Name: retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Denne studien ble støttet av National Key R&D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), Science &technology Project of Guangdong Province (2017B020230003), Natural Science Foundation (NSF) i Kina (81570874, 81970842), Hundred talent program of Sun Yat-sen University (PT1001010), og fundamentale forskningsmidler av State Key Laboratory of Ophthalmology.

1. Kultur og utvidelse av hPSCer
<ol><li>HPSC-kultur
	<ol>
<li>Belegge to brønner av en 6-brønns plate med ekstracellulær matrise (ECM, hESC-kvalifisert matrise). Forbered 50 ml ECM-oppløsning som inneholder 8-12 μg/ml ECM i Dulbeccos modifiserte ørns medium (DMEM). I 49 ml DMEM tilsettes 1 ml av den opptinte ECM-lagerløsningen (50x). Tilsett 1 ml ECM-oppløsning i hver brønn på en 6-brønns plate. Inkuber den i 1 time i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.</li>
		<li>Klargjør hPSC ...

<ol>
	<li>Flaxman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+causes+of+blindness+and+distance+vision+impairment+1990-2020:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells:+From+clinical+trial+in+a+dish+to+precision+medicine.">Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine.</a> Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Brooks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+retinal+organoid+differentiation+by+modulating+signaling+pathways+revealed+by+comparative+transcriptome+analyses+with+development+in+vivo.">Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo.</a> Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).</li><li>Zerti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+simple+method+to+enhance+the+generation+of+cone+and+rod+photoreceptors+in+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids.">Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).</li><li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse,+monkey+and+human+embryonic+stem+cells.">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), (2018).</li><li>Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+photoreceptors+restores+some+visual+function+in+Crx-deficient+mice.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Therapy+for+Retinal+Diseases.">Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases.</a> Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+organoids:+a+window+into+human+retinal+development.">Retinal organoids: a window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), (2020).</li><li>Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+axis+specification+occur+in+parallel+during+optic+cup+and+optic+fissure+formation,+differentially+modulated+by+BMP+and+Wnt.">Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt.</a> Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).</li><li>Patel, A., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+pathways+in+optic+fissure+closure.">Genes and pathways in optic fissure closure.</a> Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).</li><li>Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+Ggap:+Mechanisms+of+epithelial+fusion+during+optic+fissure+closure.">Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+retinal+organoids+with+mature+rods+and+cones+from+urine-derived+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+RPE+spheroids+facilitates+enrichment+and+expansion+of+hiPSC-derived+RPE+generated+on+retinal+organoid+induction+platform.">Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+induced+pluripotent+stem+cells+and+retinal+organoids+from+a+leber's+congenital+amaurosis+patient+with+novel+RPE65+mutations.">Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).</li><li>Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+platform+for+personalized+and+precision+cardiovascular+medicine.">Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine.</a> Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3d+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li><li>Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+retinal+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).</li><li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue.">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communication. 6, 6286 (2015).</li><li>da Silva, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+expression+and+degradation+of+retinoic+acid+are+required+for+patterning+a+high-acuity+area+in+the+retina.">Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina.</a> Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).</li><li>Mitchell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+regulates+differential+expression+of+the+tandemly-duplicated+long+wavelength-sensitive+cone+opsin+genes+in+zebrafish.">Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).</li><li>Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+photoreceptor-generating+retinal+progenitors+revealed+by+prolonged+retinoic+acid+exposure.">Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure.</a> BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).</li><li>Eldred, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+specifies+cone+subtypes+in+human+retinal+organoids.">Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids.</a> Science. 362 (6411), (2018).</li><li>Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+in+retinal+development,+survival,+and+disease.">Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease.</a> Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).</li><li>Brzezinski, J. A., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+cell+fate+specification+in+vertebrates.">Photoreceptor cell fate specification in vertebrates.</a> Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+transcriptome+profiling,+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids.">Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li><li>Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+adhesion-dependent+cell+survival+and+ROCK-regulated+actomyosin-driven+forces+mediate+self-formation+of+a+retinal+organoid.">Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid.</a> Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).</li><li>Carcamo-Orive, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transcriptional+variability+in+a+large+human+ipsc+library+reveals+genetic+and+non-genetic+determinants+of+heterogeneity.">Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).</li><li>DeBoever, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+reveals+the+influence+of+genetic+variation+on+gene+expression+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).</li></ol>

I denne flertrinns retinal induksjonsprotokollen ble hPSC-er veiledet trinn for trinn for å få retinal skjebne, og selvorganisert i retinal organoider som inneholder laminert NR og RPE. Under differensiering, hPSC recapitulated alle viktige trinn i menneskelig retinal utvikling i vivo, fra EF, OV, og RPE, til retinal laminering, generere alle undertyper av retinal celler, inkludert retinal ganglion celler, amacrine celler, bipolare celler, stang, og kjegle fotoreseptorer, og muller glial celler i en romlig og ...

Retinal degenerative sykdommer (RDs), som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) og retinitis pigmentosa (RP), er preget av dysfunksjon og død av fotoreseptorceller og fører vanligvis til irreversibel synstap uten effektive måter å kurere1. Mekanismen som ligger til grunn for disse sykdommene er i stor grad ukjent delvis på grunn av mangel på menneskelige sykdomsmodeller2. I løpet av de siste tiårene har det blitt oppnådd betydelige fremskritt innen regenerativ medisin gjennom stamcelleteknologi. Mange forskere, inkludert oss selv, har vist at humane pluripotente stamceller (hPSCer), inkludert humane embryonale stamceller (hESCer) og menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCer), kan skille seg ut i alle typer netthinneceller, til og med mini-netthinnevev gjennom ulike differensieringsmetoder3,4,5,6,7,8,9,10, 11, gir stort potensial i sykdomsmodellering og celleterapi12,13,14.
Induksjonsprosessen fra hPSCer til netthinneceller er imidlertid svært komplisert og tidkrevende med lav repeterbarhet, noe som krever forskere med rik erfaring og høye ferdigheter. Under den komplekse og dynamiske induksjonsprosessen vil en rekke faktorer påvirke utbyttet av netthinnevev15,16,17. Også ulike induksjonsmetoder varierer ofte betydelig i timing og robust uttrykk for netthinnemarkører, noe som kan forvirre utvalgsinnsamlingen og datatolkningen3. Derfor vil en enkel protokoll for retinal differensiering fra hPSCer med trinnvis veiledning være etterspurt.
Her, basert på våre publiserte studier18,19,20,21, beskrives en optimalisert retinal induksjonsprotokoll for å generere retinal organoider (ROer) med rike kjeglefotoreseptorer fra hPSCer, noe som ikke krever tilskudd av retinoinsyre (RA). Denne protokollen fokuserer på beskrivelsen av flertrinnsmetoden for å generere nevral netthinne og RPE. EB-dannelse er den essensielle delen av det tidlige induksjonsstadiet. Både størrelse og plating tetthet av EBs er kvantitativt optimalisert, noe som vitenskapelig forbedrer utbyttet av retinal vev og fremmer repeterbarhet. I den andre delen av induksjonen organiserer optiske vesikler (OVs) seg selv i overholdelseskulturen og ROene i suspensjonskulturen; Tidskursene og effektiviteten til denne delen varierer betydelig i forskjellige hPSC-linjer. Modning og spesifikasjon av retinalceller i ROer forekommer hovedsakelig i midten og sen fase av induksjon. Uten tilsetning av RA kan modne fotoreseptorer med både rike kjegler og stenger produseres.
Formålet med denne protokollen er å kvantitativt beskrive og detaljere hvert trinn for uerfarne forskere å gjenta. Ulike hPSC linjer har blitt vellykket indusert i ROs av denne protokollen med et robust utbytte av kjeglerik retinal vev og høy repeterbarhet. HPSCs-avledede ROer med denne protokollen kan rekapitulere hovedtrinnene for retinal utvikling i vivo, og overleve langsiktige, noe som letter nedstrøms applikasjoner, for eksempel sykdomsmodellering, legemiddelscreening og celleterapi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#8722;)-Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560-5mg</td>
			<td>ROCK-inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml tips</td>
			<td>Kirgen</td>
			<td>KG1313</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>3141001</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCD000100</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Tissue culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>313000</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells tissue culture plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AP2&#945; Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>3b5</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ISL1 Antibody</td>
			<td>Boster</td>
			<td>BM4446</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-L/M opsin Antibody</td>
			<td>gift from Dr. jeremy</td>
			<td>/</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>pax6</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Recoverin Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab5585</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rhodopsin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5417</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sheep 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21436</td>
			<td>Donkey anti-Sheep IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX9 Antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>A19710</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VSX2 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab9016</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement W/O VIT A (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube vial</td>
			<td>Thermo scientific-NUNC</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>D532</td>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole 
			dihydrochloride; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM /F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5 M PH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>NATOCOR</td>
			<td>SFBE</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>0.22&#956;m, sterile Millex filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td>2 mg/ml in PBS to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>MEM NEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEM CELL</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSCs maintenance medium (MM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer</td>
			<td>GNM</td>
			<td>GNM10010</td>
			<td>Without Ca+,Mg+,PH7.2&#177;0.1 0.1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3262-20EA</td>
			<td>Petri dish</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells

Retinal degenerative sykdommer er hovedårsakene til irreversibel blindhet uten effektiv behandling. Pluripotente stamceller som har potensial til å skille seg ut i alle typer netthinneceller, til og med mini-retinal vev, holder store løfter for pasienter med disse sykdommene og mange muligheter innen sykdomsmodellering og legemiddelscreening. Induksjonsprosessen fra hPSCer til netthinneceller er imidlertid komplisert og tidkrevende. Her beskriver vi en optimalisert retinal induksjonsprotokoll for å generere retinal vev med høy reproduserbarhet og effektivitet, egnet for ulike menneskelige pluripotente stamceller. Denne protokollen utføres uten tilsetning av retinoinsyre, noe som fordeler berikelsen av kegle fotoreseptorer. Fordelen med denne protokollen er kvantifisering av EB-størrelse og platingtetthet for å forbedre effektiviteten og repeterbarheten av retinal induksjon betydelig. Med denne metoden vises alle store retinale celler sekvensielt og rekapitulerer hovedtrinnene i retinal utvikling. Det vil lette nedstrømsapplikasjoner, for eksempel sykdomsmodellering og celleterapi.

Den retinal induksjonsprosessen i denne protokollen etterligner utviklingen av menneskelig foster netthinne. For å initiere retinal differensiering ble hPSC-er dissosiert i små klumper og dyrket i suspensjon for å indusere dannelsen av EBs. På D1 ble de uniformerte cellemengdene eller EB-ene dannet (Figur 1C). Kulturmediet ble gradvis omdannet til NIM. På D5 ble EBs belagt på ECM-belagte kulturretter. Celler migrerte gradvis ut av EB-ene (figur 1D). Fra D1...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Her beskriver vi et optimalisert retinal organoid induksjonssystem, som er egnet for ulike menneskelige pluripotente stamcellelinjer for å generere netthinnevev med høy reproduserbarhet og effektivitet.

Retinal organoid induksjonssystem for avledning av 3D retinal vev fra humane pluripotente stamceller

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Induksjonsprosessen fra hPSCer til netthinneceller er komplisert og tidkrevende. Denne optimaliserte protokollen kan generere retinal vev med høy reproduserbarhet og ingen kostnad. Fordelen med denne protokollen er kvantifisering av EB-størrelse og platingtetthet for å forbedre effektiviteten og repeterbarheten av retinal induksjon fra hPSCer betydelig.Med denne metoden vises alle store retinale celler sekvensielt og rekapitulerer hovedtrinnene i retinal utvikling. Det vil lette sykdomsmodellering og celleterapi for retinal degenerative sykdommer. Vi demonstrerer prosedyren, og vi er sammen med Yuanyuan Guan, en ph.d.-student og Bingbing Xie, en tekniker fra laboratoriet.Begynn med å forberede 50 ml ECM-løsning ved å tilsette 1 ml av den tredje 50 ganger lagerløsningen til 50 ml DMEM. Tilsett deretter 1 ml av denne tilberedte ECM-løsningen til hver brønn av en seksbrønnsplate og inkuber den i en time ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Forbered hPSC vedlikeholdsmedium i henhold til produsentens instruksjon og forvarm det til romtemperatur i 30 minutter.Hell et kryogent hetteglass med hPSCer fra en flytende nitrogentank ved å inkubere den i et vannbad ved 37 grader Celsius i 30 sekunder. Desinfiser den forsiktig ved hjelp av en 75% alkoholspray og legg den i et biosikkerhetsskap. Overfør celleopphenget fra hetteglasset til et 15 millimeter rør.Tilsett deretter 5 ml forvarmet vedlikehold medium drop-by-drop til røret ved hjelp av en 5 ml pipette, mens du forsiktig rister røret for å blande hPSCene. Sentrifuger røret ved 170 ganger G i fem minutter. Fjern forsiktig det meste av supernatanten ved hjelp av en 1 ml pipette, og la det være ca. 50 mikroliter supernatant for å unngå å miste cellene.Re-suspendere pellets med 1 ml vedlikeholdsmedium ved å pipettere opp og ned. Fjern ECM fra de forhåndsbelagte brønnene og tilsett 1,5 milliliter vedlikeholdsmedium til hver brønn. Fordel deretter 0,5 milliliter cellefjæring i hver brønn.Rist platen forsiktig for å fordele hPSCene jevnt. Sett platen i en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i minst 24 timer for å fremme celletilslutning. Bytt medium hver dag og passasje hPSCs ved 80% samløp.På dag 0 starter du differensieringen ved å fjerne 80% sammenløpscellene fra en brønn av seksbrønnsplaten. Samle cellene med EDTA dissosiasjonsløsning som beskrevet i tekstmanuskriptet. Fjern EDTA-oppløsningen og tilsett 1 ml vedlikeholdsmedium som inneholder 10 mikromolar fluvastatin for å stoppe celledissosiasjon.Samle cellene med en 1 ml pipette. Overfør cellefjæringen til en 100 millimeter ultra-lav festet Petri-tallerken og tilsett 9 ml vedlikeholdsmedium som inneholder 10 mikromolar fluvastatin til parabolen. Rist forsiktig parabolen to ganger for å fordele cellene jevnt.Legg den deretter i inkubatoren ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Etter at cellene er dyrket i minst 24 timer, observere dem under mikroskopet. Tilsett 9 ml vedlikeholdsmedium og 3 ml NIM i et 15 ml rør.Overfør cellekulturene til et 15 ml sentrifugerør og tilsett 10 ml av den forvarmede NIM-blandingen til parabolen. Sentrifuger røret ved 60 ganger G i 3 minutter for å samle aggregatene. Fjern deretter supernatanten ved hjelp av en 5 ml pipette, og la det være ca. 500 mikroliter for å unngå å miste celler.Tilsett 2 ml av blandingen til røret og overfør suspensjonen tilbake til samme Petri-tallerken. Rist forsiktig parabolen for å fordele celleaggregatene jevnt. Legg deretter parabolen tilbake i inkubatoren.På dag 5 fjerner du ECM fra de forhåndsbelagte rettene og tilsett 10 ml forvarmet NIM til hver tallerken. Ta ut parabolen som inneholder Ebs og kontroller kvaliteten på EBs under mikroskopet, og sørg for at de er lyse og runde. Samle alle EBs i et 15 ml rør og la dem bosette seg i 5 minutter.Fjern deretter det meste av supernatanten, og etterlater ca 2 ml medium. Etter å ha talt EBs, frø dem drop-by-drop med en tetthet på ca 2-3 EBs per kvadratcentimeter i belagte retter som inneholder 10 ml NIM. Rist forsiktig oppvasken for å fordele EB-ene jevnt og legg dem i inkubatoren i minst 24 timer.Bruk en wolfram nål eller en nål med en 1 ml sprøyte for å mekanisk løsne de morfologisk identifiserbare optiske vesiklene, sammen med tilstøtende retinal pigment epitel på dag 28 til 35. Kultur dem i suspensjon. Sett 50-60 optiske vesicles i hver 100 millimeter lav festekulturrett, som inneholder 15 ml RDM for retinal organoiddannelse.Endre mediet hver 2 til 3 dager til dag-42. For å initiere retinal differensiering ble hPSC-er dissosiert til små klumper og dyrket i suspensjon, som dannet EBs siden dag-1. På dag-5 eBs ble belagt på ECM-belagte kulturretter og cellene gradvis migrert ut av EBs.På dag 16 ble induksjonsmediet erstattet av RDM, noe som fikk nevrale netthinnedomener til å danne og gradvis stikke ut fra parabolen, samt celledannende optiske vesicle-lignende strukturer omgitt av RPE-celler. I løpet av dager-28 til 35, retinal organoider bestående av nevral netthinnen, festet til en RPE sfære. På den ene siden dannet celler.Etter hvert som retinal differensiering og spesifikasjon utviklet seg, produserte hPSC-er undertyper av nevral netthinne som gradvis stilte seg opp i lag, etterligner de arkitektoniske egenskapene til en innfødt menneskelig netthinne. Retinal ganglion celler ble først generert fra retinal forfedre og akkumulert i basal side av nevro netthinnen. Med denne protokollen utviklet retinal organoider seg til svært modne fotoreseptorer med begge, rike stenger og kjegler.Fotoreseptorceller var plassert i den apikale siden, mens amacrine celler, horisontale celler, bipolare celler og muller glialceller alle var plassert i mellomlaget av nevral netthinnen. De viktigste punktene i denne protokollen er å skape høy kvalitet på Ebs og så dem med riktig tetthet.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

En forenklet Teknikk for<em&gt; In situ</em&gt; Eksisjon av hornhinnen og Evisceration av Retinal vev fra Human Ocular Globe

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolasjon, karakterisering og Comparative Differensiering av Human tannpulpa stamceller hentet fra permanente tenner ved hjelp av to ulike metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Kirurgiske Prøver Bruke Journal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Berikelse for kjemoresistent eggstokkreft stamceller fra humane cellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studerer Bukspyttkjertelkreft Stem Cell Kjennetegn for å utvikle nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Kvantitativ Fundus autofluorescence for Evaluering av retinal sykdommer

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

En akutt retinal modell for evaluering Blood Netthinne Barrier på brudd og mulige narkotika for behandling

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-indusert Hevelse i tarmen Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Analyse for å vurdere Drug Response i pasienter med cystisk fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

Bruk av Retinal Imaging demens

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induksjon og analyse av oksidativt stress i sovende skjønnhet transposon-transfekterte humane retinal pigment epitelceller

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...