EBs מאז יום-1. ביום-5 EBs היו מצופים על מנות התרבות מצופות ECM והתאים היגרו בהדרגה מתוך EBs.ביום-16, מדיום האינדוקציה הוחלף על ידי RDM, מה שגרם לתחומי הרשתית העצבית להיווצר ולבלט בהדרגה מהמנה, כמו גם, תאים היוצרים מבנים דמויי ארסיה אופטית מוקפים בתאי RPE. במהלך ימים-28 עד 35, organoids רשתית המורכבת הרשתית העצבית, מחובר לכדור RPE. בצד אחד נוצרו תאים.ככל שהתקדמו הבידול והמפרט ברשתית, hPSCs הפיקו תת-סוגים של רשתית עצבית שהתיישרו בהדרגה בשכבות, ומחקו את המאפיינים האדריכליים של רשתית אנושית מקומית. תאי גנגליון רשתית נוצרו לראשונה מאבות רשתית והצטברו בצד הבסיסי של הרשתית העצבית. עם פרוטוקול זה, אורגנוידים רשתית התפתחו קולטני אור בוגרים מאוד עם שניהם, מוטות עשירים קונוסים.תאי פוטורצפטור היו ממוקמים בצד האפיקלי, בעוד שתאי אמקרין, תאים אופקיים, תאים דו קוטביים ותאי גליה מולר היו כולם ממוקמים בשכבת הביניים של הרשתית העצבית. נקודות המפתח של פרוטוקול זה הן יצירת איכות גבוהה של Ebs וזריעת אותם בצפיפות הנכונה.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

טכניקה פשוטה עבור<em&gt; באתרו</em&gt; כריתת של הקרנית ואת הוצאת הקרביים של רקמת רשתית מ גלוב Ocular האדם

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

ניתוח של דגימות כירורגית transcriptomic רשתית אדם שימוש Journal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

העשרה לתאי גזע Chemoresistant סרטן השחלות משורות תאים אנושיות

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

כמותי הפונדוס autofluorescence עבור הערכת מחלות רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

במודל רשתית חריפה להערכת תרופות הפרת מכשול רשתית דם פוטנציאל הטיפול

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay עבור הערכת תגובה לתרופה בחולי סיסטיק פיברוזיס

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

באמצעות הדמיה ברשתית ללמוד דמנציה

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

אינדוקציה וניתוח של עקה חמצונית ב היפהפייה הנרדמת טרנספוסון-transposon-transfected תאי אפיתל פיגמנט רשתית אנושית

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...