Name: retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Это исследование было поддержано Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), Фондом научно-технического проекта Гуанчжоу (201803010078), Научно-техническим проектом провинции Гуандун (2017B020230003), Фондом естественных наук (NSF) Китая (81570874, 81970842), программой талантов Сотни Университета Сунь Ятсена (PT1001010) и Фондами фундаментальных исследований Государственной ключевой лаборатории офтальмологии.

1. Культура и расширение хПСК
<ol><li>Культура HPSC
	<ol>
<li>Покрытие двух скважин 6-скважинной пластины внеклеточным матриксом (ECM, hESC-qualified matrix). Приготовьте 50 мл раствора ECM, содержащего 8-12 мкг/мл ECM в модифицированной среде Орла Дульбекко (DMEM). В 49 мл DMEM добавьте 1 мл размороженный раство...

<ol>
	<li>Flaxman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+causes+of+blindness+and+distance+vision+impairment+1990-2020:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells:+From+clinical+trial+in+a+dish+to+precision+medicine.">Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine.</a> Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Brooks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+retinal+organoid+differentiation+by+modulating+signaling+pathways+revealed+by+comparative+transcriptome+analyses+with+development+in+vivo.">Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo.</a> Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).</li><li>Zerti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+simple+method+to+enhance+the+generation+of+cone+and+rod+photoreceptors+in+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids.">Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).</li><li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse,+monkey+and+human+embryonic+stem+cells.">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), (2018).</li><li>Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+photoreceptors+restores+some+visual+function+in+Crx-deficient+mice.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Therapy+for+Retinal+Diseases.">Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases.</a> Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+organoids:+a+window+into+human+retinal+development.">Retinal organoids: a window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), (2020).</li><li>Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+axis+specification+occur+in+parallel+during+optic+cup+and+optic+fissure+formation,+differentially+modulated+by+BMP+and+Wnt.">Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt.</a> Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).</li><li>Patel, A., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+pathways+in+optic+fissure+closure.">Genes and pathways in optic fissure closure.</a> Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).</li><li>Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+Ggap:+Mechanisms+of+epithelial+fusion+during+optic+fissure+closure.">Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+retinal+organoids+with+mature+rods+and+cones+from+urine-derived+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+RPE+spheroids+facilitates+enrichment+and+expansion+of+hiPSC-derived+RPE+generated+on+retinal+organoid+induction+platform.">Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+induced+pluripotent+stem+cells+and+retinal+organoids+from+a+leber's+congenital+amaurosis+patient+with+novel+RPE65+mutations.">Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).</li><li>Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+platform+for+personalized+and+precision+cardiovascular+medicine.">Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine.</a> Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3d+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li><li>Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+retinal+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).</li><li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue.">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communication. 6, 6286 (2015).</li><li>da Silva, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+expression+and+degradation+of+retinoic+acid+are+required+for+patterning+a+high-acuity+area+in+the+retina.">Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina.</a> Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).</li><li>Mitchell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+regulates+differential+expression+of+the+tandemly-duplicated+long+wavelength-sensitive+cone+opsin+genes+in+zebrafish.">Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).</li><li>Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+photoreceptor-generating+retinal+progenitors+revealed+by+prolonged+retinoic+acid+exposure.">Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure.</a> BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).</li><li>Eldred, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+specifies+cone+subtypes+in+human+retinal+organoids.">Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids.</a> Science. 362 (6411), (2018).</li><li>Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+in+retinal+development,+survival,+and+disease.">Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease.</a> Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).</li><li>Brzezinski, J. A., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+cell+fate+specification+in+vertebrates.">Photoreceptor cell fate specification in vertebrates.</a> Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+transcriptome+profiling,+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids.">Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li><li>Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+adhesion-dependent+cell+survival+and+ROCK-regulated+actomyosin-driven+forces+mediate+self-formation+of+a+retinal+organoid.">Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid.</a> Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).</li><li>Carcamo-Orive, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transcriptional+variability+in+a+large+human+ipsc+library+reveals+genetic+and+non-genetic+determinants+of+heterogeneity.">Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).</li><li>DeBoever, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+reveals+the+influence+of+genetic+variation+on+gene+expression+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).</li></ol>

В этом многоступенчатом протоколе индукции сетчатки hPSCs руководствовались шаг за шагом, чтобы получить судьбу сетчатки, и самоорганизовывались в органоиды сетчатки, содержащие ламинированные NR и RPE. Во время дифференцировки hPSCs рекапитулировали все основные этапы развития сетчатки че...

Дегенеративные заболевания сетчатки (РД), такие как возрастная макулярная дегенерация (ВМД) и пигментный ретинит (РП), характеризуются дисфункцией и гибелью фоторецепторных клеток и обычно приводят к необратимой потере зрения без эффективных способовлечения 1. Механизм, лежащий в основе этих заболеваний, в значительной степени неизвестен частично из-за отсутствия моделей заболеваний человека2. За последние десятилетия были достигнуты значительные успехи в регенеративной медицине с помощью технологии стволовых клеток. Многие исследователи, включая нас самих, показали, что плюрипотентные стволовые клетки человека (hPSCs), включая эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs), могут дифференцироваться во все типы клеток сетчатки, даже мини-ткани сетчатки с помощью различных подходов дифференцировки3,4,5,6,7,8,9,10, 11, обеспечивая огромный потенциал в моделировании заболеваний и клеточной терапии12,13,14.
Однако процесс индукции от hPSCs к клеткам сетчатки очень сложен и трудоемкий с низкой повторяемостью, что требует исследователей с богатым опытом и высокой квалификацией. В ходе сложного и динамического процесса индукции на выход тканей сетчатки будет влиять ряд факторов15,16,17. Кроме того, различные методы индукции часто значительно различаются по срокам и надежной экспрессии маркеров сетчатки, что может сбить с толку сбор образцов и интерпретацию данных3. Поэтому будет востребован простой протокол дифференциации сетчатки от гПСК с пошаговым руководством.
Здесь на основе наших опубликованных исследований18,19,20,21описан оптимизированный протокол индукции сетчатки для генерации органоидов сетчатки (РО) с богатыми конусными фоторецепторами из гПСК, который не требует добавки ретиноевой кислоты (РА). Этот протокол фокусируется на описании многоступенчатого метода генерации нейронной сетчатки и RPE. Образование ЭБ является неотъемлемой частью ранней индукционной стадии. Как размер, так и плотность покрытия ЭБ количественно оптимизированы, что научно повышает выход тканей сетчатки и способствует повторяемости. Во второй части индукции зрительные везикулы (ОВ) самоорганизуются в культуре адгезии и образуютСЯ РО в культуре суспензии; временные курсы и эффективность этой части значительно варьируются в разных линиях hPSC. Созревание и спецификация клеток сетчатки в РО в основном происходят на средней и поздней стадии индукции. Без добавления РА могут быть получены зрелые фоторецепторы как с богатыми колбочками, так и с палочками.
Цель этого протокола состоит в том, чтобы количественно описать и детализировать каждый шаг для неопытных исследователей. Различные линии hPSC были успешно индуцированы в РО этим протоколом с надежным выходом богатых конусами тканей сетчатки и высокой повторяемостью. РО, полученные из ГПСК с этим протоколом, могут резюмировать основные этапы развития сетчатки in vivoи выживать в долгосрочной перспективе, что облегчает последующие приложения, такие как моделирование заболеваний, скрининг лекарств и клеточная терапия.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#8722;)-Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560-5mg</td>
			<td>ROCK-inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml tips</td>
			<td>Kirgen</td>
			<td>KG1313</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>3141001</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCD000100</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Tissue culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>313000</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells tissue culture plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AP2&#945; Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>3b5</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ISL1 Antibody</td>
			<td>Boster</td>
			<td>BM4446</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-L/M opsin Antibody</td>
			<td>gift from Dr. jeremy</td>
			<td>/</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>pax6</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Recoverin Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab5585</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rhodopsin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5417</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sheep 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21436</td>
			<td>Donkey anti-Sheep IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX9 Antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>A19710</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VSX2 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab9016</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement W/O VIT A (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube vial</td>
			<td>Thermo scientific-NUNC</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>D532</td>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole 
			dihydrochloride; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM /F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5 M PH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>NATOCOR</td>
			<td>SFBE</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>0.22&#956;m, sterile Millex filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td>2 mg/ml in PBS to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>MEM NEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEM CELL</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSCs maintenance medium (MM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer</td>
			<td>GNM</td>
			<td>GNM10010</td>
			<td>Without Ca+,Mg+,PH7.2&#177;0.1 0.1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3262-20EA</td>
			<td>Petri dish</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells

Дегенеративные заболевания сетчатки являются основными причинами необратимой слепоты без эффективного лечения. Плюрипотентные стволовые клетки, которые могут дифференцироваться во все типы клеток сетчатки, даже мини-ткани сетчатки, имеют огромные перспективы для пациентов с этими заболеваниями и многие возможности в моделировании заболеваний и скрининге лекарств. Однако процесс индукции от hPSCs к клеткам сетчатки сложен и занимает много времени. Здесь мы описываем оптимизированный протокол индукции сетчатки для генерации тканей сетчатки с высокой воспроизводимостью и эффективностью, подходящих для различных плюрипотентных стволовых клеток человека. Этот протокол выполняется без добавления ретиноевой кислоты, которая способствует обогащению колбоковых фоторецепторов. Преимуществом этого протокола является количественная оценка размера EB и плотности покрытия для значительного повышения эффективности и повторяемости индукции сетчатки. При этом методе все основные клетки сетчатки последовательно появляются и повторяют основные этапы развития сетчатки. Это облегчит последующие приложения, такие как моделирование заболеваний и клеточная терапия.

Процесс индукции сетчатки в этом протоколе имитирует развитие сетчатки плода человека. Чтобы инициировать дифференцировку сетчатки, hPSC были диссоциированы на небольшие сгустки и культивированы в суспензии, чтобы вызвать образование EBs. На D1 образуются однородные ячейки агрегатов или...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Здесь мы описываем оптимизированную систему индукции органоидов сетчатки, которая подходит для различных линий плюрипотентных стволовых клеток человека для генерации тканей сетчатки с высокой воспроизводимостью и эффективностью.

Индукционная система органоидов сетчатки для получения 3D-тканей сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Процесс индукции от hPSCs к клеткам сетчатки сложен и отнимает много времени. Этот оптимизированный протокол может генерировать ткани сетчатки с высокой воспроизводимостью и без затрат. Преимуществом этого протокола является количественная оценка размера EB и плотности покрытия для значительного повышения эффективности и повторяемости индукции сетчатки от hPSCs.При этом методе все основные клетки сетчатки последовательно появляются и повторяют основные этапы развития сетчатки. Это облегчит моделирование заболеваний и клеточную терапию дегенеративных заболеваний сетчатки. Демонстрируя процедуру, мы с Yuanyuan Guan, аспирантом, и Bingbing Xie, техником из лаборатории.Начните с приготовления 50 мл раствора ECM, добавив 1 мл третьего 50-кратного запасного раствора к 50 мл DMEM. Затем добавьте 1 мл этого приготовленного раствора ECM в каждую скважину шестилунной пластины и инкубируют его в течение одного часа при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе. Подготовьте поддерживающую среду hPSC в соответствии с инструкцией производителя и предварительно прогрейте ее до комнатной температуры в течение 30 минут.Налейте криогенный флакон с гПСК из резервуара с жидким азотом, инкубируя его на водяной бане при 37 градусах Цельсия в течение 30 секунд. Тщательно продезинфицируйте его, используя 75% спиртовой спрей и поместите его в шкаф биобезопасности. Перенесите клеточную суспензию из флакона в 15-миллиметровую трубку.Затем добавьте 5 мл предварительно нагретой поддерживающей среды капля за каплей в трубку с помощью пипетки 5 мл, осторожно встряхивая трубку, чтобы смешать гПСК. Центрифугировать трубку в 170 раз G в течение пяти минут. Осторожно удалите большую часть супернатанта, используя пипетку 1 мл, оставив после себя около 50 микролитров супернатанта, чтобы избежать потери клеток.Повторно приостановить гранулу с 1 мл поддерживающей среды путем пипетки вверх и вниз. Удалите ECM из предварительно покрытых колодцев и добавьте 1,5 миллилитра поддерживающей среды в каждую скважину. Затем распределите по 0,5 миллилитра клеточной суспензии в каждую лунку.Аккуратно встряхните пластину, чтобы равномерно распределить гПСК. Поместите пластину в инкубатор при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение не менее 24 часов, чтобы способствовать приверженности клеток. Меняйте среду каждый день и проходите гПСК при 80% слиянии.На 0-й день инициируйте дифференцировку, удаляя 80%-ные клетки слияния из одной скважины шестилуночной пластины. Соберите клетки с раствором диссоциации ЭДТА, как описано в текстовой рукописи. Удалите раствор ЭДТА и добавьте 1 мл поддерживающей среды, содержащей 10 микромолялярного флувастатина, чтобы остановить диссоциацию клеток.Соберите клетки с помощью пипетки 1 мл. Переложите клеточную суспензию на 100-миллиметровую сверхнизкую прикрепленную чашку Петри и добавьте в чашку 9 мл поддерживающей среды, содержащей 10 микромолялярных флувастатина. Аккуратно встряхните блюдо дважды, чтобы равномерно распределить клетки.Затем поместите его в инкубатор при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. После того, как клетки культивируются в течение не менее 24 часов, наблюдайте за ними под микроскопом. Добавьте 9 мл поддерживающей среды и 3 мл NIM в трубку 15 мл.Переложите клеточные культуры в центрифужную трубку 15 мл и добавьте в чашку 10 мл предварительно разогретой смеси NIM. Центрифугируйте трубку в 60 раз G в течение 3 минут, чтобы собрать агрегаты. Затем удалите супернатант с помощью пипетки 5 мл, оставив после себя примерно 500 микролитров, чтобы избежать потери клеток.Добавьте 2 мл смеси в пробирку и переложите суспензию обратно в ту же чашку Петри. Аккуратно встряхните блюдо, чтобы равномерно распределить клеточные агрегаты. Затем поставьте блюдо обратно в инкубатор.На 5-й день удалите ECM из предварительно покрытой посуды и добавьте 10 мл предварительно разогретого NIM к каждому блюду. Доньте блюдо, содержащее Ebs, и проверьте качество ЭБ под микроскопом, убедившись, что они яркие и круглые. Соберите все ЭБ в пробирку 15 мл и дайте им отжиться в течение 5 минут.Затем удалите большую часть супернатанта, оставив после себя около 2 мл среды. После подсчета ЭБ посыпьте их по каплям с плотностью примерно 2-3 ЭБ на квадратный сантиметр в покрытые оболочкой блюда, содержащие 10 мл NIM. Аккуратно встряхните посуду, равномерно распределите ЭБ и поместите их в инкубатор не менее чем на 24 часа.Используйте вольфрамовую иглу или иглу со шприцем 1 мл для механического отсоединения морфологически идентифицируемых зрительных везикул вместе с соседним пигментным эпителием сетчатки на 28-35 день. Культививику их в подвезии. Поместите 50-60 зрительных везикул в каждую 100-миллиметровую чашку для культивации с низким прикреплением, содержащую 15 мл РДМ для образования органоидов сетчатки.Меняйте среду каждые 2-3 дня до 42-го дня. Чтобы инициировать дифференциацию сетчатки, hPSC были диссоциированы на небольшие сгустки и культивированы в суспензии, которая образовывала ЭБ с 1-го дня. На 5-й день ЭБ были нанесены на посуду для культуры, покрытую ECM, и клетки постепенно мигрировали из ЭБ.На 16-й день индукционная среда была заменена RDM, в результате чего нейронные домены сетчатки формировались и постепенно выступали из чашки, а также клеточно-образующие оптические езиклеподобные структуры, окруженные клетками RPE. В течение дней с 28 по 35 органоиды сетчатки, состоящие из нервной сетчатки, прикреплены к сфере RPE. С одной стороны образовались клетки.По мере того, как дифференциация и спецификация сетчатки прогрессировали, hPSCs производили подтипы нейронной сетчатки, которые постепенно выстраивались в слои, имитируя архитектурные особенности нативной сетчатки человека. Ганглиоциты сетчатки были впервые получены из прародителей сетчатки и накоплены на базальной стороне нервной сетчатки. С помощью этого протокола органоиды сетчатки развились в высокозрелые фоторецепторы с богатыми палочками и колбочками.Фоторецепторные клетки были расположены в апикальной стороне, в то время как амакриновые клетки, горизонтальные клетки, биполярные клетки и глиальные клетки Мюллера были расположены в промежуточном слое нервной сетчатки. Ключевыми моментами этого протокола являются создание высокого качества Ebs и засев их при правильной плотности.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

Упрощенная Техника<em&gt; В месте</em&gt; Удаление роговицы и сетчатки Evisceration ткани человека глобус Глазные

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Выделение, характеристика и сравнительный Дифференциация по правам зубных стволовых клеток, полученных из целлюлозы постоянных зубов с помощью двух различных методов

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Транскриптомных анализ человеческой сетчатки Хирургические образцы Использование Журнала

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Обогащение химиорезистентных рака яичников стволовых клеток из человеческих клеточных линиях

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Изучение рака поджелудочной железы стволовых клеток Характеристики для разработки новых стратегий лечения

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Количественный Fundus автофлюоресценции для оценки заболеваний сетчатки

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Острый сетчатке Модель для оценки крови сетчатке Барьерные нарушения и потенциальных лекарственных препаратов для лечения

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Форсколин-индуцированной Отек в кишечном органоидов:<em&gt; In Vitro</em&gt; Анализ для оценки ответа на наркотики в больных муковисцидозом

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

Использование сетчатки изображений для изучения деменция

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Индукция и анализ окислительного стресса в транспозонно-трансфектированных пигментных эпителиальных клетках сетчатки человека

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...