Name: retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

この研究は、中国の国家キーR&Dプログラム(2016YFC1101103、 2017YFA0104101)、広州科学技術プロジェクト基金(201803010078)、広東省科学技術プロジェクト(2017B020230003)、中国自然科学財団(81570874、81970842)、孫文大学(PT1001010)の100人の人材プログラム、および主要研究所の基礎研究基金

1. hPSCの文化と拡大
<ol><li>HPSC 文化
	<ol>
<li>細胞外マトリックス(ECM、hESC修飾マトリックス)で6ウェルプレートの2つのウェルをコーティングします。Dulbeccoの修正イーグル培地(DMEM)に8-12 μg/mLのECMを含むECM溶液50 mLを調製します。DMEMの49 mLに、解凍したECMストック溶液(50x)を1 mL加えます。6ウェルプレートの各ウェルにECM溶液1mLを加えます。37°Cおよび5%CO2でインキュベーターに1時間?...

<ol>
	<li>Flaxman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+causes+of+blindness+and+distance+vision+impairment+1990-2020:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells:+From+clinical+trial+in+a+dish+to+precision+medicine.">Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine.</a> Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Brooks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+retinal+organoid+differentiation+by+modulating+signaling+pathways+revealed+by+comparative+transcriptome+analyses+with+development+in+vivo.">Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo.</a> Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).</li><li>Zerti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+simple+method+to+enhance+the+generation+of+cone+and+rod+photoreceptors+in+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids.">Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).</li><li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse,+monkey+and+human+embryonic+stem+cells.">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), (2018).</li><li>Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+photoreceptors+restores+some+visual+function+in+Crx-deficient+mice.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Therapy+for+Retinal+Diseases.">Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases.</a> Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+organoids:+a+window+into+human+retinal+development.">Retinal organoids: a window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), (2020).</li><li>Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+axis+specification+occur+in+parallel+during+optic+cup+and+optic+fissure+formation,+differentially+modulated+by+BMP+and+Wnt.">Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt.</a> Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).</li><li>Patel, A., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+pathways+in+optic+fissure+closure.">Genes and pathways in optic fissure closure.</a> Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).</li><li>Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+Ggap:+Mechanisms+of+epithelial+fusion+during+optic+fissure+closure.">Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+retinal+organoids+with+mature+rods+and+cones+from+urine-derived+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+RPE+spheroids+facilitates+enrichment+and+expansion+of+hiPSC-derived+RPE+generated+on+retinal+organoid+induction+platform.">Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+induced+pluripotent+stem+cells+and+retinal+organoids+from+a+leber's+congenital+amaurosis+patient+with+novel+RPE65+mutations.">Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).</li><li>Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+platform+for+personalized+and+precision+cardiovascular+medicine.">Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine.</a> Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3d+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li><li>Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+retinal+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).</li><li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue.">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communication. 6, 6286 (2015).</li><li>da Silva, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+expression+and+degradation+of+retinoic+acid+are+required+for+patterning+a+high-acuity+area+in+the+retina.">Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina.</a> Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).</li><li>Mitchell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+regulates+differential+expression+of+the+tandemly-duplicated+long+wavelength-sensitive+cone+opsin+genes+in+zebrafish.">Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).</li><li>Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+photoreceptor-generating+retinal+progenitors+revealed+by+prolonged+retinoic+acid+exposure.">Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure.</a> BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).</li><li>Eldred, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+specifies+cone+subtypes+in+human+retinal+organoids.">Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids.</a> Science. 362 (6411), (2018).</li><li>Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+in+retinal+development,+survival,+and+disease.">Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease.</a> Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).</li><li>Brzezinski, J. A., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+cell+fate+specification+in+vertebrates.">Photoreceptor cell fate specification in vertebrates.</a> Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+transcriptome+profiling,+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids.">Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li><li>Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+adhesion-dependent+cell+survival+and+ROCK-regulated+actomyosin-driven+forces+mediate+self-formation+of+a+retinal+organoid.">Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid.</a> Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).</li><li>Carcamo-Orive, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transcriptional+variability+in+a+large+human+ipsc+library+reveals+genetic+and+non-genetic+determinants+of+heterogeneity.">Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).</li><li>DeBoever, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+reveals+the+influence+of+genetic+variation+on+gene+expression+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).</li></ol>

この多段階のレチナル誘導プロトコルでは、hPSCを、レチナル運命を得るためにステップバイステップで導かれ、かつ、積層NRおよびRPEを含むレチナルオルガノイドに自己組織化した。分化の間、hPSCは、EF、OV、RPEから、レチナルラミネート、レチナル細胞、アマクライン細胞、双極細胞、ロッド、円錐光受容体、および円膜のグリア細胞および時間的空間細胞および時間的空間細胞における?...

網膜変性疾患(RD)は、加齢黄斑変性症(AMD)および網膜色素変性症(RP)などの、光受容体細胞の機能不全および死を特徴とし、典型的には、効果的な治療法なしに不可逆的な視力喪失を導く1。これらの疾患の根底にあるメカニズムは、ヒト疾患モデル2の不足のために部分的にはほとんど知られていない。過去数十年にわたり、幹細胞技術を通じて再生医療において大きな進歩が遂げられています。私たち自身を含む多くの研究者は、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)を含むヒト多能性幹細胞(hPSC)が、様々な分化アプローチ3、4、5、7、8、9、10を介してあらゆるタイプのレチナル細胞に分化できることを示している。11、疾患のモデリングと細胞療法12、13、14に大きな可能性を提供する。
しかし、hPSCからレチナル細胞への誘導プロセスは非常に複雑で時間がかかり、再現性が低いため、経験豊富で高いスキルを持つ研究者が必要です。複雑で動的な誘導プロセスの間、多くの要因が、15、16、17の組織の収率に影響を与えます。また、異なる誘導方法は、しばしば、サンプル収集とデータ解釈を混乱させる可能性のある、レチンマーカーのタイミングと堅牢な発現でかなり異なる。したがって、ステップバイステップのガイダンスを持つhPSCからのレチナル分化の簡単なプロトコルが必要になります。
ここでは、18,19,20,21の研究に基づき、hPSCから豊富な円錐型感光体を有するレチナルオガノイド(R)を生成するための最適化されたレチナル誘導プロトコルが記載されており、レチノイン酸(RA)のサプリメントを必要としない。このプロトコルは、神経のレティナとRPEを生成するマルチステップ法の記述に焦点を当てています。EB形成は、早期誘導段階の必須部分です。EBsのサイズとめっき密度の両方が定量的に最適化され、これは科学的に、レチン組織の収量を高め、反復性を促進します。誘導の第2部では、光学小胞(OV)は、懸濁液培養におけるアドヒアランス培養およびROV形態において自己組織化する。この部分のタイムコースと効率は、異なるhPSCラインで大きく異なります。Rの細胞の成熟と指定は、主に誘導の中間段階と後期段階で起こります。RAを添加することなく、豊かなコーンとロッドの両方を持つ成熟した感光体を作り出すことができます。
このプロトコルの目的は、経験の浅い研究者が繰り返すために各ステップを定量的に記述し、詳細に記述することです。さまざまなhPSCラインは、このプロトコルにより、錐が豊富なレチナル組織の堅牢な収率と高い再現性を持つROsにうまく誘導されています。このプロトコルを用いたHPSCs由来のROsは 、生体内でのレチナル開発の主なステップを再現し、疾患モデリング、薬物スクリーニング、細胞治療などの下流のアプリケーションを容易にする長期的な生存を可能にします。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#8722;)-Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560-5mg</td>
			<td>ROCK-inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml tips</td>
			<td>Kirgen</td>
			<td>KG1313</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>3141001</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCD000100</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Tissue culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>313000</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells tissue culture plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AP2&#945; Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>3b5</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ISL1 Antibody</td>
			<td>Boster</td>
			<td>BM4446</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-L/M opsin Antibody</td>
			<td>gift from Dr. jeremy</td>
			<td>/</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>pax6</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Recoverin Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab5585</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rhodopsin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5417</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sheep 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21436</td>
			<td>Donkey anti-Sheep IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX9 Antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>A19710</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VSX2 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab9016</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement W/O VIT A (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube vial</td>
			<td>Thermo scientific-NUNC</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>D532</td>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole 
			dihydrochloride; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM /F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5 M PH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>NATOCOR</td>
			<td>SFBE</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>0.22&#956;m, sterile Millex filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td>2 mg/ml in PBS to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>MEM NEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEM CELL</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSCs maintenance medium (MM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer</td>
			<td>GNM</td>
			<td>GNM10010</td>
			<td>Without Ca+,Mg+,PH7.2&#177;0.1 0.1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3262-20EA</td>
			<td>Petri dish</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells

レチンバル性疾患は、効果的な治療を伴わない不可逆的失明の主な原因である。多能性幹細胞は、あらゆるタイプのレチナル細胞(ミニレチナル組織)に分化する可能性を秘めており、これらの疾患を有する患者に対して大きな約束をし、疾患モデリングや薬物スクリーニングにおいて多くの機会を得ています。しかし、hPSCからレチナル細胞への誘導プロセスは複雑で時間がかかります。ここでは、多様なヒト多能性幹細胞に適した、高い再現性と効率を持つレチナル組織を生成するための最適化されたレチナル誘導プロトコルについて述べます。このプロトコルは、レチノイン酸を添加することなく実行され、これは錐体の光受容体の濃縮に利益をもたらします。このプロトコルの利点は、レチン誘導の効率と再現性を大幅に向上させるEBサイズとめっき密度の定量化です。この方法では、すべての主要なレチン細胞が順次現れ、レチンの主な段階を再現します。疾患のモデル化や細胞治療などの下流のアプリケーションを容易にします。

このプロトコルのレチナル誘導プロセスは、ヒト胎児の胎児の発育を模倣する。レチナリの分化を開始するために、hPSCを小さな塊に解き分け、懸濁液中で培養して、EBの形成を誘導した。D1では、均一な細胞凝集体またはEBが形成される(図1C)。培養培地は徐々にNIMに移行した。D5では、ECMコーティングされた文化料理にEBをメッキしました。細胞は徐々にエブから移行し?...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

ここでは、ヒトの多能性幹細胞株が再現性と効率の高い人工組織を生成するのに適した最適化されたレチナルオルガノイド誘導システムについて説明します。

ヒト多能性幹細胞からの3Dレチナル組織の導出のためのレチナルオガノイド誘導システム

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

hPSCからレチナル細胞への誘導プロセスは複雑で時間がかかります。この最適化されたプロトコルは、高い再現性と無コストで、レチナル組織を生成することができます。このプロトコルの利点は、hPSCからのレチナル誘導の効率と再現性を大幅に高めるために、EBサイズとめっき密度を定量化することです。この方法では、すべての主要なレチン細胞が順次現れ、レチンの主な段階を再現します。それは、疾患のモデリングと、疾患の変性疾患の細胞治療を促進します。この手順をデモンストレーションすると、博士課程の学生である元元光と、研究室の技術者であるビンビン・シーと一緒です。DMEMの50 mLに3番目の50回のストック溶液の1 mLを加えることによって、50 mLのECM溶液を調製することから始めます。次に、6ウェルプレートのウェルにこの調製ECM溶液の1mLを加え、摂氏37度と5%の二酸化炭素で1時間インキュベートします。hPSCメンテナンス媒体は、メーカーの指示に従って準備し、室温まで30分間プリウォームします。液体窒素タンクからhPSCの極低温バイアルを30秒間摂氏37度の水浴でインキュベートして注ぎます。75%のアルコールスプレーを使用して慎重に消毒し、バイオセーフティキャビネットに入れます。バイアルから15ミリメートルのチューブにセルサスペンションを移します。その後、5 mL ピペットを使用して、5 mL の予温メンテナンスメディアを滴下してチューブに加え、チューブを軽く振ってhPSCをブレンドします。チューブを170回Gで5分間遠心する。慎重に細胞を失うことを避けるために上清の約50マイクロリットルを残して、1 mLピペットを使用して上清のほとんどを除去します。ペレットを1 mLの維持媒体で再懸濁し、上下にピペット処理します。事前にコーティングされたウェルからECMを取り出し、各井戸に1.5ミリリットルのメンテナンス媒体を加えます。その後、各ウェルに細胞懸濁液の0.5ミリリットルを配布します。プレートを軽く振ってhPSCを均一に分配します。プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、少なくとも24時間は5%の二酸化炭素を入れて細胞の付着を促進します。毎日培地を交換し、通過hPSCを80%合流で変更します。Day-0では、6ウェルプレートの1つのウェルから80%合流細胞を除去して分化を開始します。テキスト原稿に記載されているように、EDTA解離解液を有する細胞を収集する。EDTA溶液を取り出し、10マイクロモルフルバスタチンを含む維持培地1mLを加えて細胞解離を停止します。1 mL ピペットで細胞を収集します。セル懸濁液を100ミリメートル超低いペトリ皿に移し、10マイクロモルフルバスタチンを含むメンテナンス培地の9mLを皿に加えます。皿を2回軽く振って細胞を均一に分配します。その後、37°Cと5%の二酸化炭素でインキュベーターに入れます。細胞を少なくとも24時間培養した後、顕微鏡下でそれらを観察する。15 mLチューブに9mLのメンテナンス媒体と3mLのNIMを加えます。細胞培養物を15 mL遠心チューブに移し、あらかじめ温めたNIM混合物を10mL加えます。凝集体を集めるために3分間Gの60倍でチューブを遠心分離する。その後、5 mL ピペットを使用して上清を除去し、約 500 マイクロリットルを残して細胞を失うことを避けます。チューブに2mLの混合物を加え、サスペンションを同じペトリ皿に戻します。皿を軽く振って、細胞の凝集体を均一に分配します。その後、皿をインキュベーターに戻します。5日目には、あらかじめコーティングされた料理からECMを取り出し、各料理に10 mLの事前温めたNIMを追加します。Ebsを含む料理を取り出し、顕微鏡の下でEBの品質を確認し、明るく丸いかどうかを確認します。15 mLチューブにすべてのEBを収集し、5分間の決済を許可します。次に、上清の大部分を取り出し、約2mLの培地を残した。EBを数えた後、10 mLのNIMを含むコーティングされた皿に1平方センチメートルあたり約2〜3 EBの密度でドロップバイドロップします。皿を軽く振ってEJBを均一に分配し、少なくとも24時間保育器に入れます。タングステン針または1mLシリンジ付きの針を使用して、28日から35日目に隣接する網膜色素上皮と共に、形態学的に識別可能な眼小胞を機械的に取り外します。サスペンションでそれらを培養します。レチナルオルガノイド形成のためのRDMの15 mLを含む各100ミリメートル低い取り付け培養皿に50-60の光学小胞を入れてください。日-42まで2〜3日ごとに媒体を変更します。レチナル分化を開始するために、hPSCは小さな塊に解き分け、懸濁液中で培養され、1日目からEBを形成した。5日目にECMコーティングされた培養皿にメッキされ、細胞は徐々にEBから移行した。16日目、誘導培地をRDMに置き換え、神経失調ドメインを形成し、徐々に皿から突き出て、またRPE細胞に囲まれた光学的小胞様構造を形成する細胞を引き起こした。日-28〜35の間に、神経性レチナからなるレチナルオノイドは、RPE球に結合した。片側に、細胞が形成される。また、ヒトのネイティブな人のレティナの建築的特徴を模倣して、徐々に層に並ぶ神経性の亜型を作り出した。レチナルガングリオン細胞は、まず、神経性前駆細胞から生成され、神経性の腎の基底側に蓄積された。このプロトコルにより、レチナルオルガノイドは、豊かなロッドとコーンの両方を備えた高度に成熟した感光体に発展しました。感光体細胞は、アマセリン細胞、水平細胞、双極細胞およびミュラーグリア細胞の間に位置し、全ては神経のレチナの中間層に位置していた。このプロトコルの重要なポイントは、Ebsの高品質を作成し、適切な密度でそれらをシードすることです。

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

の簡略化手法<em&gt;その場</em人間の眼球から角膜と網膜組織の空洞化の&gt;切除

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

ジャーナルを用いたヒト網膜手術標本のトランスクリプトーム解析

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

ヒト細胞株から化学療法抵抗性の卵巣がん幹細胞の濃縮

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

網膜疾患の評価のための定量的眼底自己蛍光

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

治療のために血液網膜関門の違反と潜在的な薬を評価するための急性網膜モデル

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

フォルスコリン誘発性腸オルガノイドに腫れ：<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ嚢胞性線維症患者における薬物反応を評価するための

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

眼底イメージングを使用して認知症を研究するには

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

睡眠美容トランスポゾントランスポゾントランスフェクトヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導と分析

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...