Name: retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Denna studie stöddes av National Key R&D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), Science & Technology Project of Guangdong Province (2017B020230003), Natural Science Foundation (NSF) i Kina (81570874, 81970842), Hundra talangprogram av Sun Yat-sen University (PT1001010) och fundamentala forskningsfonderna för statens nyckellaboratorium för oftalmologi.

1. Kultur och utvidgning av hPSCs
<ol><li>HPSC-kultur
	<ol>
<li>Täck två brunnar av en 6-brunnsplatta med extracellulär matris (ECM, hESC-kvalificerad matris). Bered 50 ml ECM-lösning som innehåller 8-12 μg/ml ECM i Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM). Tillsätt 1 ml av den tinade ECM-stamlösningen (50x) i 49 ml DMEM. Tillsätt 1 ml ECM-lösning till varje brunn på en 6-brunnsplatta. Inkubera den i 1 timme i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2.</li>
		<li>Förbered hPSC-underhå...

<ol>
	<li>Flaxman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+causes+of+blindness+and+distance+vision+impairment+1990-2020:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells:+From+clinical+trial+in+a+dish+to+precision+medicine.">Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine.</a> Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Brooks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+retinal+organoid+differentiation+by+modulating+signaling+pathways+revealed+by+comparative+transcriptome+analyses+with+development+in+vivo.">Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo.</a> Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).</li><li>Zerti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+simple+method+to+enhance+the+generation+of+cone+and+rod+photoreceptors+in+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids.">Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).</li><li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse,+monkey+and+human+embryonic+stem+cells.">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), (2018).</li><li>Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+photoreceptors+restores+some+visual+function+in+Crx-deficient+mice.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Therapy+for+Retinal+Diseases.">Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases.</a> Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+organoids:+a+window+into+human+retinal+development.">Retinal organoids: a window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), (2020).</li><li>Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+axis+specification+occur+in+parallel+during+optic+cup+and+optic+fissure+formation,+differentially+modulated+by+BMP+and+Wnt.">Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt.</a> Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).</li><li>Patel, A., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+pathways+in+optic+fissure+closure.">Genes and pathways in optic fissure closure.</a> Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).</li><li>Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+Ggap:+Mechanisms+of+epithelial+fusion+during+optic+fissure+closure.">Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+retinal+organoids+with+mature+rods+and+cones+from+urine-derived+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+RPE+spheroids+facilitates+enrichment+and+expansion+of+hiPSC-derived+RPE+generated+on+retinal+organoid+induction+platform.">Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+induced+pluripotent+stem+cells+and+retinal+organoids+from+a+leber's+congenital+amaurosis+patient+with+novel+RPE65+mutations.">Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).</li><li>Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+platform+for+personalized+and+precision+cardiovascular+medicine.">Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine.</a> Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3d+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li><li>Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+retinal+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).</li><li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue.">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communication. 6, 6286 (2015).</li><li>da Silva, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+expression+and+degradation+of+retinoic+acid+are+required+for+patterning+a+high-acuity+area+in+the+retina.">Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina.</a> Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).</li><li>Mitchell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+regulates+differential+expression+of+the+tandemly-duplicated+long+wavelength-sensitive+cone+opsin+genes+in+zebrafish.">Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).</li><li>Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+photoreceptor-generating+retinal+progenitors+revealed+by+prolonged+retinoic+acid+exposure.">Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure.</a> BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).</li><li>Eldred, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+specifies+cone+subtypes+in+human+retinal+organoids.">Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids.</a> Science. 362 (6411), (2018).</li><li>Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+in+retinal+development,+survival,+and+disease.">Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease.</a> Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).</li><li>Brzezinski, J. A., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+cell+fate+specification+in+vertebrates.">Photoreceptor cell fate specification in vertebrates.</a> Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+transcriptome+profiling,+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids.">Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li><li>Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+adhesion-dependent+cell+survival+and+ROCK-regulated+actomyosin-driven+forces+mediate+self-formation+of+a+retinal+organoid.">Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid.</a> Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).</li><li>Carcamo-Orive, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transcriptional+variability+in+a+large+human+ipsc+library+reveals+genetic+and+non-genetic+determinants+of+heterogeneity.">Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).</li><li>DeBoever, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+reveals+the+influence+of+genetic+variation+on+gene+expression+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).</li></ol>

I detta flerstegs retinal induktion protokoll, hPSCs guidades steg för steg för att få näthinnan ödet och självorganiserade i retinal organoider som innehåller laminerade NR och RPE. Under differentiering, hPSCs recapitulated alla större steg av mänskliga retinal utveckling in vivo, från EF, OV och RPE, till retinal laminering, generera alla subtyper av retinal celler, inklusive retinal ganglion celler, amacrine celler, bipolära celler, stav och kon fotoreceptorer och muller gliaceller i en rumslig oc...

Retinala degenerativa sjukdomar (RDs), såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) och retinitis pigmentosa (RP), kännetecknas av dysfunktion och död av fotoreceptorceller och leder vanligtvis till irreversibel synförlust utan effektiva sätt att bota1. Mekanismen bakom dessa sjukdomar är till stor del okänd delvis på grund av brist på mänskliga sjukdomar modeller2. Under de senaste decennierna har betydande framsteg gjorts inom regenerativ medicin genom stamcellsteknik. Många forskare, inklusive oss själva, har visat att mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs), inklusive mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), kan differentiera i alla typer av näthinneceller, även mini-retinal vävnader genom olika differentieringsmetoder3,4,5,6,7,8,9,10, 11, vilket ger stor potential i sjukdomsmodellering och cellterapi12,13,14.
Induktionsprocessen från hPSCs till näthinneceller är dock mycket komplicerad och tidskrävande med låg repeterbarhet, vilket kräver forskare med rik erfarenhet och hög kompetens. Under den komplexa och dynamiska induktionsprocessen kommer ett antal faktorer att påverka utbytet av näthinnevävnader15,16,17. Dessutom varierar olika induktionsmetoder ofta avsevärt i timing och robust uttryck för näthinnemarkörer, vilket kan förvirra provinsamlingen och datatolkningen3. Därför skulle ett enkelt protokoll om näthinnediimering från hPSCs med steg-för-steg-vägledning vara efterfrågat.
Här, baserat på våra publicerade studier18,19,20,21, beskrivs ett optimerat retinalinduktionsprotokoll för att generera retinalorganoider (ROs) med rika konfotoreceptorer från hPSCs, vilket inte kräver tillägg av retinsyra (RA). Detta protokoll fokuserar på beskrivningen av metoden i flera steg för att generera neural näthinna och RPE. EB-bildandet är den viktigaste delen av det tidiga induktionsstadiet. Både storleken och pläteringstätheten för EBs är kvantitativt optimerade, vilket vetenskapligt förbättrar utbytet av näthinnevävnader och främjar repeterbarhet. I den andra delen av induktionen organiserar optiska blåsor (OVs) själv i följsamhetskulturen och ROs bildas i suspensionskulturen; Tidskurserna och effektivitetsvinsterna i denna del varierar avsevärt i olika hPSC-linjer. Mognad och specifikation av näthinneceller i ROs förekommer huvudsakligen i mitten och sent skede av induktion. Utan tillägg av RA kan mogna fotoreceptorer med både rika koner och stavar produceras.
Syftet med detta protokoll är att kvantitativt beskriva och beskriva varje steg för oerfarna forskare att upprepa. Olika hPSC linjer har framgångsrikt inducerats till ROs genom detta protokoll med en robust avkastning av kon-rika näthinnan vävnader och hög repeterbarhet. HPSCs-härledda ROs med detta protokoll kan rekapitulera de viktigaste stegen för retinal utveckling in vivo, och överleva långsiktiga, vilket underlättar nedströms applikationer, såsom sjukdom modellering, läkemedelsscreening, och cellterapi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#8722;)-Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560-5mg</td>
			<td>ROCK-inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml tips</td>
			<td>Kirgen</td>
			<td>KG1313</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>3141001</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCD000100</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Tissue culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>313000</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells tissue culture plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AP2&#945; Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>3b5</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ISL1 Antibody</td>
			<td>Boster</td>
			<td>BM4446</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-L/M opsin Antibody</td>
			<td>gift from Dr. jeremy</td>
			<td>/</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>pax6</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Recoverin Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab5585</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rhodopsin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5417</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sheep 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21436</td>
			<td>Donkey anti-Sheep IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX9 Antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>A19710</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VSX2 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab9016</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement W/O VIT A (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube vial</td>
			<td>Thermo scientific-NUNC</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>D532</td>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole 
			dihydrochloride; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM /F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5 M PH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>NATOCOR</td>
			<td>SFBE</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>0.22&#956;m, sterile Millex filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td>2 mg/ml in PBS to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>MEM NEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEM CELL</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSCs maintenance medium (MM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer</td>
			<td>GNM</td>
			<td>GNM10010</td>
			<td>Without Ca+,Mg+,PH7.2&#177;0.1 0.1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3262-20EA</td>
			<td>Petri dish</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells

Retinal degenerativa sjukdomar är de främsta orsakerna till irreversibel blindhet utan effektiv behandling. Pluripotenta stamceller som har potential att differentiera sig i alla typer av näthinneceller, även mini-retinal vävnader, håller enorma löften för patienter med dessa sjukdomar och många möjligheter i sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening. Induktionsprocessen från hPSCs till näthinneceller är dock komplicerad och tidskrävande. Här beskriver vi ett optimerat retinal induktionsprotokoll för att generera retinal vävnader med hög reproducerbarhet och effektivitet, lämplig för olika mänskliga pluripotenta stamceller. Detta protokoll utförs utan tillsats av retinsyra, vilket gynnar anrikning av konfotoreceptorer. Fördelen med detta protokoll är kvantifieringen av EB:s storlek och pläteringstäthet för att avsevärt öka effektiviteten och repeterbarheten hos näthinneinduktion. Med denna metod visas alla större näthinneceller sekventiellt och rekapitulera de viktigaste stegen för näthinneutveckling. Det kommer att underlätta nedströmsapplikationer, såsom sjukdomsmodellering och cellterapi.

Retinal induktionsprocessen i detta protokoll efterliknar utvecklingen av mänskliga fetala näthinnan. För att initiera retinal differentiering, hPSCs var dissociated i små klumpar och odlas i suspension för att inducera bildandet av EBs. På D1 bildades de uniformerade cellaggregaten eller EB:erna (figur 1C). Kulturmediet övergick gradvis till NIM. På D5 pläterades EBs på ecm-belagda kulturrätter. Celler migrerade gradvis ut ur de europeiska centralbankerna (fi...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Här beskriver vi ett optimerat retinal organoid induktionssystem, som är lämpligt för olika mänskliga pluripotenta stamcellslinjer för att generera retinal vävnader med hög reproducerbarhet och effektivitet.

Retinal organoid induktionssystem för härledning av 3D retinal vävnader från mänskliga pluripotenta stamceller

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Induktionsprocessen från hPSCs till näthinneceller är komplicerad och tidskrävande. Detta optimerade protokoll kan generera näthinnevävnader med hög reproducerbarhet och utan kostnad. Fördelen med detta protokoll är kvantifieringen av EB:s storlek och pläteringstäthet för att avsevärt öka effektiviteten och repeterbarheten hos retinal induktion från hPSCs.Med denna metod visas alla större näthinneceller sekventiellt och rekapitulera de viktigaste stegen för näthinneutveckling. Det kommer att underlätta sjukdomsmodellering och cellterapi för retinala degenerativa sjukdomar. Vi demonstrerar proceduren, vi är med Yuanyuan Guan, en doktorand, och Bingbing Xie, en tekniker från laboratoriet.Börja med att förbereda 50 ml ECM-lösning genom att tillsätta 1 ml av den tredje 50 gånger lagerlösningen till 50 ml DMEM. Tillsätt sedan 1 ml av denna beredda ECM-lösning till varje brunn på en sexbrunnsplatta och inkubera den i en timme vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Förbered hPSC-underhållsmediet enligt tillverkarens instruktion och förvärm det till rumstemperatur i 30 minuter.Häll en kryogen injektionsflaska med hPSCs från en flytande kvävetank genom att inkubera den i ett vattenbad vid 37 grader Celsius i 30 sekunder. Desinficera den försiktigt med en 75%alkoholspray och lägg den i ett biosäkerhetsskåp. Överför cellupphängningen från injektionsflaskan till ett 15 millimeters rör.Tillsätt sedan 5 ml förvärmt underhållsmedium droppe för droppe till röret med en 5 ml pipett, samtidigt som du försiktigt skakar röret för att blanda hPSCs. Centrifugera röret vid 170 gånger G i fem minuter. Ta försiktigt bort det mesta av supernatanten med en 1 ml pipett och lämna kvar cirka 50 mikroliter supernatant för att undvika att förlora cellerna.Häng upp pelleten igen med 1 ml underhållsmedium genom att leda upp och ner. Ta bort ECM från de förbelagda brunnarna och tillsätt 1,5 milliliter underhållsmedium till varje brunn. Fördela sedan 0,5 milliliter cellfjädring i varje brunn.Skaka försiktigt plattan för att fördela hPSCs jämnt. Lägg plattan i en inkubator på 37 grader Celsius och 5% koldioxid i minst 24 timmar för att främja cellens vidhäftning. Byt medium varje dag och passage hPSCs vid 80% sammanflöde.På dag-0, initiera differentiering genom att ta bort 80%konfluenscellerna från en brunn av sex-brunnsplattan. Samla cellerna med EDTA dissociation lösning som beskrivs i textmanuskriptet. Ta bort EDTA-lösningen och tillsätt 1 ml underhållsmedium som innehåller 10 mikromolekylär fluvastatin för att stoppa celldisorienteringen.Samla cellerna med en 1 ml pipett. Överför cellfjädringen till en 100 millimeters ultralåga petriskål och tillsätt 9 ml underhållsmedium som innehåller 10 mikromolär fluvastatin i skålen. Skaka försiktigt skålen två gånger för att fördela cellerna jämnt.Lägg den sedan i inkubatorn vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. När cellerna har odlats i minst 24 timmar, observera dem under mikroskopet. Tillsätt 9 ml underhållsmedium och 3 ml NIM till ett 15 ml-rör.Överför cellkulturerna till ett 15 ml centrifugeringsrör och tillsätt 10 ml av den förvärmda NIM-blandningen till skålen. Centrifugera röret vid 60 gånger G i 3 minuter för att samla in aggregaten. Ta sedan bort supernatanten med en 5 ml pipett och lämna kvar cirka 500 mikroliter för att undvika att förlora celler.Tillsätt 2 ml av blandningen i röret och överför suspensionen tillbaka till samma Petri-skål. Skaka försiktigt skålen för att fördela cellaggregaten jämnt. Lägg sedan tillbaka skålen i inkubatorn.På dag-5, ta bort ECM från de förbelagda rätterna och tillsätt 10 ml förvärmd NIM till varje maträtt. Ta ut skålen som innehåller Ebs och kontrollera kvaliteten på EBs under mikroskopet och se till att de är ljusa och runda. Samla alla EBs i ett 15 ml rör och låt dem bosätta sig i 5 minuter.Ta sedan bort det mesta av supernaten och lämna kvar ca 2 ml medium. Efter att ha räknat EBs, så dem drop-by-drop med en densitet på cirka 2-3 EBs per kvadratcentimeter till belagda rätter som innehåller 10 ml NIM. Skaka försiktigt disken för att fördela EBs jämnt och lägg dem i inkubatorn i minst 24 timmar.Använd en volframnål eller en nål med en 1 ml spruta för att mekaniskt lossa de morfologiskt identifierbara optiska blåsorna, tillsammans med det intilliggande näthinnepigmentepiteliteln dag 28 till 35. Odla dem i suspension. Sätt 50-60 optiska blåsor i varje 100 millimeter låg fastsättningskulturrätt, som innehåller 15 ml RDM för retinal organoidbildning.Byt medium varannan till var tredje dag fram till dag-42. För att initiera retinal differentiering, hPSCs var dissociated i små klumpar och odlas i suspension, som bildade EBs sedan dag-1. På dag-5 pläterades EBs på ecm-belagda kulturrätter och cellerna migrerade gradvis ut ur EBs.På dag-16 ersattes induktionsmediet av RDM, vilket fick neurala näthinnan domäner att bildas och gradvis sticka ut från skålen, liksom cellbildande optiska vesikelliknande strukturer omgiven av RPE-celler. Under dagarna-28 till 35, retinal organoider bestående av neurala näthinnan, fäst vid en RPE sfär. På ena sidan bildades celler.När retinal differentiering och specifikation utvecklats, hPSCs producerade subtyper av neurala näthinnan som gradvis radade upp i lager, härma de arkitektoniska funktionerna i en infödd mänsklig näthinnan. Retinal ganglion celler genererades först från retinal stamceller och ackumuleras i basal sidan av neuro näthinnan. Med detta protokoll utvecklades retinal organoider till mycket mogna fotoreceptorer med både rika stavar och koner.Photoreceptor celler var belägna i den apokala sidan, medan amacrine celler, horisontella celler, bipolära celler och muller gliaceller var alla belägna i mellanskiktet av neurala näthinnan. De viktigaste punkterna i detta protokoll är att skapa hög kvalitet på Ebs och så dem med rätt densitet.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

En förenklad Teknik för<em&gt; In situ</em&gt; Excision av hornhinna och urtagning av retinal Vävnad från Human Ocular Globe

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolering, karakterisering och jämförande differentiering av mänskliga Dental celler Pulp Stem Härstammar från permanenta tänder med hjälp av två olika metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Transcriptomic Analys av mänskliga Retinal Kirurgiska prover med tidning

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Anrikning för kemoterapiresistent Ovarian cancerstamceller från humana cellinjer

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studera bukspottkörtelcancer Stem Cell egenskaper för att utveckla nya behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Kvantitativ Fundus autofluorescens för utvärdering av retinala sjukdomar

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

En akut retinal modell för utvärdering Blood Retinal Barrier överträdelse och potentiella läkemedel för behandling

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolininducerad Svullnad i Intestinal Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Analys av Läkemedels svar i patienter med cystisk fibros

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

Med hjälp av Retinal Imaging att studera demens

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induktion och analys av oxidativ stress i Törnrosa Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epitelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...