Name: retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2016YFC110103, 2017YFA0104101), Guangzhou Bilim ve Teknoloji Proje Fonu (201803010078), Guangdong Eyaleti Bilim ve Teknoloji Projesi (2017B02020230003), Çin Doğa Bilimleri Vakfı (NSF) (81570874, 81970842), Sun Yat-sen Üniversitesi'nin (PT1001010) Yüz yetenek programı ve Oftalmoloji Devlet Anahtar Laboratuvarı Temel Araştırma Fonları.

1. HPSC'lerin kültürü ve genişlemesi
<ol><li>HPSC kültürü
	<ol>
<li>Hücre dışı matris (ECM, hESC nitelikli matris) ile 6 kuyulu bir plakanın iki kuyusunu kapleyin. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası'nda (DMEM) 8-12 μg/mL ECM içeren bir ECM çözümünün 50 mL'sini hazırlayın. 49 mL DMEM'de, çözülmüş ECM stok çözeltisinin 1 mL'si (50x) ekleyin. 6 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 1 mL ECM çözeltisi ekleyin. 37 °C ve %5 CO2'debir inkübatörde 1 saat kuluçkaya yat...

<ol>
	<li>Flaxman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+causes+of+blindness+and+distance+vision+impairment+1990-2020:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells:+From+clinical+trial+in+a+dish+to+precision+medicine.">Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine.</a> Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Brooks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+retinal+organoid+differentiation+by+modulating+signaling+pathways+revealed+by+comparative+transcriptome+analyses+with+development+in+vivo.">Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo.</a> Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).</li><li>Zerti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+simple+method+to+enhance+the+generation+of+cone+and+rod+photoreceptors+in+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids.">Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).</li><li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse,+monkey+and+human+embryonic+stem+cells.">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), (2018).</li><li>Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+photoreceptors+restores+some+visual+function+in+Crx-deficient+mice.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Therapy+for+Retinal+Diseases.">Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases.</a> Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+organoids:+a+window+into+human+retinal+development.">Retinal organoids: a window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), (2020).</li><li>Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+axis+specification+occur+in+parallel+during+optic+cup+and+optic+fissure+formation,+differentially+modulated+by+BMP+and+Wnt.">Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt.</a> Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).</li><li>Patel, A., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+pathways+in+optic+fissure+closure.">Genes and pathways in optic fissure closure.</a> Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).</li><li>Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+Ggap:+Mechanisms+of+epithelial+fusion+during+optic+fissure+closure.">Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+retinal+organoids+with+mature+rods+and+cones+from+urine-derived+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+RPE+spheroids+facilitates+enrichment+and+expansion+of+hiPSC-derived+RPE+generated+on+retinal+organoid+induction+platform.">Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+induced+pluripotent+stem+cells+and+retinal+organoids+from+a+leber's+congenital+amaurosis+patient+with+novel+RPE65+mutations.">Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).</li><li>Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+platform+for+personalized+and+precision+cardiovascular+medicine.">Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine.</a> Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3d+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li><li>Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+retinal+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).</li><li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue.">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communication. 6, 6286 (2015).</li><li>da Silva, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+expression+and+degradation+of+retinoic+acid+are+required+for+patterning+a+high-acuity+area+in+the+retina.">Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina.</a> Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).</li><li>Mitchell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+regulates+differential+expression+of+the+tandemly-duplicated+long+wavelength-sensitive+cone+opsin+genes+in+zebrafish.">Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).</li><li>Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+photoreceptor-generating+retinal+progenitors+revealed+by+prolonged+retinoic+acid+exposure.">Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure.</a> BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).</li><li>Eldred, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+specifies+cone+subtypes+in+human+retinal+organoids.">Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids.</a> Science. 362 (6411), (2018).</li><li>Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+signaling+in+retinal+development,+survival,+and+disease.">Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease.</a> Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).</li><li>Brzezinski, J. A., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+cell+fate+specification+in+vertebrates.">Photoreceptor cell fate specification in vertebrates.</a> Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+transcriptome+profiling,+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids.">Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li><li>Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+adhesion-dependent+cell+survival+and+ROCK-regulated+actomyosin-driven+forces+mediate+self-formation+of+a+retinal+organoid.">Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid.</a> Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).</li><li>Carcamo-Orive, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transcriptional+variability+in+a+large+human+ipsc+library+reveals+genetic+and+non-genetic+determinants+of+heterogeneity.">Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).</li><li>DeBoever, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+profiling+reveals+the+influence+of+genetic+variation+on+gene+expression+in+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).</li></ol>

Bu çok adımlı retina indüksiyon protokolünde, hPSC'ler retina kaderini kazanmak için adım adım yönlendirildi ve lamine NR ve RPE içeren retina organoidleri halinde kendi kendine organize edildi. Farklılaşma sırasında, hPSC'ler,ef, OV ve RPE'den retina laminasyonuna kadar insan retina gelişiminin tüm önemli adımlarını yeniden bir araya getiren, retina ganglion hücreleri, amakrin hücreleri, bipolar hücreler, çubuk ve koni fotoreceptörleri ve muller glial hücreler de dahil olmak üzere ret...

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve retinitis pigmentosa (RP) gibi retina dejeneratif hastalıklar (RD), fotoreceptör hücrelerinin işlev bozukluğu ve ölümü ile karakterizedir ve tipik olarak tedavi etmenin etkili yolları olmadan geri dönüşü olmayan görme kaybına yol açar1. Bu hastalıkların altında kalan mekanizma, insan hastalığı modellerinin eksikliği nedeniyle kısmen bilinmemektedir2. Son on yılda kök hücre teknolojisi ile rejeneratif tıpta önemli ilerlemeler kaydedildi. Biz de dahil olmak üzere birçok araştırmacı, insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler) dahil olmak üzere insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler), çeşitli farklılaşma yaklaşımları3 , 4 ,5,6,7,8,9,10, 11, hastalık modelleme ve hücre tedavisi büyük potansiyel sağlayan12,13,14.
Bununla birlikte, hPSC'lerden retina hücrelerine kadar indüksiyon süreci, zengin deneyime ve yüksek becerilere sahip araştırmacılar gerektiren düşük tekrarlanabilirlik ile oldukça karmaşık ve zaman alıcıdır. Karmaşık ve dinamik indüksiyon işlemi sırasında, bir dizi faktör retina dokularının verimini etkileyecektir15,16,17. Ayrıca, farklı indüksiyon yöntemleri genellikle retina işaretleyicilerinin zamanlaması ve sağlam ifadesi açısından önemli ölçüde değişir, bu da örnek toplama ve veri yorumlamayı şaşırtabilir3. Bu nedenle, adım adım rehberlik ile hPSC'lerden retina farklılaşması için basit bir protokol talep edilecektir.
Burada, yayınlanan çalışmalarımıza dayanarak18,19,20,21 , hPSC'lerden zengin koni fotoreseptörleri ile retinal organoidler (ROs) oluşturmak için optimize edilmiş bir retina indüksiyon protokolü tanımlanmıştır, bu da retinoik asit (RA) takviyesi gerektirmez. Bu protokol, nöral retina ve RPE oluşturmak için çok adımlı yöntemin açıklamasına odaklanır. EB oluşumu erken indüksiyon aşamasının önemli bir parçasıdır. EBs'nin hem boyutu hem de kaplama yoğunluğu, retina dokularının verimini bilimsel olarak artıran ve tekrarlanabilirliği teşvik eden nicel olarak optimize edilmiştir. İndüksiyonun ikinci bölümünde, optik veziklinler (OV'ler) yapışma kültüründe kendi kendine organize olur ve süspansiyon kültüründe ROs formu; bu kısmın zaman kursları ve verimlilikleri farklı hPSC hatlarında önemli ölçüde farklılık gösterir. RO'lardaki retina hücrelerinin olgunlaşması ve spesifikasyonu esas olarak indüksiyonun orta ve geç aşamasında ortaya çıkar. RA ilavesi olmadan, hem zengin konilere hem de çubuklara sahip olgun fotoreceptörler üretilebilir.
Bu protokolün amacı, deneyimsiz araştırmacıların tekrar etmesi için her adımı nicel olarak tanımlamak ve detaylandırmaktır. Koni bakımından zengin retina dokularının sağlam verimi ve yüksek tekrarlanabilirlik ile çeşitli hPSC hatları bu protokol ile ROs'a başarıyla indüklenmiştir. Bu protokole sahip HPSC'lerden türetilmiş RO'lar, retinagelişiminin ana adımlarını in vivo olarak yeniden özetleyebilir ve hastalık modelleme, ilaç taraması ve hücre tedavisi gibi aşağı akış uygulamalarını kolaylaştıran uzun süreli hayatta kalabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(&#8722;)-Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0560-5mg</td>
			<td>ROCK-inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml tips</td>
			<td>Kirgen</td>
			<td>KG1313</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>3141001</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCD000100</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue culture</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>100 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Tissue culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml pipette</td>
			<td>Sorfa</td>
			<td>313000</td>
			<td>Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge tubes</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells tissue culture plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-AP2&#945; Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>3b5</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ISL1 Antibody</td>
			<td>Boster</td>
			<td>BM4446</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-L/M opsin Antibody</td>
			<td>gift from Dr. jeremy</td>
			<td>/</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>pax6</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Recoverin Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab5585</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rhodopsin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5417</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sheep 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21436</td>
			<td>Donkey anti-Sheep IgG (H+L) 
			Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX9 Antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>A19710</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VSX2 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab9016</td>
			<td>Primary&#160;antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement W/O VIT A (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube vial</td>
			<td>Thermo scientific-NUNC</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>D532</td>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-phenylindole 
			dihydrochloride; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM /F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11330500BT</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5 M PH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>NATOCOR</td>
			<td>SFBE</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>0.22&#956;m, sterile Millex filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td>2 mg/ml in PBS to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>MEM NEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEM CELL</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSCs maintenance medium (MM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) buffer</td>
			<td>GNM</td>
			<td>GNM10010</td>
			<td>Without Ca+,Mg+,PH7.2&#177;0.1 0.1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td>Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3262-20EA</td>
			<td>Petri dish</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal organoid induction system for derivation of 3d retinal tissues from human pluripotent stem cells

Retina dejeneratif hastalıklar etkili bir tedavi olmadan geri dönüşü olmayan körlüğün başlıca nedenleridir. Her türlü retina hücresine, hatta mini retina dokularına farklılaşma potansiyeline sahip pluripotent kök hücreler, bu hastalıklara sahip hastalar ve hastalık modelleme ve ilaç taramasında birçok fırsat için büyük vaatlerde bulunmaktadır. Bununla birlikte, hPSC'lerden retina hücrelerine indüksiyon süreci karmaşık ve zaman alıcıdır. Burada, çeşitli insan pluripotent kök hücreleri için uygun, yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilik ile retina dokuları oluşturmak için optimize edilmiş bir retina indüksiyon protokolünü açıklıyoruz. Bu protokol, koni fotoreceptörlerinin zenginleştirilmesine fayda sağlayan retinoik asit eklenmeden gerçekleştirilir. Bu protokolün avantajı, retina indüksiyonunun verimliliğini ve tekrarlanabilirliğini önemli ölçüde artırmak için EB boyutunun ve kaplama yoğunluğunun ölçülmesidir. Bu yöntemle, tüm ana retina hücreleri ardışık olarak ortaya çıkar ve retina gelişiminin ana adımlarını yeniden oluşturur. Hastalık modellemesi ve hücre tedavisi gibi aşağı akış uygulamalarını kolaylaştıracaktır.

Bu protokoldeki retina indüksiyon süreci insan fetal retina gelişimini taklit eder. Retina farklılığını başlatmak için, hPSC'ler küçük kümelere ayrıştırıldı ve EBs oluşumunu teşvik etmek için süspansiyonda kültürlendi. D1'de, tekdüze hücre toplamları veya EBs oluştu (Şekil 1C). Kültür ortamı yavaş yavaş NIM'ye geçirildi. D5'te, EBs ECM kaplı kültür yemeklerine kaplandı. Hücreler yavaş yavaş EBs dışına taşındı (Şekil 1D</s...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Burada, çeşitli insan pluripotent kök hücre hatlarının yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle retina dokuları üretmesi için uygun olan optimize edilmiş bir retinal organoid indüksiyon sistemini açıklıyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden 3D Retinal Dokuların Türetilmesi için Retinal Organoid İndüksiyon Sistemi

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

HPSC'lerden retina hücrelerine kadar indüksiyon süreci karmaşık ve zaman alıcıdır. Bu optimize edilmiş protokol, yüksek tekrarlanabilirlik ve maliyet olmadan retina dokuları üretebilir. Bu protokolün avantajı, hPSC'lerden retina indüksiyonunun verimliliğini ve tekrarlanabilirliğini önemli ölçüde artırmak için EB boyutunun ve kaplama yoğunluğunun ölçülmesidir.Bu yöntemle, tüm ana retina hücreleri ardışık olarak ortaya çıkar ve retina gelişiminin ana adımlarını yeniden oluşturur. Retina dejeneratif hastalıklar için hastalık modellemesini ve hücre tedavisini kolaylaştıracaktır. Prosedürü gösteren, bir doktora öğrencisi olan Yuanyuan Guan ve laboratuvardan bir teknisyen olan Bingbing Xie ile birlikteyiz.50 mL DMEM'e üçüncü 50 kat stok çözümünün 1 mL'sini ekleyerek 50 mL ECM çözümü hazırlayarak başlayın. Ardından, altı kuyulu bir plakanın her kuyusuna hazırlanan bu ECM çözeltisinin 1 mL'sini ekleyin ve 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte bir saat kuluçkaya yatırın. HPSC bakım ortamını üreticinin talimatına göre hazırlayın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığına önceden uzadı.Sıvı nitrojen tankından kriyojenik bir hPSC şişesini 30 saniye boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosunda kuluçkaya yatırarak dökün. % 75 alkol spreyi kullanarak dikkatlice dezenfekte edin ve bir biyo-güvenlik kabinine koyun. Hücre süspansiyonu şişeden 15 milimetrelik bir tüpe aktarın.Ardından, hPSC'leri karıştırmak için tüpü hafifçe sallarken, 5 mL pipet kullanarak tüpe 5 mL önceden ısıtılmış bakım ortamı damla damla ekleyin. Tüpü beş dakika boyunca 170 kez G'de santrifüjleyin. Hücreleri kaybetmemek için yaklaşık 50 mikrolitre süpernatant bırakarak, 1 mL pipet kullanarak süpernatantın çoğunu dikkatlice çıkarın.Peletin yukarı ve aşağı borulanarak 1 mL bakım ortamı ile yeniden askıya alın. ECM'yi önceden kaplanmış kuyulardan çıkarın ve her kuyuya 1,5 mililitre bakım ortamı ekleyin. Daha sonra her kuyuya 0,5 mililitre hücre süspansiyonu dağıtın.HPSC'leri düzgün bir şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın. Hücre yapışmasını teşvik etmek için plakayı en az 24 saat boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte bir inkübatöre koyun. Her gün ortam değiştirin ve HPSC'leri %80 izdihamda değiştirin.Gün-0'da, altı kuyulu plakanın bir kuyusundan% 80'lik izdiham hücrelerini çıkararak farklılaşmayı başlatın. Metin el yazmasında açıklandığı gibi EDTA ayrışma çözümü ile hücreleri toplayın. EDTA çözeltisini çıkarın ve hücre ayrışmasını durdurmak için 10 mikromoler fluvastatin içeren 1 mL bakım ortamı ekleyin.Hücreleri 1 mL pipetle toplayın. Hücre süspansiyonunu 100 milimetre ultra düşük takılı petri kabına aktarın ve kabın içine 10 mikromoler fluvastatin içeren 9 mL bakım ortamı ekleyin. Hücreleri düzgün bir şekilde dağıtmak için yemeği iki kez hafifçe sallayın.Daha sonra, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübatöre koyun. Hücreler en az 24 saat kültüre edildikten sonra mikroskop altında gözlemleyin. 15 mL'lik bir boruya 9 mL bakım ortamı ve 3 mL NIM ekleyin.Hücre kültürlerini 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve önceden ısıtılmış NIM karışımından 10 mL'yi yemeğe ekleyin. Agregaları toplamak için tüpü 3 dakika boyunca 60 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra 5 mL pipet kullanarak süpernatantı çıkarın ve hücreleri kaybetmemek için yaklaşık 500 mikrolitre bırakın.Karışımın 2 mL'lik kısmını tüpe ekleyin ve süspansiyonu aynı Petri kabına geri aktarın. Hücre agregalarını düzgün bir şekilde dağıtmak için tabağı hafifçe sallayın. Sonra, tabağı inkübatöre geri koyun.5. Günde, ECM'yi önceden kaplanmış tabaklardan çıkarın ve her yemeğe önceden ısıtılmış 10 mL NIM ekleyin. Ebs içeren tabağı çıkar ve mikroskop altında ES'lerin kalitesini kontrol ederek parlak ve yuvarlak olduklarından emin olun. Tüm EB'leri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 5 dakika yerleşmelerine izin verin.Ardından, yaklaşık 2 mL orta bırakarak süpernatant çoğunu çıkarın. EB'leri saydıktan sonra, 10 mL NIM içeren kaplamalı yemeklere santimetrekare başına yaklaşık 2-3 EB yoğunluğunda damla damla tohumlayın. EBs'yi düzgün bir şekilde dağıtmak için bulaşıkları hafifçe sallayın ve en az 24 saat boyunca inkübatöre koyun.28 ila 35 gün içinde bitişik retina pigment epitel ile birlikte morfolojik olarak tanımlanabilir optik vezikülleri mekanik olarak ayırmak için bir tungsten iğnesi veya 1 mL şırıngalı bir iğne kullanın. Askıya almada kültür edin. Retinal organoid oluşumu için 15 mL RDM içeren her 100 milimetre düşük bağlanma kültürü kabına 50-60 optik veziklin koyun.Ortamı 42.Güne kadar her 2 ila 3 günde bir değiştirin. Retina farklılığını başlatmak için, hPSC'ler küçük kümelere ayrıştırıldı ve 1. 5. Günde EDB'ler EKM kaplı kültür yemeklerine kaplandı ve hücreler yavaş yavaş EB'lerden göç etti.Gün-16'da, indüksiyon ortamı RDM ile değiştirildi, bu da Nöral retina etki alanlarının oluşmasına ve yavaş yavaş çanaktan çıkıntı yapmasına ve ayrıca RPE hücreleriyle çevrili optik veziklin benzeri yapılar oluşturmasına neden oldu. Günler-28 ila 35 arasında, Nöral retinadan oluşan retina organoidleri, bir RPE küresine bağlanır. Bir tarafta hücreler oluştu.Retina farklılaşması ve spesifikasyonu ilerledikçe, hPSC'ler, yerel bir insan retinasının mimari özelliklerini taklit ederek yavaş yavaş katmanlar halinde sıralanan nöral retina alt tipleri üretti. Retina ganglion hücreleri ilk olarak retina progenitörlerinden üretilmiş ve nöro retinanın bazal tarafında birikmiş. Bu protokolle retinal organoidler hem zengin çubuklar hem de konilerle son derece olgun fotoreceptörlere dönüştü.Fotoreceptör hücreleri apikal tarafta, amakrin hücreler, yatay hücreler, bipolar hücreler ve muller glial hücreler ise nöral retinanın ara tabakasında yer aldı. Bu protokolün temel noktaları, yüksek kalitede Ebs oluşturmak ve bunları doğru yoğunlukta tohumlamaktadır.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

Için Basitleştirilmiş Tekniği<em&gt; Yerinde</emİnsan Oküler Globe gelen Kornea ve Retina Doku Eviserasyon of&gt; eksizyonu

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Journal kullanarak İnsan Retina Cerrahi Örneklerinin transkriptomik Analizi

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

İnsan Hücre Lines Kemorezistans Yumurtalık Kanser Kök Hücreleri Zenginleştirme

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Retina Hastalıkları Değerlendirilmesi Nicel Otofloresans

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Tedavi Kan Retina Bariyer ihlali ve Potansiyel İlaçlar değerlendirilmesi için bir Akut Retina Modeli

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin kaynaklı bağırsak Organoids şişme: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Kistik Fibrozis Hastalarında İlaç Tepki değerlendirilmesi için

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

Demans çalışması için retina Imaging'i kullanma

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Uyuyan Güzel Transposon Transposon Transfected İnsan Retina Pigment Epitel Hücrelerinde Oksidatif Stresin İndüksiyonu ve Analizi

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...